Summary
Qui, presentiamo un protocollo per staccare le cellule endoteliali corneali (CEC) dalla membrana di Descemet (DM) utilizzando un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) come modello di malattia ex vivo per la cherata toropatia (BK).
Abstract
I laser Nd:YAG sono stati utilizzati per eseguire interventi chirurgici intraoculari non invasivi, come la capsulotomia da diversi decenni. L'effetto incisivo si basa sulla rottura ottica al fuoco laser. Vengono generate onde d'urto acustiche e bolle di cavitazione, causando la rottura del tessuto. Le dimensioni delle bolle e le ampiezza di pressione variano a seconda dell'energia dell'impulso e della posizione del punto focale. In questo studio, gli occhi di porcina enucleati sono stati posizionati di fronte a un laser Nd:YAG disponibile in commercio. Sono state testate le energie di impulso variabili e le diverse posizioni dei punti focali posteriori alla cornea. Le lesioni risultanti sono state valutate dalla microscopia a due fotoni e dall'istologia per determinare i migliori parametri per un distacco esclusivo delle cellule endoteliali corneali (CEC) con un danno collaterale minimo. I vantaggi di questo metodo sono l'ablazione precisa della CEC, la riduzione dei danni collaterali e, soprattutto, il trattamento senza contatto.
Introduction
La trasparenza della cornea è essenziale per la trasmissione della luce alla retina e ai suoi fotorecettori1. A questo proposito, uno stato relativo di disidratazione è fondamentale per mantenere le fibre di collagene all'interno dello stroma corneale correttamente allineate. Questa omeostasi è mantenuta da cellule endoteliali corneali (CEC) situate sulla membrana del Descemet (DM)2. L'endotelio è lo strato corneale più interno. Ha un'importante barriera e funzione di pompaggio, che è fondamentale per la trasparenza corneale3. A differenza dell'epitelio, l'endotelio non è in grado di auto-rinnovarsi4. Pertanto, qualsiasi danno cellulare causato da malattie o traumi stimola le cellule endoteliali rimanenti ad ingrandire e migrare, a coprire i difetti risultanti e a mantenere la funzionalità corneale5. Tuttavia, se la densità CEC scende al di sotto di una soglia critica, lo scompenso dell'endotelio porta ad un edema, con conseguente visione e disagio offuscati o anche dolore grave4. Nonostante la disponibilità di farmaci per alleviare i sintomi, attualmente l'unico trattamento definitivo in questi casi è il trapianto di cornea, che può essere eseguito sotto forma di un trapianto endoteliale a tutto spessore o un trapianto endoteliale lamellare. Quest'ultima procedura è disponibile come keratoplastica endoteliale a membrana (DMEK) di Descemet e come keratoplastica endoteliale di Descemet (DSAEK)6. Tuttavia, la protezione della CEC rimanente e il miglioramento della loro sopravvivenza potrebbe essere un obiettivo alternativo, che necessita di un modello di malattia adeguato per testare potenziali farmaci terapeutici.
Gli attuali modelli di malattia da perdita CEC si concentrano sulla distruzione dell'endotelio attraverso l'iniezione di agenti tossici (ad esempio, il cloruro di benzalkonium) nella camera anteriore o per abrasione meccanica delle cellule utilizzando una tecnica di descemetorhexis invasiva7,8. Mentre questi modelli sono ben consolidati, esistono svantaggi come la risposta infiammatoria generale e danni collaterali imprecisi. Pertanto, questi modelli hanno maggiori probabilità di rappresentare le fasi finali della malattia, quando le opzioni chirurgiche di cui sopra sono inevitabili.
Con i progressi nelle strategie di trattamento cellulare come le cellule staminali e la terapia genica, l'applicazione di queste terapie cellulari potrebbe essere utile nelle prime fasi della perdita di CEC9. Successivamente, abbiamo bisogno di un modello che rappresenti queste fasi precedenti della malattia in modo più adeguato. A questo proposito, i modelli di coltura cellulare sono migliorati nell'ultimo decennio, ma sono ancora limitati nella loro validità, in quanto le cellule in vitro non possono avvicinarsi alla replica delle complesse interazioni che si verificano tra i diversi tipi di cellule all'interno della cornea10. Pertanto, i modelli ex vivo e in vivo sono ancora molto richiesti e migliorare quelli esistenti è del massimo interesse.
Chirurgia intraoculare non invasiva da fotodisruption utilizzando un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser è diventato una procedura di routine per oftalmologi in tutto il mondo dalla sua introduzione alla fine del 11 anni11. La fotodisruption si basa sull'assorbimento della luce non lineare che porta alla formazione di plasma, alla generazione di onde acustiche d'urto e alla creazione di bolle di cavitazione, ogni volta che il sito di applicazione si trova in un ambiente liquido12. In generale, questi processi contribuiscono all'effetto previsto di un taglio preciso dei tessuti. Tuttavia, possono anche essere la fonte di danni collaterali non necessari che limitano il confinamento locale della chirurgia laser13.
La previsione degli effetti meccanici risultanti è notevolmente migliorata attraverso la caratterizzazione del corso di propagazione e cavitazione dell'onda d'urto. Il nostro obiettivo è quello di indirizzare la CEC con il minor danno possibile al tessuto circostante per fornire un modello di malattia sperimentale non invasivo assistito dal laser per le prime fasi della perdita di CEC. A questo scopo, è necessario determinare le energie di impulso ottimali e le posizioni dei punti focali del laser.
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Protocol
Tutte le procedure relative al tessuto animale seguono le linee guida del Comitato locale per la cura e l'etica degli animali.
1. Preparazione della coltura degli organi e del trattamento laser
- Ottenere occhi di porcina appena enucleated dal mattatoio locale. Mantenerli freschi (4 gradi centigradi) nel mezzo Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, integrato con L-glutamina, pyruvate di sodio, penicillina/streptomicina (1%), e siero di porcina (10%), d'ora in poi indicato in questo articolo come mezzo pieno.
- Rimuovere i tessuti extracellulari con le forbici e immergere gli occhi in 5% povidone-iodio-iodio soluzione oftalmica per 5 min prima di metterli in salina sterilizzata fosfato buffer (PBS) fino all'uso.
- Occhi dello schermo per le principali patologie del segmento anteriore, come cicatrici corneali, edema e altre opacità con un dispositivo di tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (Tabella dei materiali).
- Posizionare gli occhi davanti a un'unità a lampada a taglio dotata di un laser Nd:YAG (Table of Materials), con una lunghezza d'onda di 1.064 nm e un diametro del punto focale di 10 m in aria.
NOTA: Per un posizionamento ottimale viene utilizzato un apparecchio di tenuta stampato in 3D, progettato per tenere l'occhio fermo, senza mettere troppa pressione su di esso (Figura 1). - Utilizzare un ingrandimento di 12x e deviare l'illuminazione per visualizzare i singoli strati corneali.
- Impostare l'energia dell'impulso (ad esempio, 1,6 mJ) e il punto di messa a fuoco (ad esempio, 0,16 mm) per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali.
- Posizionare una paracentesi di cornea chiara vicino al limbo e iniettare la viscoelastica (Tabella dei materiali) per stabilizzare la camera anteriore.
- Accisa la cornea centrale trattata al laser utilizzando una trephine da 8 mm.
- Collocare la cornea eccitata in un pozzo di una piastra di 12 pozze con il sito endoteliale rivolto verso l'alto e incubare il campione in 3 mL di mezzo pieno a 37 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni.
NOTA: i potenziali agenti citoprotettivi possono essere aggiunti al mezzo durante questo passaggio.
2. Preparazione all'istologia
- Preparare il buffer di Sorensen con un pH di 7,4 contenente 19,6 mL di 133 mM KH2PO4 e 80,4 mL di 133 mM Na2HPO4.
- Rimuovere il mezzo dal pozzo contenente cornea e fissare il tessuto per 20 min a temperatura ambiente (RT) utilizzando paraformaldeide senza metanolo (4%) nel buffer di Sorensen.
- Mettere il tessuto nel 20% di saccarosio in PBS fino a quando i lavandini tissutali (1 h) e poi nel 30% di saccarosio in PBS durante la notte a RT. Fare attenzione a evitare il contatto con le bolle e l'interfaccia della superficie dell'aria. Incorporare il tessuto nel composto ottimale della temperatura di taglio (OCT) e conservarlo a -80 gradi centigradi.
- Tagliare le sezioni spesse 10 m con un criostato a -27 gradi centigradi.
NOTA: Una spazzola per capelli cammello è utile per guidare la sezione emergente sopra la lama del coltello. - Trasferire la sezione in un vetrino al microscopio toccando il vetrino al tessuto entro 1 min dal taglio per evitare il congelamento del tessuto. Conservare i vetrini a -80 gradi centigradi.
3. Colorazione ematossia e eosina (H&E)
- Sezioni asciutte all'aria per alcuni minuti per rimuovere l'umidità.
- Macchie con filtrato 0.1% Mayers ematossialina per 10 min in un tubo da 50 mL.
- In un barattolo Coplin, risciacquare in fresco in esecuzione ddH2O per 5 min e immergere in 0.5% eosin 10x.
- Immergere in ddH2O fino a quando l'eosinsa smette di striature e poi tuffo in 50% (10x) così come 70% (10x) EtOH.
- Equilibrate in 95% EtOH (30 s) e 100% EtOH (60 s) prima di immergersi in xilene più volte.
- Infine montare e coverslip il campione prima di prendere le immagini utilizzando un microscopio luminoso.
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Representative Results
Usando la procedura qui presentata, abbiamo trattato gli occhi con un laser Nd:YAG, valutando diverse energie di impulso (1,0,6 mJ) e posizioni dei punti focali (distanza dalla superficie posteriore della cornea: 0,0,2 mm) per trovare i parametri ottimali. Sono state valutate repliche multiple (n n e 3) per ogni costellazione dei parametri laser (12 x 21).
Oltre al protocollo di cui sopra, l'esemplare è stato analizzato con un microscopio a due fotoni prima della fissazione e della colorazione H&E. Il microscopio a due fotoni utilizzava un laser Ti:sapphire a 80 MHz a stato solido, bloccato in modalità a 80 MHz, con un raggio di accordatura di 690-1b040 nm e un'uscita laser media di >900 mW a 800 nm come fonte di luce. Ha consegnato impulsi con una larghezza di circa 150 fs al campione. Le immagini sono state scattate con un obiettivo al microscopio (20x/0,95) ad una lunghezza d'onda di 730 nm e 30 mW di potenza laser.
Le immagini di microscopia a due foto e di microscopia leggera sono state esaminate in modo indipendente da 3 revisori, che sono stati accecati da impostazioni sperimentali e hanno dovuto assegnare le immagini a tre categorie: (1) nessun danno, (2) troppo danno, o (3) giusta quantità di danni (Figura 2 e Figura 3). Sulla base della loro valutazione è stata calcolata una mappa termica (Figura 4). Utilizzando questa mappa di calore è possibile selezionare la giusta costellazione di parametri laser per ablatare selettivamente CEC con danni minimi al tessuto circostante (verde). I risultati mostrano che il punto focale del laser deve essere di almeno 0,15 mm dietro l'endotelio corneale per l'energia dell'impulso più bassa (1,0 mJ) testata. Per le energie dell'impulso superiori a 2,9 mJ, la distanza focale più lunga testata (0,2 mm) è ancora troppo vicina all'endotelio.
Figura 1: Configurazione sperimentale. (A) Gli occhi sono stati fissati in un apparato di tenuta parzialmente stampato in 3D, che ha permesso un allineamento preciso rispetto al raggio laser. (B) Prima del trattamento laser, il tessuto è stato valutato con un dispositivo di tomografia a coerenza ottica a segmento anteriore per verificare la presenza di patologie principali del segmento anteriore. Le posizioni dei punti focali sono indicate con esemplari per 0,0 mm (asterisco nero), 0,1 mm (asterisco rosso) e 0,2 mm (asterisco blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: microscopia a due fotoni. I risultati variavano da nessun danno (A), ingenti danni collaterali (B) all'ablazione selettiva delle cellule endoteliali (C). La punta rossa mostra una membrana di Descemet rotta, e le punte di freccia verde indicano l'ablazione selettiva dei cluster CEC. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Istologia. La colorazione ematossilina ed eosina ha confermato la gamma di danni da nessun danno (A), ingenti danni collaterali (B) all'ablazione selettiva delle cellule endoteliali (C). La punta rossa mostra una membrana di Descemet rotta, e le punte di freccia verde indicano l'ablazione selettiva dei cluster CEC. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Una mappa termica che mostra la probabilità di danni CEC selettivi. A questo proposito, l'energia dell'impulso e la posizione del punto focale laser Nd:YAG devono essere presi in considerazione. Il danno eccessivo viene visualizzato in rosso e la porzione desiderata di danno viene visualizzata in verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I risultati di questo studio pilota indicano che un laser Nd:YAG può essere utilizzato per ablamare selettivamente le cellule endoteliali corneali quando vengono scelti i parametri appropriati per la dose di energia e la posizione del punto di messa a fuoco.
Poiché la funzione endoteliale è importante per la trasparenza corneale e la salvaguardia della cornea dall'edema stromale, i modelli di disfunzione endoteliale svolgono un ruolo importante nello sviluppo di farmaci anti-edematosi o procedure chirurgiche. Ci sono diversi modelli in vitro consolidati per imitare la situazione in vivo10,14,15, ma come generalmente noto, i modelli in vitro non possono imitare completamente le influenze degli enzimi e delle citochine o l'effetto dell'interazione cellulare-cellula. Al contrario, questo modello ex vivo di recente sviluppo di perdita di cellule endoteliali offre la possibilità di monitorare diversi stati della malattia e lo scompenso corneale nell'ambiente naturale.
Poiché la cornea nel nostro modello viene asportata da una trefinina dopo la procedura laser, la fisiologia della cornea cambia e simile alla situazione in vitro, le interazioni regionali sono significativamente ostacolate. Tuttavia, l'interfaccia locale rimane intatta e soprattutto la comunicazione cellulare ad altre cellule all'interno della cornea persiste. Il nostro studio ha rivelato che in queste circostanze la cornea mantiene la sua funzione per tre giorni in cultura, che offre tempo sufficiente per osservare e valutare potenziali agenti terapeutici. D'altra parte, i processi di guarigione di lunga data non possono essere studiati.
Nel nostro modello, abbiamo usato gli occhi di suini come grandi quantità di quelli possono essere facilmente ottenuti. Inoltre, gli occhi di porcina imitano molto bene gli occhi umani. A differenza dei conigli che vengono regolarmente utilizzati per l'esperimento, gli occhi di porcina hanno una membrana di Bowman. Tuttavia, lo spessore corneale dell'occhio porcina differisce notevolmente dall'occhio umano. In particolare, lo stroma porcina è molto più spesso e non vi è alcuna differenza tra spessore centrale e periferico nelle cornee di porcina16. Va anche considerato che la CEC umana non ha alcuna capacità di guarigione mentre questa caratteristica rigenerativa è riportata in alcuni animali, come maiali e conigli17,18. Il nostro studio non si è concentrato sui processi di guarigione delle ferite, ma questa differenza dovrebbe essere tenuta a mente quando si traducono i risultati. Poiché la guarigione della ferita della CEC animale non supera i quattro giorni, potrebbe ancora essere osservata nei nostri tessuti coltivati anche se durano solo per tre giorni.
Confrontando la nostra configurazione sperimentale con studi precedenti, i livelli di energia applicata erano simili19. Invece di concentrarsi solo sull'endotelio, sono state valutate diverse posizioni dei punti focali. Pertanto, la differenza principale della nostra configurazione di studi precedenti è il suo potenziale per indurre danni endoteliali specifici senza danneggiare il DM o il tessuto stromale. Un monitoraggio accurato della dose di energia e della posizione di messa a fuoco consente l'ablazione CEC selettiva senza causare danni alle onde d'urto ad altre parti della cornea. Inoltre, non abbiamo notato l'edema stronostro o subeteliale direttamente dopo il trattamento laser20.
Uno studio precedente ha dimostrato che temperature di 40 gradi centigradi possono causare danni da CEC21. Non abbiamo misurato la temperatura indotta, ma potrebbe essere interessante per ulteriori studi. Inoltre, l'effetto di diversi tipi di sistemi laser dovrebbe essere valutato. Studi precedenti hanno mostrato una differenza tra danni alla CEC circoscritti indotti dal laser e altre lesioni CEC19,22. Questo potrebbe anche limitare la comparabilità ai tessuti umani e alle malattie perché i danni indotti dal laser sembrano essere seguiti da diversi processi di sviluppo della malattia. È interessante notare che, la guarigione della ferita dopo l'applicazione laser si fermò al DM bruciato in studi precedenti19. La fonte della lesione potrebbe essere meno importante se il DM rimane intatto.
Livelli di energia più elevati possono rappresentare un rischio maggiore di lesioni estese22. I nostri risultati mostrano che l'utilizzo di livelli di energia più elevati (<2.9 mJ) per danni CEC selettivi richiede una gamma di messa a fuoco più stretta. Mentre il danno alla CEC è stato applicato meccanicamente negli studi precedenti17, i danni indotti dal laser utilizzati qui hanno un dosso più preciso della lesione e possono essere facilmente utilizzati negli studi in vivo.
Va notato che solo un piccolo numero di occhi sono stati trattati ed esaminati secondo questo protocollo. Come accennato in precedenza, potrebbero esserci differenze interindividuali nella risposta al trattamento laser e differenze tra le cornee di diverse specie animali. Poiché i danni CEC possono essere prodotti in posizioni focali diverse, alcune soglie non devono essere superate per evitare danni prolungati.
Infine, le lesioni generate in questo studio sono state collocate nella parte centrale. Uno studio precedente sugli occhi di porcina ha mostrato una guarigione accelerata delle ferite nella periferia corneale, che potrebbe essere dovuta alla sua vicinanza alle cellule staminali limbari17 poiché lo spessore corneale negli occhi di porcina non differisce tra le regioni. Dovrebbe essere valutato in studi futuri se i parametri laser devono essere regolati quando si passa dal centro della cornea alla periferia.
In conclusione, il nostro studio introduce un modello non invasivo per ulteriori indagini sulla disfunzione CEC. Le limitazioni degli studi ex vivo o in vivo in termini di utilizzo di animali invece di tessuto umano rimangono e devono essere considerate quando interpretano i risultati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Christine En e Jan A. M. Sochurek per il loro aiuto con metodi sperimentali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
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