Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).
Abstract
Os lasers Nd:YAG têm sido usados para realizar cirurgias intraoculares não invasivas, como a capsulotomia há várias décadas. O efeito incisivo depende da quebra óptica no foco do laser. Ondas de choque acústicas e bolhas de cavitação são geradas, causando ruptura tecidual. Os tamanhos das bolhas e as amplitudes de pressão variam com a energia do pulso e a posição do ponto focal. Neste estudo, os olhos de porco enucleados foram posicionados em frente a um laser Nd:YAG comercialmente disponível. Foram testadas energias de pulso variáveis, bem como diferentes posições dos pontos focais posteriores à córnea. As lesões resultantes foram avaliadas por microscopia e histologia de dois fótons para determinar os melhores parâmetros para um descolamento exclusivo de células endoteliais córneas (CEC) com dano colateral mínimo. As vantagens deste método são a ablação precisa da CEC, redução dos danos colaterais e, sobretudo, o tratamento sem contato.
Introduction
A transparência da córnea é essencial para a transmissão da luz para a retina e seus fotorreceptores1. Nesse sentido, um estado relativo de desidratação é fundamental para manter as fibras de colágeno dentro do estroma da córnea corretamente alinhadas. Esta homeostase é mantida por células endoteliais córneas (CEC) localizadas na membrana de Descemet (DM)2. O endotélio é a camada córnea mais interna. Possui uma importante função de barreira e bomba, que é crucial para a transparência da córnea3. Em contraste com o epitélio, o endotélio não é capaz de se auto-renovar4. Portanto, qualquer dano celular causado por doença ou trauma estimula as células endoteliais remanescentes a aumentar e migrar, para cobrir defeitos resultantes e manter a funcionalidade da córnea5. No entanto, se a densidade do CEC cair abaixo de um limiar crítico, a descompensação do endotélio leva a um edema, resultando em visão turva e desconforto ou até mesmo dor severa4. Apesar da disponibilidade de medicamentos para aliviar os sintomas, atualmente o único tratamento definitivo nesses casos é o transplante de córnea, que pode ser realizado na forma de enxerto de espessura total ou transplante endotelial lamellar. Este último procedimento está disponível como a ceratoplastia endotelial de membrana de Descemet (DMEK), bem como a ceratoplastia automatizada de descascamento de Descemet (DSAEK)6. No entanto, a proteção da CEC remanescente e o aumento de sua sobrevivência podem ser um alvo alternativo, que precisa de um modelo de doença adequado para testar possíveis drogas terapêuticas.
Os modelos atuais de doença de perda de CEC concentram-se na destruição do endotélio através da injeção de agentes tóxicos (por exemplo, cloreto de benzalkonium) na câmara anterior ou por abrasão mecânica das células utilizando uma técnica de descemetorhexis invasiva7,8. Embora esses modelos estejam bem estabelecidos, existem desvantagens como a resposta inflamatória geral e danos colaterais imprecisos. Portanto, esses modelos são mais propensos a representar os estágios finais da doença, quando as opções cirúrgicas acima mencionadas são inevitáveis.
Com os avanços nas estratégias de tratamento celular, como células-tronco e terapia genética, a aplicação dessas terapias celulares poderia ser útil nos estágios iniciais da perda de CEC9. Posteriormente, precisamos de um modelo que represente esses estágios iniciais da doença de forma mais adequada. Nesse sentido, os modelos de cultura celular melhoraram na última década, mas ainda são limitados em sua validade, pois as células in vitro não podem chegar perto de replicar as interações complexas que ocorrem entre os diferentes tipos de células dentro da córnea10. Portanto, os modelos de doenças ex vivo e in vivo ainda estão em alta demanda e melhorar os existentes é de extremo interesse.
A cirurgia intraocular não invasiva por fotodisrupção usando um laser neodímio:YAG (Nd:YAG) tornou-se um procedimento de rotina para oftalmologistas em todo o mundo desde sua introdução no final da década de 197011. A fotointerrupção depende da absorção de luz não linear que leva à formação de plasma, geração de ondas de choque acústicas e criação de bolhas de cavitação, sempre que o local de aplicação estiver localizado em um ambiente líquido12. Em geral, esses processos contribuem para o efeito pretendido do corte preciso do tecido. No entanto, eles também podem ser a fonte de danos colaterais desnecessários que limitam o confinamento local da cirurgia a laser13.
A previsão de efeitos mecânicos resultantes melhorou significativamente através da caracterização do curso de propagação e cavitação da onda de choque. Nosso objetivo é atingir a CEC com o mínimo de dano possível ao tecido circundante para fornecer um modelo de doença experimental não invasiva, assistida a laser para os estágios iniciais da perda de CEC. Para isso, é necessário determinar as energias e posições de pulso ideais dos pontos focais do laser.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo tecido animal seguem as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidado Animal local.
1. Preparação da cultura de órgãos e tratamento a laser
- Obtenha olhos suínos recém-enucleados do matadouro local. Mantenha-os frios (4 °C) no meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com alta glicose, suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina (1%) e soro suíno (10%), a partir de agora referido neste artigo como meio completo.
- Remova os tecidos extracelulares com uma tesoura e mergulhe os olhos em uma solução oftalmológica de 5% de povidone-iodo por 5 minutos antes de colocá-los em solução salina esterilizada com fosfato tamponado (PBS) até o uso.
- Olhos de tela para as principais patologias do segmento anterior, como cicatrizes na córnea, edema e outras opacidades com um dispositivo de tomografia de coerência óptica de domínio espectral(Tabela de Materiais).
- Posicione os olhos em frente a uma unidade de lâmpada de fenda equipada com um laser Nd:YAG(Table of Materials),que tem um comprimento de onda de 1.064 nm e um diâmetro focal de 10 μm de ar.
NOTA: Para um posicionamento ideal é utilizado um aparelho de retenção impresso em 3D, que foi projetado para segurar o olho firme, sem colocar muita pressão sobre ele(Figura 1). - Use uma ampliação de 12x e desvie a iluminação para visualizar as camadas córneas individuais.
- Defina a energia de pulso (por exemplo, 1,6 mJ) e o ponto de foco (por exemplo, 0,16 mm) para ablação seletiva de células endoteliais.
- Coloque uma paracentese de córnea clara perto do membro e injete viscoelástico(Tabela de Materiais)para estabilizar a câmara anterior.
- Excisão da córnea central tratada a laser usando uma tifina de 8 mm.
- Coloque a córnea excisa em um poço de 12 poços com o sítio endotelial voltado para cima e incubar o espécime em 3 mL de meio completo a 37 °C por até 3 dias.
NOTA: Potenciais agentes citoprotetores podem ser adicionados ao meio durante esta etapa.
2. Preparação para a histologia
- Prepare o buffer de Sorensen com um pH de 7,4 contendo 19,6 mL de 133 mM KH2PO4 e 80,4 mL de 133 mM Na2HPO4.
- Remova o meio do poço contendo córneas e fixar o tecido por 20 min à temperatura ambiente (RT) usando paraformaldeído livre de metanol (4%) no tampão de Sorensen.
- Coloque o tecido em 20% de sacarose na PBS até que o tecido afunde (1 h) e depois em 30% de sacarose na PBS durante a noite no RT. Tome cuidado para evitar o contato com bolhas e a interface da superfície do ar. Incorpore tecido no composto de temperatura de corte ideal (OCT) e armazene a -80 °C.
- Corte as seções de 10 μm de espessura usando um criostato a -27 °C.
NOTA: Uma escova de cabelo de camelo é útil para ajudar a guiar a seção emergente sobre a lâmina da faca. - Transfira a seção para um slide de microscópio tocando o slide para o tecido dentro de 1 min de corte para evitar a secagem congelada do tecido. Armazene os slides a -80 °C.
3. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
- Seções secas a ar por vários minutos para remover a umidade.
- Mancha com hematoxilina mayers filtrada por 10 min em um tubo de 50 mL.
- Em um frasco de Coplin, enxágue em ddH2O fresco por 5 min e mergulhe em 0,5% eosin 10x.
- Mergulhe em ddH2O até que a eosina pare de estriae e depois mergulhe em 50% (10x) bem como 70% (10x) EtOH.
- Equilibre em 95% EtOH (30 s) e 100% EtOH (60 s) antes de mergulhar em xileno várias vezes.
- Finalmente montar e cobrir o espécime antes de tirar imagens usando um microscópio leve.
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Representative Results
Utilizando o procedimento aqui apresentado, tratamos os olhos com um laser Nd:YAG, avaliando diferentes energias de pulso (1,0-4,6 mJ) e posições de pontos focais (distância da superfície posterior da córnea: 0,0−0,2 mm) para encontrar os parâmetros ideais. Foram avaliadas múltiplas réplicas (n = 3) para cada constelação dos parâmetros do laser (12 x 21).
Além do protocolo acima mencionado, a amostra foi analisada com um microscópio de dois fótons antes da fixação e coloração de H&E. O microscópio de dois fótons usou um laser de 80 MHz ti:safira de 80 mhz com uma faixa de ajuste de 690-1b040 nm e uma saída média a laser de >900 mW a 800 nm como fonte de luz. Ele forneceu pulsos com uma largura de aproximadamente 150 fs para a amostra. As imagens foram tiradas com um objetivo de microscópio (20x/0,95) em um comprimento de onda de 730 nm e 30 mW de potência laser.
As imagens de microscopia de dois fótons, bem como as imagens de microscopia leve, foram revisadas independentemente por 3 revisores, que ficaram cegos para configurações experimentais e tiveram que atribuir as imagens a três categorias: (1) nenhum dano, (2) muito dano ou (3) quantidade certa de dano(Figura 2 e Figura 3). Com base em sua avaliação foi calculado um mapa térmico (Figura 4). Usando este mapa de calor é possível selecionar a constelação certa dos parâmetros do laser para abbar seletivamente cec com danos mínimos ao tecido circundante (verde). Os resultados mostram que o ponto focal do laser deve estar pelo menos 0,15 mm atrás do endotélio corneano para a menor energia de pulso (1,0 mJ) testada. Para energias de pulso superiores a 2,9 mJ, a maior distância focal testada (0,2 mm) ainda está muito próxima do endotélio.
Figura 1: Configuração experimental. (A) Os olhos foram fixados em um aparelho de retenção parcialmente impresso em 3D, o que permitiu um alinhamento preciso em relação ao raio laser. (B) Antes do tratamento a laser, o tecido foi avaliado com um dispositivo de tomografia de coerência óptica do segmento anterior para verificar as principais patologias do segmento anterior. As posições dos pontos de laser focal são indicadas com exemplares para 0,0 mm (asterisco preto), 0,1 mm (asterisco vermelho) e 0,2 mm (asterisco azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Microscopia de dois fótons. Os resultados variaram de nenhum dano(A),danos colaterais extensos(B)à ablação seletiva de células endoteliais(C). A ponta da seta vermelha mostra a membrana de Descemet rompida, e as pontas de seta verde indicam ablação seletiva de clusters CEC. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Histologia. A coloração de hematoxilina e eosina confirmou que os danos variam de nenhum dano(A),danos colaterais extensos(B)à ablação seletiva de células endoteliais(C). A ponta da seta vermelha mostra a membrana de Descemet rompida, e as pontas de seta verde indicam ablação seletiva de clusters CEC. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Um mapa de calor mostrando a probabilidade de dano cec seletivo. A este respeito, a energia do pulso, bem como a posição do ponto focal do laser Nd:YAG devem ser levadas em conta. Danos excessivos são mostrados em vermelho, e a parte desejada de dano é mostrada em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os resultados deste estudo piloto indicam que um laser Nd:YAG pode ser usado para abmar seletivamente células endoteliais da córnea quando forem escolhidos parâmetros apropriados para dose de energia e posição de ponto de foco.
Como a função endotelial é importante para a transparência da córnea e para a salvaguarda da córnea a partir de edema estromo, os modelos de disfunção endotelial desempenham um papel importante no desenvolvimento de medicamentos anti-edematosos ou procedimentos cirúrgicos. Existem vários modelos in vitro estabelecidos para imitar a situação in vivo10,14,15, mas como geralmente se sabe, modelos in vitro não podem imitar completamente as influências de enzimas e citocinas ou o efeito da interação celular-célula. Em contrapartida, este modelo ex vivo recém-desenvolvido de perda celular endotelial oferece a possibilidade de monitorar diferentes estados da doença e descompensação da córnea no ambiente natural.
Como a córnea em nosso modelo é extirada com uma tifina após o procedimento a laser, a fisiologia da córnea muda e semelhante à situação in vitro, as interações regionais são significativamente dificultadas. No entanto, a interface local permanece intacta e especialmente a comunicação celular com outras células dentro da córnea persiste. Nosso estudo revelou que, nessas circunstâncias, a córnea mantém sua função por três dias na cultura, o que oferece tempo suficiente para observar e avaliar potenciais agentes terapêuticos. Por outro lado, processos de cura de longa data não podem ser investigados.
Em nosso modelo, usamos olhos suínos como maiores quantidades desses podem ser facilmente obtidos. Além disso, os olhos suínos imitam muito bem os olhos humanos. Em contraste com coelhos que são regularmente usados para experimentos, os olhos suínos têm uma membrana de Bowman. No entanto, a espessura da córnea do olho suíno difere consideravelmente do olho humano. Em particular, o estroma suíno é muito mais espesso e não há diferença entre a espessura central e periférica nas córneas suínas16. Deve-se considerar também que a CEC humana não tem qualquer capacidade de cura enquanto essa característica regenerativa é relatada em alguns animais, como porcos e coelhos17,18. Nosso estudo não se concentrou nos processos de cicatrização de feridas, mas essa diferença deve ser mantida em mente na tradução dos resultados. Como a cicatrização da ferida do CEC animal não excede quatro dias, ela ainda pode ser observada em nossos tecidos cultivados, mesmo que durem apenas três dias.
Comparando nossa configuração experimental com estudos anteriores, os níveis de energia aplicados foram semelhantes19. Em vez de focar apenas no endotélio, foram avaliados diferentes locais de pontos focais. Portanto, a principal diferença de nossa configuração para estudos anteriores é o seu potencial para induzir danos endoteliais específicos sem danificar tanto o DM quanto o tecido estrômal. O monitoramento preciso da dose de energia e posição de foco permite a ablação seletiva do CEC sem causar danos causados por ondas de choque em outras partes da córnea. Além disso, não notamos edema estrômico ou subepitelal diretamente após o tratamento a laser20.
Um estudo anterior mostrou que temperaturas de ~40 °C podem levar a danos cec21. Não medimos a temperatura induzida, mas pode ser de interesse para estudos posteriores. Além disso, o efeito de diferentes tipos de sistemas a laser deve ser avaliado. Estudos anteriores mostraram diferença entre danos de CEC circunscritos induzidos a laser e outras lesões cec19,22. Isso também pode limitar a comparabilidade ao tecido humano e doenças, porque os danos induzidos por laser parecem ser seguidos por diferentes processos de desenvolvimento da doença. Curiosamente, a cicatrização da ferida após a aplicação do laser parou no DM queimado em estudos anteriores19. A fonte da lesão pode ser menos importante se o DM permanecer intacto.
Níveis de energia mais altos podem representar um maior risco de lesão prolongada22. Nossos resultados mostram que o uso de níveis de energia mais altos (<2,9 mJ) para danos pecados de CEC requer uma faixa de foco mais apertada. Enquanto o dano ao CEC foi aplicado mecanicamente em estudos anteriores17, o dano induzido por laser utilizado aqui tem uma dosagem mais precisa da lesão e pode ser facilmente utilizado em estudos in vivo.
Deve-se notar que apenas um pequeno número de olhos foram tratados e examinados de acordo com este protocolo. Como mencionado acima, pode haver diferenças interindividuais na resposta ao tratamento a laser, bem como diferenças entre as córneas de diferentes espécies animais. Uma vez que os danos do CEC podem ser produzidos em diferentes posições focais, certos limiares não devem ser excedidos para evitar danos prolongados.
Por fim, as lesões geradas neste estudo foram colocadas na parte central. Um estudo anterior de olhos suínos mostrou cicatrização acelerada da ferida na periferia da córnea, o que pode ser devido à sua proximidade com células-tronco limbais17, já que a espessura da córnea nos olhos suínos não difere entre as regiões. Deve ser avaliado em estudos futuros se os parâmetros do laser devem ser ajustados ao mudar do centro da córnea para a periferia.
Em conclusão, nosso estudo introduz um modelo não invasivo para investigações adicionais sobre a disfunção da CEC. As limitações dos estudos ex vivo ou in vivo em termos de uso de animais em vez de tecido humano permanecem e devem ser consideradas na interpretação dos resultados.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Christine Örün e Jan A. M. Sochurek pela ajuda com métodos experimentais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
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