Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מזהה הגירה הסתננות של נויטרופילים בעכברים

Published: February 6, 2020 doi: 10.3791/60543
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Biocontrol, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen (Zhongshan) University
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים שלוש שיטות להערכת הגירה נויטרופילים והסתננות הן בvivo והן בתוך מבחנה. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות מבטיח therapeutics פילוח הגירה נויטרופילים.

Abstract

נויטרופילים הם חבר מרכזי של המערכת החיסונית מולדת ולשחק תפקידים מרכזיים הגנה מארחים מפני פתוגנים ותגובות דלקתיות פתולוגי. נויטרופילים ניתן לגייס לאתרי דלקת באמצעות הדרכה של ציטוקינים ו נוגדנים. הסתננות מוחצת של נויטרופילים יכול להוביל נזק לרקמות הבחנה, כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA). נויטרופילים מבודדים מתוך התפענות הצפק להגיב הגדרת כימוסטנט מוגדר, N-formyl-Met-מלאו-פה (fMLP), ב מבחנה ב Transwell או הלשכה הקאמרית Zigmond. את הניסוי כיס האוויר ניתן להשתמש כדי להעריך את כימוטקוניות של נויטרופילים לכיוון ליפופוליסכריד (LPS) ב vivo. מודל העכבר המושרה (AA) הנגרמת לעתים קרובות נעשה שימוש במחקר RA, ומכתים אימונוהיסטוכימיה של סעיפים משותפים עם anti-myeloperoxidase (MPO) או אנטי נויטרופילים elastase (NE) נוגדנים היא שיטה מבוססת היטב כדי למדוד הסתננות נויטרופילים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות טיפולים מבטיחים מיקוד הגירה נויטרופילים.

Introduction

נויטרופילים הם הנפוצים ביותר בתאי דם לבנים וחשבון עבור 50 ל-70% של אוכלוסיית כולה של תא דם לבן בבני אדם1. נויטרופילים הם אחד המגיבים העיקריים במהלך דלקת חריפה. נויטרופילים ניתן לגייס לאתרי דלקת באמצעות הדרכה של ציטוקינים ו נוגדנים שוחרר על ידי תאיםתושבהרקמה 2,3,4, אשר מתווך על ידי אינטראקציות בין מולקולות הדבקה התא על פני השטח של התאים נויטרופילים וכלי הדם5. נויטרופילים הם בסיסיים לארח את ההגנה ולשחק תפקיד בתגובות דלקתיות פתולוגי בשל קיבולת רבת עוצמה שלהם כדי לפגוע ברקמות באמצעות שחרורו של מינים חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות לפגיעה ברקמות3,6.

מחקרים קודמים תיארו מספר פרוטוקולים של בידוד נויטרופילים מעכברים או בני אדם. הו ואח ' הפגינו שיטת הפרדה בצפיפות מעבר הצבע כדי לבודד נויטרופילים אנושיים מהדם האנושי השלם7. עם זאת, בידוד של נויטרופילים מספיק דם העכבר קשה בגלל נפח הדם הקטן. לחילופין, מספרים גדולים של העכבר טהור ומלא קיימא יכול להיות הכין מתוך נוזל הצפק העכבר, ואת אלה נויטרופילים מטוהרים ניתן להשתמש לשעבר vivo לבחון מספר היבטים של פונקציות הסלולר ex vivo, כולל הסתננות נויטרופילים, הגירה, כימוטווניות, פרץ חמצוני, cy, ו נויטרופילים השמנה מסחטות (NET) 10,11 יכול לשמש להערכת. הגירה של נויטרופילים במבחנה מודל כיס האוויר משמש כדי להעריך את הגירה הסתננות של נויטרופילים ב vivo. מודל כיס האוויר תת עורית הוא נוח במודל בעלי חיים vivo ללמוד הגירה של תאים דלקתיים.

באופן מסורתי, נויטרופילים נחשבו כמו הפתוגן מייבשים בשלבים אקוטי של דלקת. עם זאת, הממצאים האחרונים הראו כי נויטרופילים הם תאים מסובכים המבצעים מגוון משמעותי של פונקציות מיוחדות. נויטרופילים יכול לווסת תהליכים רבים כגון פציעה חריפה ותיקון, tuמוריגנזה, תגובה אוטואימונית, דלקת כרונית12,13. נויטרופילים גם לווסת את התגובות החיסונית אדפטיבית יכול להסדיר B תאים ו T תאים14,15. מחסור ניכר של נויטרופילים מוביל לתמותה או כשל חיסוני חמור בבני אדם ו נויטרופילים דלדול בעכברים מוביל הקטלנית, בעוד הפעלה מוגזמת או גיוס של נויטרופילים באיברים גורם למחלות החיסון מספר, כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA) ו זאבת מערכתית מאריתסוס (לשיון)6. נויטרופילים הם התאים השופעים ביותר בנוזל אמתחת של חולים RA. נויטרופילים לייצר כמויות מוגזמות של myeloperoxidase (MPO) ו נויטרופילים elastase (NE) באמצעות השפלה, אשר שחיקה הסחוס בייטס. MPO הוא אנזים peroxidase מתבטא בעיקר בגרגירים של נויטרופילים16. NE קשורה להשמדה הסחוס הבין-מולקולרית17. MPO ו-NE יכול לשמש כדי להעריך את הסטטוס של הגירה נויטרופילים הסתננות ברקמת מטופלים RA.

מאמר זה מספק שלוש שיטות קונבנציונליות כדי להעריך את הגירה של המושרה נורמלי מושרה הן ב vivo ו בחוץ גופית, כמו גם חדירה של נויטרופילים פתולוגי במודל העכבר משותף ספציפי לדלקת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים נבדקו ואושרו על-ידי אוניברסיטת בייג לטיפול בבעלי חיים ברפואה הסינית והוועדה לשימוש.

הערה: C57BL/6 עכברים (בן 7-8 שבועות) שימשו.

1. בידוד נויטרופילים

  1. רכישת תאים בעלי כדוריות הצפק
    1. הכינו את התמיסה החדשה של 10% ב-ddH2O. חשב את עוצמת הקול הדרושה בהתאם למספר העכברים.
      הערה: הגדר את מספר העכברים כ-N, (2N + 1) מ-mL של הפתרון חייב להיות מומס ומסונן מראש.
    2. רסס את סביבת העבודה עם 70% אתנול. השתמש מזרק אינסולין כדי לצייר 1 מ ל של פתרון peptone ובועות פריקה.
    3. הערכת הזרקת הצפק ראשונה של 1 מ ל של פתרון peptone לכל עכבר.
      1. לתפוס את העכבר בתנוחת הראש עם יד אחת. לחטא את מקום ההזרקה עם כדורי כותנה ספוגים באלכוהול.
        הערה: תנוחת ההזרקה המועדפת טמונה בהיבט הרוחבי של הרביע השמאלי או הימני התחתון של הבטן.
      2. להשרות את הריאגנטים במהירות. הכנס 1 מ ל לתוך החלל הצפק של כל עכבר עם מזרק אינסולין.
        הערה: הזווית בין המחט לבין העור צריכה להיות כ -15 עד 30 ° כדי להימנע מפציעה במעיים או באיברים אחרים.
    4. אפשר לתגובה דלקתית להתפתח בן לילה. לאחר 12 שעות, לנהל את הזריקה השנייה באותו אופן כמו הזריקה הראשונה.
    5. שלוש שעות לאחר הזריקה השנייה, מורדם לחלוטין עכברים עם 5% isofלינה עבור 5 דקות בתא הרדמה גז במהירות של 2 L/min. הסירו את העכברים המדמיגים מהתא. והקריבו אותם באמצעות נקע בצוואר הרחם
      הערה: עומק מספיק של הרדמה מובטחת על-ידי צביטת הבהונות לפני הזזת עכברים מהתא ליחידת הנשימה היחידה. הרגליים לא אמורות לזוז. כשהאצבעות מצפות
      הערה: יש לעבד את כל הצעדים הבאים במכסה של תרבות הרקמה.
    6. לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הנח את העכבר על משטח פלסטיק סטרילי ותקן את הגפיים במחטים.
    7. השתמש בערכה סטרילית של כלים כירורגיים כדי לבצע חתך אופקי (~ 1 ס מ) באמצע הבטן התחתונה. להרים את העור של הבטן העליונה עם מלקחיים ולחתוך לאורך קו האמצע של הבטן ולחשוף את קיר הצפק שלמים.
    8. הכנס 5 מ ל סטרילי RPMI-1640 בינוני להשלים את חלל הבטן עם 30 G x 1/2 "מחט. הכנס את המחט דרך הקיר הצפק עם הקצה השופע של המחט הפונה כלפי מעלה ולהזריק את כל הנפח.
    9. טלטל את המשטח אופקית למשך 5 דקות. עסה את הבטן מספר פעמים בעדינות.
    10. להזריק 23 G x 1 1/4 "מחט לתוך החלל הצדדי של הבטן. לחלץ את נוזלי הבטן (~ 5 מ"ל) ולאסוף אותו בשפופרת צנטריפוגה 50 mL.
      הערה: מניחים את הצינורות על הקרח בהקדם האפשרי במקרה של הפעלת נויטרופילים.
    11. הכנס עוד 5 מ ל של בינוני מלא וחזור על ההליך כדי להסיר את התאים הנותרים מצפק. ברכת את נוזל הצפק. בשפופרת הצנטריפוגה 50-mL
    12. צנטריפוגה את הנוזל הצפק במאגר ב 400 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    13. . מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את התאים ב-1 mL של RPMI-1640 בינוני מלא.
      הערה: לא מערבולת כדי למנוע הפעלת נויטרופילים.
  2. בידוד של נויטרופילים
    1. הוסף 4 מ ל של מעבר טרי 70.2% צפיפות הדרגתי בינונית (למשל, חלחול) בשפופרת צנטריפוגה 15 מ ל.
    2. כיסוי בזהירות 4 מ ל של הכין טרי 54.8% צפיפות מעבר הצבע בינונית על 70.2% צפיפות מעבר הצבע לאט לאורך קצה הצינור עם עצות בצנרת חדה ב 15 מ ל צנטריפוגה שפופרת.
      הערה: תרגיל זהירות כדי להימנע מהפרעה לממשק בין בינוני הדרגתי של צפיפות 54.8% ו-70.2% בינונית מעבר הדרגתי של צפיפות.
    3. שכבת בזהירות הבולם תא הצפק 1 mL על גבי השכבה בינונית 54.8% צפיפות הדרגתי לאט עם עצות בצנרת חדה (איור 1א).
      הערה: תרגיל זהירות כדי להימנע מהפרעה לממשק בין ההשעיה של התא לבין מדיום 54.8% בצפיפות מעבר הצבע.
    4. צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 30 דקות ב 22 ° צ' ללא בלימה.
    5. לאסוף את נויטרופילים בממשק של 54.8% צפיפות מעבר הצבע בינוני ו 70.2% צפיפות שכבות בינוניות (איור 1B) לצינור חדש.
    6. הוסף 1 מ ל של RPMI-1640 בינונית להשלים את התאים שנאספו ובזהירות להשהות את התאים על ידי ליטוף בעדינות מספר פעמים. צנטריפוגה ב 100 x g עבור 10 דקות בשעה RT ובזהירות להסיר את supernatant.
    7. חזור על שלב השטיפה (שלב 1.2.6) פעם אחת.
    8. הוסף 0.5 mL של התרבות בינונית לגלולה להשעות את התאים מחדש על ידי ליטוף בעדינות מספר פעמים. קח 50 μl סדרת מחלקים כדי לספור את התאים באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי.

2. שיטת ההגירה של נויטרופילים

  1. למדוד את הגירה נויטרופילים על ידי שיטת העברת שינוי9 או שיטת zigmond קאמרית כפי שתוארה בעבר10,11.

3. שיטת האוויר בנרתיק

  1. הזרקת אוויר ראשונה
    1. ביום 0, מורדם לחלוטין עכברים עם 5% isofלילה עבור 3 דקות בחדר הרדמה גז במהירות של 2 L/min, ולשמור על ההרדמה של כל עכבר ביחידת נשימה אחת עם 2% isofהלביאן במהירות של 0.5 L/min.
      הערה: עומק מספיק של הרדמה מובטחת על-ידי צביטת הבהונות לפני הזזת עכברים מהתא ליחידת הנשימה היחידה. הרגליים לא אמורות לזוז. כשהאצבעות מצפות
    2. השתמש במסנן 0.22 יקרומטר המצורף ל-5 מזרק ml כדי לקבל נפח של 3 מ ל של אוויר מעוקר.
    3. הרם את העור האחורי של העכבר מורדם עם מלקחיים ו תת-עורי להזריק 3 מ ל של אוויר מעוקר באמצעות 26 G x 3/8 "מחט.
    4. לאחר הטיפול, להסיר את העכברים מיחידת הנשימה. עקוב אחר העכברים כדי להבטיח שהם בחיים עד שהם מתחילים לנוע.
  2. הזרקת אוויר שנייה
    1. ביום 3, להזריק 3 מ ל נוסף של אוויר מעוקר לתוך כיס האוויר הוקמה בעבר כדי לקיים את כיס האוויר כמתואר בסעיף 3.1.
  3. טיפול
    1. , ביום 6, 6 שעות לפני ההקרבה. תזריק טיפולים שונים לתוך כיס האוויר הכנס 1 מ"ל של תמיסת מלח (PBS) באגירה של פוספט בתור פקד שלילי. הכנס 1 מ ל של 1 μg/mL LPS כפקד חיובי כדי לגרום לדלקת מקומית.
    2. מורדם לחלוטין עכברים עם 5% isofלילה עבור 3 דקות בחדר הרדמה גז במהירות של 2 L/min, ולשמור על ההרדמה של כל עכבר ביחידת נשימה אחת עם 2% isof, במהירות של 0.5 L/min. הכן מאגר לשטוף על פי לוח חומרים.
      הערה: עומק מספיק של הרדמה מובטחת על-ידי צביטת הבהונות לפני הזזת עכברים מהתא ליחידת הנשימה היחידה. הרגליים לא אמורות לזוז. כשהאצבעות מצפות
    3. עבור כל כיס האוויר, לשטוף את כיס האוויר עם 1 מ ל של מאגר לשטוף ולאסוף את האקסודלקתית ב 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה. לשטוף את כיס האוויר עם 2 מ ל של מאגר לשטוף 2x ולאסוף את האקסוהדלקתית באותה צינורית צנטריפוגה.
    4. צנטריפוגה ב 100 x g עבור 10 דקות ב-RT. לבטל את התאים מחדש ו-השהה באמצעות 1 mL של מאגר לשטוף. לספור את התאים כדי לכמת את היחס נויטרופילים באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי.
      הערה: ראה תוצאות מייצגות באיור 2.

4. האינדוקציה של מודל העכבר של דלקת מפרקים המושרה (AA)

  1. להשעות להשלים את הפסיקה של פרוינד (פרנק) על ידי vortexing לפחות 5 s, ואז לצייר 100 μL של השעיה לתוך מזרק אינסולין.
    הערה: אנו ממליצים להשתמש בחדש לחלוטין בניסויים כדי להבטיח עקרות.
  2. עכברים מורדם כמתואר בשלב 3.1.1.
  3. סמן את כף היד הנבחרת והזרק 20 μL של הדיסק לתוך השטח המפרק של הקרסול. הכנס 20 μL של השעיה לתוך ארבעה כתמים פריקולריות על כף היד הנבחרת (80 μL בסך הכל).
  4. להסיר עכברים מיחידת הנשימה ולשים את העכברים מעובד בתא חדש. הצג עכברים כדי לוודא שהם נושמים עד שהם מחדש את היכולת לזוז.
  5. כל 3 ימים, להעריך את קוטר משותף על ידי מדידת קוטר מפרק הקרסול באמצעות מד עובי כיס (איור 3א).
  6. כל 3 ימים, להעריך את חומרת דלקת מפרקים על ידי מפרקים הבקיע קריטריון (איור 3ג): 0, נורמלי, אין ראיות של אריתמה ונפיחות; 1, דלקת הפרקים המוזרה ביותר, אודם ונפיחות קלה המוגבלת לקרסוליים או למפרק הקרסול; 2, דלקת מפרקים מתונה, אודם ונפיחות קלה הארכת מן הקרסול אל הרגליים; 3, דלקת מפרקים חמורה, אודם ונפיחות מתונה הארכת מתוך הקרסול למפרקים מתכת; 4, דלקת מפרקים חמורה ביותר, אודם ונפיחות קשה להקיף את הקרסול, הרגל והספרות, או ankylosis של האיבר.

5. כתמים אימונוהיסטוכימיים של חלקים משותפים

  1. בידוד משותף
    1. להקריב את העכבר בסעיף 4 באמצעות פריקה צוואר הרחם לאחר הרדמה עם isofלוריאן. לרסס את העכבר עם 70% אתנול.
    2. הסר את העור וחלק משריר הרגל האחוריות עם מלקחיים ומספריים. רסס את המפרק עם 70% אתנול ולהסיר את שאר השרירים באמצעות מגבת נייר.
    3. תקן את מפרק הקרסול ב 4% פאראפורמלדהיד עבור 2 ימים בשעה RT. Decalcify המפרק ב 10% EDTA עבור חודש 1 ב RT ולשנות את המדיום שבועי.
    4. הטמע את הרקמה בפרפין והכינו מקטעי רקמה בעובי 4-μm.
      1. מניחים רקמה בתבנית מסומנת עם נפח מסוים של פרפין נוזלי. . מגניב לזמן קצר
      2. להגדיר את עובי ב 4 יקרומטר ו לחתוך פרוסות על מיקרוטומה. קטעים צפים באמבט מים ב43 ° c.
      3. הבהר את המקטעים על שקופיות והעבר את השקופיות לתוך התנור ב-70 ° c עבור 2 שעות. לשימוש עתידי, שימור השקופיות ב-20 ° c.
  2. Safranin O וכתמים ירוקים מהיר של סעיפים משותפים
    הערה: השלבים הבאים מכתים מתנהלים ב-RT.
    1. מניחים את השקופיות משלב 5.1.4.3 בארון תקשורת ולבצע את השטיפה הבאים כדי להשקות ב-RT: קסילן עבור 5 דקות (3x), 100% אתנול עבור 2 דקות (2x), 95% אתנול עבור 2 דקות (2x), 70% אתנול עבור 2 דקות, ו 50% אתנול עבור 15 דקות.
    2. כתם ב 0.1% הפתרון הירוק מהיר עבור 5 דקות. לשטוף ב 1% חומצה אצטית עבור 10 s.
    3. כתם ב 0.1% safranin O צביעת פתרון עבור 20 דקות. לטבול את השקופיות בשטף הבא: 95% אתנול עבור 2 דקות (2x), 100% אתנול עבור 2 דקות (2x), ו קסילן עבור 2 דקות (2x).
    4. הר את מקטעי הרקמה ולהתבונן הרקמות תחת מיקרוסקופ.
      הערה: ראה תמונותמייצגות באיור 4א.
  3. אימונוהיסטויוכימיים מכתים כדי להמחיש נויטרופילים
    1. אופים את מקטעי פרפין עבור 2 h ב 78 ° c. מניחים את השקופיות בארון תקשורת ולבצע את שוטף הבא כדי לעבור מחדש ב RT: קסילן עבור 15 דקות (2x), 100% אתנול עבור 5 דקות (2x), 95% אתנול עבור 5 דקות, 80% אתנול עבור 5 דקות, H2O עבור 3 דקות, ו-PBS עבור 3 דקות.
      הערה: אל תתנו לשקופיות להתייבש בכל עת במהלך שלב זה.
    2. הוסיפו טיפה אחת של מאגר חדירות כדי לכסות את הרקמה. מחלקים הדגירה במגש מבוקר לחות ב 37 ° c.
    3. לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 3 דקות (3x). הימנע שטיפה הרקמה ישירות.
    4. בצע בחום המושרה אנטיגן אפירופה לאחזור באמצעות דוד הלחץ.
      1. סידור שקופיות בארון תקשורת. לטבול שקופיות דוד הלחץ ממולא מאגר אחזור.
      2. שים את הדוד לחץ על תנור מיקרוגל. הגדר את תנור המיקרוגל ב-600 W וחמם את השקופיות במשך 10 דקות.
      3. לאחר הרתיחה, לשמור על השקופיות בדוד להתקרר עד 90 ° c. להוציא את השקופיות ולשטוף אותם ב-PBS עבור 3 דקות (3x).
    5. פעילות peroxidase אנדוגניים כיבוי בהכנה טריים 3% H2O2 בשעה RT עבור 15 דקות. לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 3 דקות (3x).
    6. לתאר עיגול גדול סביב המדגם עם עט הידרופובי, להימנע מלגעת במדגם. בלוק עם 3% בסרום שור (BSA) בחדר לחות הנשלט ב-37 ° c עבור 60 דקות.
    7. הסר פתרון חסימה. הוסף 50 μL של נוגדן ראשוני מדולל PBS לכל מקטע במהירות. ואז, מודאת השקופיות במגש שבשליטת לחות ב -4 ° c בלילה.
      הערה: יחסי דילול שונים משמשים לנוגדנים שונים (1:25 עבור MPO ו 1:20 עבור NE).
    8. ביום השני, להוציא את המגש ולתת לו לעמוד ב-RT עבור 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב-PBS עבור 3 דקות (3x).
    9. הוסף 50 μL של נוגדנים משניים PBS-מדולל לרקמות.
      הערה: יחסי דילול שונים הוחלו: 1:1000 עבור MPO ו-1:1500 עבור NE.
    10. דגירה שקופיות במגש מבוקר לחות ב 37 ° c עבור 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב-PBS עבור 3 דקות (3x).
    11. לפתח ב מדולל 3, 3 '-diaminobenzidine (בתוך) פתרון עבור 5 דקות. לפקוח עין על התגובה במקרה של פיתוח של צבע כהה. שטפו את השקופיות במים מזוקקים.
    12. מנגד את השקופיות במטאוקסילין במשך 10 שנות. שטוף את השקופיות במי ברז עבור 5 דקות.
    13. לשטוף את האלכוהול חומצה סופר מהיר בידול פתרון עבור 3 s. לאחר מכן לשטוף את מי ברז עבור 10 דקות.
    14. לטבול את השקופיות בשטף הבא ב RT: 80% אתנול עבור 5 דקות, 95% אתנול עבור 5 דקות, 100% אתנול עבור 5 דקות, ו קסילן עבור 15 דקות (2x). תקן את הכיסויים עם פתרון הרכבה. . שימו לב לרקמה מתחת למיקרוסקופ
      הערה: ראה תמונות מייצגות באיור 4ב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאים בעלי הצפק. שנאספו מנוזל ששטיפה של עכברים תאים הושעו מחדש ב 1 מ ל של RPMI-1640 בינוני מלא, שכבתית על שני צעדים (54.8%/70.2%) מעבר הדרגתי דחיסות רציפה (איור 1א), ו centrifuged ב 1,500 x g עבור 30 דקות. נויטרופילים (≥ 95%, ~ 1 x 107 נויטרופילים/עכבר) התגלו מהממשק התחתון (איור 1B).

ניסויים בפאוץ האוויר בוצעו כדי לחקור את מעוררת הגיוס נויטרופילים על ידי LPS בvivo (איור 2א). ערכות המשנה הלוקוציט בנרתיק האוויר נמדדות (איור 2ב).

הגירה נויטרופילים ב RA הוערך דרך מודל דלקת מפרקים מורנית המושרה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, קבוצת ה-AA הראתה בצקת משמעותית בכף היד. בקבוצה AA, קוטר מפרק הקרסול גדל (איור 3ב) ואת הציון דלקת מפרקים עלה בעקביות (איור 3ד).

נזק הסחוס הוא סינדרום הנציג של RA, safranin O-fast סחוס ירוק כתמים בוצע כדי להעריך את הנזק הסחוס בעכבר AA. כפי שמוצג באיור 4A, האתגר המושרה כמות גדולה של חדירת לוקיציט, שחיקת סחוס משמעותי היפרפלזיה מערכת. MPO ו-NE ביטוי רמות הם סמנים מייצגים של הסתננות נויטרופילים. אימונוהיסטוכימיה כימיקלים בוצעו כדי לצפות הסתננות נויטרופילים במפרקים. ביטוי MPO ו-NE היה משמעותי ביותר בחלק המשותף (איור 4ב).

Figure 1
איור 1: בידוד נויטרופילים. (א) הפריפריאלית תאים מחדש הושעה ב 1 מ ל של RPMI-1640 המדיום השלם שכבה על שני צעדים (54.8%/70.2%) מעבר צבע בדחיסות רציפה. (ב) לאחר צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 30 דקות, נויטרופילים (≥ 95%, ~ 1 x 107 נויטרופילים/עכבר) התגלו מהממשק התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התוצאות הייצוגיות של שיטת כיס האוויר. (א) איור של שיטת כיס האוויר. (ב) תוצאות מייצגות של חדירת מערכת לוקיציט בתוך שיטת כיס האוויר. שליטה בערוץ הPBS; LPS: 1 μg/mL LPS. נתונים מוצגים כממוצע ± SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התוצאות הייצוגיות של מודל העכבר לדלקת מפרקים (AA). (א) קוטר מפרק הקרסול נמדד באמצעות מד עובי כיס. (ב) נפיחות משותפת הוערך על בסיס קוטר מפרק הקרסול (n = 7). (ג) תמונות של כל הניקוד של דלקת מפרקים. (ד) חומרת דלקת הפרקים היתה מדורגת בקנה מידה של 0-4 נקודות (n = 7). נתונים מוצגים כממוצע ± SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות הנציג של הsafranin O-מהיר הסחוס הירוק כתמים והשליטה אימונוהיסטוכימיה של חלקים משותפים מתוך שליטה ועכברים AA. (א) תוצאות הנציג של safranin O-מהיר הסחוס הירוק כתמים של סעיפים משותפים. (ב) תוצאות מייצגות של רמת הביטוי של MPO ו-NE במפרקים הקרסול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקולים מפורטים של מאוד מטוהרים נויטרופילים מ דם היקפי7, מח עצם ורקמות18 זמינים במשך זמן רב. כאן אנו לאמץ שיטה של בידוד נויטרופילים מתוך נוזל הצפק19 שבו נויטרופילים בוגרת להישאר מופעל עבור אנטי דלקתיות ומחקרים נוגדי חמצון נוספים.

השתמשנו בניסוי של נרתיק האוויר כדי לחקור את החדירה LPS המושרה של נויטרופילים ב vivo. שיטה זו הוצע כשיטה פוטנציאלית למדידת ישירות חדירת תאים בסביבה דלקתית כללית בvivo.

ראוי לציין כי היישום כיס האוויר מדגים רק את תפקידו של נויטרופילים באיבר-באופן לא ספציפי ומסיר מספר שלבים של הזרקור הגיוס לוקיציט. מאז הגיוס נויטרופילים לאיברים ספציפיים יכולים להסתמך על תכונות איברים שונים, מולקולות הדבקה, ו נוגדנים, לחקור את המצב התפקודי נויטרופילים בתנאים ספציפיים לאיברים הוא בעל חשיבות רבה ללמוד את התפקיד כי נויטרופילים פוטנציאלי לשחק מחלות מסוימות3. זה הוצע כי דגמי נקודות הקצה נדרשים לחקור הסתננות נויטרופילים. לכן, ביצוע מכתים אימונוהיסטוכימיה על קטעים משותפים של עכברים במודל AA יכול לספק פרספקטיבה תובנה על נויטרופילים בחלל משותף. על פי הנתונים שלנו, מספר עצום של נויטרופילים מגויסים לתוך הרקמה המשותפת ולשמש ראיות בסיסיות עבור מחקר נוסף על הפרעה חדירה של נויטרופילים לטיפול RA. בנוסף, מקיף assays למשל, safranin O-fast כתמים ירוקים, נדרשים להעריך את מודל המחלה למחקר נוסף.

נויטרופילים הם מערכת המשנה העיקרית של חדירה תאים דלקתיים ולעבוד כקו ההגנה הראשון מפני הפולשים פתוגנים או פציעה ברקמה20,21. אם נויטרופילים לחדור רקמות במספרים גדולים, רמות גבוהות של ציטוקינים ורשתות מופרש, אשר ביחד עלול להציף את מנגנוני ההגנה ברקמות ולהוביל נזק לרקמות. פציעה ברקמה נוספת מעוררת הסתננות נויטרופילים, ובכך להרכיב מחזור אכזרי22. הפרעה להעברת תאים באמצעות השמנה תאים שהופעלו באיברי הלימפה הוצע כגישה טיפולית חשובה והוחל בניסויים קליניים עם תופעות לוואי שונות23. גילוי הטיפול הרומן במקביל להסדיר הגירה נויטרופילים ופעילות דלקתית היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול במחלות דלקתיות בעתיד. יתר על כן, אם החומרים לתנועתיות ויסות משולבים, נויטרופילים בתיווך משלוח תרופות24 יכול להגדיל את התרופות ספציפיות, ובכך להקטין תופעות לוואי.

עם זאת, ניתן לשלב שינויים נוספים כדי להרחיב את היישום של האמור הנ ל. לדוגמה, במודל העכבר AA, כדי לקבל את הרושם הכללי של חדירה של תאים דלקתיים במפרק, החוקרים מעודדים מפרקים אנזיציציאני לשחרר את האוכלוסיות התושב המקומי ולאחר מכן להחיל cy, הזרימה לספור האוכלוסיות.

הפרוטוקולים להלן כוללים שלוש דרכים להעריך הגירה נויטרופילים והסתננות. היישום של פרוטוקולים אלה שימושי לגילוי טיפולים פוטנציאליים עבור RA ומחלות דלקתיות אחרות מעורבים נויטרופילים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (הענקת מספרים 81430099 ו 31500704), שיתוף פעולה בינלאומי ופרויקטים Exchange (גרנט מספר 2014DFA32950), ואת תוכנית המחקר של אוניברסיטת בייג של הרפואה הסינית ( הענק מספרים BUCM-2019-JCRC006 ו 2019-איבב-TD013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Fast Green Solution Solarbio 8348b Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining Solution Solarbio 8348a Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 Sigma 324506 Sterile
100% Ethanol Beijing Chemical Works
100% Methanol Beijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-959-53A
23 G x 1 1/4" Needle BD 305120
26 G x 3/8" Needle BD 305110
3% bovine serum albumin (BSA) Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2 Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit ZSGB-BIO ZLI-9018
30 G x 1/2" Needle BD 305106
30% H2O2 Beijing Chemical Works
5 mL Syringe BD Z683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-432-22
50% Ethanol Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% Percoll Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% Ethanol Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% Percoll Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% Ethanol Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% Ethanol Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution Beyotime C0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase Antibody Abcam ab208670
Anti-Neutrophil Elastase Antibody Abcam ab21595
Automatic Hematology Analyzer Sysmex XS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml sigma 1002036152
Cover Slip CITOGLAS 10212432C
Dial Thickness Gauge Mitutoyo 7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL Sigma Z606340
Foetal Bovine Serum (FBS) Premium PAN P30-1302
Gas Anesthesia System ZS Dichuang ZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) PPLYGEN C1309 This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Hematoxylin Staining Solution ZSGB-BIO ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit Solarbio G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma 47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100× Invitrogen 1514022
Percoll GE Healthcare 10245207 Density gradient medium
Permeabilization Buffer Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose Peptone Oxoid 1865317
Retrieval Buffer Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHC Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHC Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758
RPMI-1640 Complete Medium RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL BD 328421
Slide CITOGLAS 10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP) Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch Assay Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
Xylene Beijing Chemical Works

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).

Tags

ביולוגיה סוגיה 156 נויטרופילים הגירה דלקת פרקים אימונוהיסטוכימיה פונץ ' אוויר כימוטקסיס
מזהה הגירה הסתננות של נויטרופילים בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., … More

Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., Huo, G., Jia, W., Huang, G., Xu, A. Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60543, doi:10.3791/60543 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter