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Biology

चूहों में न्यूट्रोफिल के प्रवास और घुसपैठ का पता लगाना

Published: February 6, 2020 doi: 10.3791/60543
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Biocontrol, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen (Zhongshan) University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम वीवो और इन विट्रो दोनों में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन और घुसपैठ का आकलन करने के लिए तीन तरीके पेश करते हैं । इन तरीकों का उपयोग न्यूट्रोफिल माइग्रेशन को लक्षित करने वाले होनहार चिकित्सा विज्ञान की खोज करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के एक प्रमुख सदस्य हैं और रोगजनकों और पैथोलॉजिकल भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के खिलाफ मेजबान रक्षा में निर्णायक भूमिका निभाते हैं। न्यूट्रोफिल साइटोकिन्स और केमोकिन्स के मार्गदर्शन के माध्यम से सूजन साइटों पर भर्ती किया जा सकता है। न्यूट्रोफिल की भारी घुसपैठ से अंधाधुंध ऊतक क्षति हो सकती है, जैसे रुमेटी गठिया (आरए) में। पेरिटोनियल एक्सुडेट से अलग किए गए न्यूट्रोफिल ट्रांसवेल या जिगमंड चैंबर में विट्रो में एक परिभाषित कीमोआकर्षितेंट, एन-फोरिल-मेट-ल्यू-पीएचई (एफएमएलपी) का जवाब देते हैं। हवा थैली प्रयोग का उपयोग वीवो में लिपोपॉलीसैकराइड (एलपीएस) की ओर न्यूट्रोफिल की कीमोटैक्सियों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। न्यायनिर्णयन-प्रेरित गठिया (एए) माउस मॉडल का उपयोग अक्सर आरए अनुसंधान में किया जाता है, और एंटी-मायोपेरोक्क्साइड (एमपीओ) या एंटी-न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) एंटीबॉडी के साथ संयुक्त वर्गों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला को मापने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है न्यूट्रोफिल घुसपैठ। इन तरीकों का उपयोग न्यूट्रोफिल माइग्रेशन को लक्षित करने वाले आशाजनक उपचारों की खोज करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल सबसे प्रचुर मात्रा में सफेद रक्त कोशिका हैं और मनुष्यों में पूरे सफेद रक्त कोशिका आबादी का 50−70% हिस्साहै 1। न्यूट्रोफिल तीव्र सूजन के दौरान प्राथमिक उत्तरदाताओं में से एक हैं। न्यूट्रोफिल को ऊतक-निवासी कोशिकाओं2,3,4द्वारा जारी साइटोकिन्स और केमोकिन्स के मार्गदर्शन के माध्यम से सूजन साइटों में भर्ती किया जा सकता है, जो न्यूट्रोफिल और संवहनी एंडोथेलियम कोशिकाओं की सतह पर कोशिका आसंजन अणुओं के बीच बातचीत द्वारा मध्यस्थता की जाती है5। न्यूट्रोफिल रक्षा की मेजबानी करने और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और अन्य ऊतक-हानिकारक अणुओं3,6की रिहाई के माध्यम से ऊतकको नुकसान पहुंचाने की उनकी शक्तिशाली क्षमता के कारण पैथोलॉजिकल भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में भूमिका निभाने के लिए मौलिक हैं।

पिछले अध्ययनों चूहों या मनुष्यों से कई न्यूट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । ओह एट अल. पूरे मानव रक्त7से मानव न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए एक घनत्व ढाल जुदाई विधि का प्रदर्शन किया । हालांकि, छोटे रक्त की मात्रा के कारण माउस रक्त से पर्याप्त न्यूट्रोफिल का अलगाव मुश्किल है। वैकल्पिक रूप से, बड़ी संख्या में शुद्ध और व्यवहार्य माउस न्यूट्रोफिल को माउस पेरिटोनियल तरल पदार्थ से प्राप्त किया जा सकता है, और इन शुद्ध न्यूट्रोफिल का उपयोग पूर्व वीवो का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें न्यूट्रोफिल घुसपैठ, प्रवासन, कीमोटैक्सिस, ऑक्सीडेटिव फट, साइटोकाइन और न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (नेट) उत्पादन8शामिल हैं। ट्रांसवेल ने9 या जिगमंड चैंबर परख10,11 का उपयोग विट्रो में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। एयर पाउच मॉडल का उपयोग वीवो में न्यूट्रोफिल के प्रवास और घुसपैठ का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। सबसे चमड़े के नीचे हवा थैली मॉडल भड़काऊ कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के लिए वीवो पशु मॉडल में एक सुविधाजनक है।

परंपरागत रूप से, न्यूट्रोफिल को सूजन के तीव्र चरणों में रोगजनक एलिमिनेटर माना जाता था। हालांकि, हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि न्यूट्रोफिल जटिल कोशिकाएं हैं जो विशेष कार्यों की एक महत्वपूर्ण विविधता का प्रदर्शन करती हैं। न्यूट्रोफिल कई प्रक्रियाओं जैसे तीव्र चोट और मरम्मत, ट्यूमरिजेनेसिस, ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया और पुरानी सूजन12,13 को विनियमित कर सकतेहैं। न्यूट्रोफिल अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी मिलाते हैं और बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओंको 14,15विनियमित कर सकते हैं । न्यूट्रोफिल की पर्याप्त कमी से मनुष्यों में मृत्यु या गंभीर इम्यूनोडेफिशिएंसी होती है और चूहों में न्यूट्रोफिल की कमी से मृत्यु हो जाती है, जबकि अंगों में न्यूट्रोफिल की अत्यधिक सक्रियता या भर्ती कई प्रतिरक्षा रोगों का कारण बनती है, जैसे रुमेटी गठिया (आरए) और प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमाटस (एसएलई)6। न्यूट्रोफिल आरए रोगियों के सिनोवियल द्रव में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाएं हैं। न्यूट्रोफिल क्षरण के माध्यम से माइएलोपेरोक्सिडेस (एमपीओ) और न्यूट्रोफिल इलास्टेस्टेस (एनई) की अत्यधिक मात्रा का उत्पादन करते हैं, जो उपास्थि क्षरण को बढ़ा देता है। एमपीओ एक पेरोक्सिडेस एंजाइम है जो मुख्य रूप से न्यूट्रोफिल16के कणिकाओं में व्यक्त किया जाता है । NE आर्टिकुलर उपास्थि विनाश17के साथ जुड़ा हुआ है । एमपीओ और एनई का उपयोग एआरए रोगियों के ऊतकों में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन और घुसपैठ की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

यह लेख वीवो और इन विट्रो दोनों में प्रेरित सामान्य न्यूट्रोफिल के प्रवास का मूल्यांकन करने के साथ-साथ माउस संयुक्त-विशिष्ट सूजन मॉडल में पैथोलॉजिकल न्यूट्रोफिल की घुसपैठ के लिए तीन पारंपरिक तरीके प्रदान करता है।

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Protocol

बीजिंग यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं की समीक्षा और मंजूरी दी गई ।

नोट: C57BL/6 चूहों (7-8 सप्ताह पुराने) का इस्तेमाल किया गया ।

1. न्यूट्रोफिल अलगाव

  1. पेरिटोनियल एक्सडेट कोशिकाओं का अधिग्रहण
    1. डीडीएच2ओ में ताजा 10% प्रोटेओस पेप्टोन समाधान तैयार करें। चूहों की संख्या के अनुसार आवश्यक मात्रा की गणना करें।
      नोट: चूहों की संख्या को एन के रूप में सेट करें, (2N +1) समाधान के mL को पहले से भंग और फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
    2. 70% इथेनॉल के साथ कार्यक्षेत्र का छिड़काव करें। पेप्टोन समाधान और निर्वहन बुलबुले के 1 mL आकर्षित करने के लिए एक इंसुलिन इंजेक्टर का प्रयोग करें।
    3. प्रति माउस पेप्टोन समाधान के 1 मिलील के पहले इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का संचालन करें।
      1. माउस को एक हाथ से सिर के नीचे की स्थिति में पकड़ो। शराब से लथपथ कपास गेंदों के साथ इंजेक्शन स्थान कीटाणुरहित।
        नोट: पसंदीदा इंजेक्शन की स्थिति पेट के निचले बाएं या दाहिने चक्र के पार्श्व पहलू में निहित है।
      2. अभिकर्ताओं को तेजी से संचार दें। इंसुलिन इंजेक्टर के साथ प्रत्येक माउस के पेरिटोनियल गुहा में 1 मिलीएल इंजेक्ट करें।
        नोट: आंत या अन्य अंगों को घायल करने से बचने के लिए सुई और त्वचा के बीच का कोण लगभग 15−30 डिग्री होना चाहिए।
    4. भड़काऊ प्रतिक्रिया को रातोंरात विकसित करने की अनुमति दें। 12 घंटे के बाद, पहले इंजेक्शन के रूप में एक ही तरीके से दूसरा इंजेक्शन आचरण।
    5. दूसरे इंजेक्शन के तीन घंटे बाद, 2 एल/मिन की गति से गैस एनेस्थीसिया कक्ष में 5 मिन के लिए 5% आइसोफ्लोरीन के साथ चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज करें। कक्ष से एनेस्थेटाइज्ड चूहों को हटा दें और सर्वाइकल अव्यवस्था से उनका बलिदान करें।
      नोट: संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई कक्ष से एक श्वास इकाई में चूहों को ले जाने से पहले उंगलियों को चुटकी देकर सुनिश्चित की जाती है। पैरों को तब नहीं ले जाना चाहिए जब पैर ों पर चुटकी ली जाए।
      नोट: निम्नलिखित सभी चरणों को ऊतक संस्कृति हुड में संसाधित किया जाना चाहिए।
    6. माउस को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। माउस को बाँझ प्लास्टिक पैड पर रखें और सुइयों के साथ अंगों को ठीक करें।
    7. निचले पेट के बीच में क्षैतिज चीरा (~ 1 सेमी) बनाने के लिए सर्जिकल उपकरणों के बाँझ सेट का उपयोग करें। ऊपरी पेट की त्वचा को संदंश से उठाएं और पेट के मिडलाइन के साथ काट लें और बरकरार पेरिटोनियल दीवार को बेनकाब करें।
    8. बाँझ RPMI-1640 के 5 mL एक 30 जी x 1/2 सुई के साथ पेट गुहा में पूरा माध्यम सुई । सुई का सामना करना पड़ सुई के बेवल्ड किनारे के साथ पेरिटोनियल दीवार के माध्यम से सुई डालें और पूरी मात्रा इंजेक्ट करें।
    9. पैड को क्षैतिज रूप से 5 मिन के लिए हिलाएं। पेट की धीरे-धीरे कई बार मालिश करें।
    10. पेट के पार्श्व अंतरिक्ष में 23 जी x 1 1/4 "सुई इंजेक्ट करें। पेट तरल (~ 5 mL) निकालें और इसे 50 mL अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करें।
      नोट: न्यूट्रोफिल सक्रियण के मामले में जितनी जल्दी हो सके बर्फ पर ट्यूब रखें।
    11. पूर्ण माध्यम का एक और 5 मिलील इंजेक्ट करें और शेष कोशिकाओं को पेरिटोनम से हटाने की प्रक्रिया दोहराएं। 50 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में पेरिटोनियल तरल पदार्थ पूल करें।
    12. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मीटर के लिए 400 x ग्राम पर पूल्ड पेरिटोनियल तरल पदार्थ को सेंट्रलाइज करें।
    13. अधिस्थान त्यागें। आरपीएमआई-1640 पूर्ण माध्यम के 1 एमआईएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: न्यूट्रोफिल सक्रियण से बचने के लिए भंवर न करें।
  2. न्यूट्रोफिल का अलगाव
    1. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ताजा तैयार 70.2% घनत्व ढाल माध्यम (जैसे, Percoll) के 4 mL जोड़ें।
    2. ध्यान से 70.2% घनत्व ढाल माध्यम पर ताजा तैयार 54.8% घनत्व ढाल माध्यम के 4 मिलीएल धीरे-धीरे 15 mL अपकेंद्रित्र ट्यूब में तेज पिपेट युक्तियों के साथ ट्यूब के किनारे के साथ ओवरले।
      नोट: 54.8% घनत्व ढाल माध्यम और 70.2% घनत्व ढाल माध्यम के बीच इंटरफ़ेस को परेशान करने से बचने के लिए सावधानी बरतें।
    3. ध्यान से तेज पिपेट युक्तियों(चित्रा 1ए)के साथ धीरे-धीरे 54.8% घनत्व ढाल मध्यम परत के शीर्ष पर 1 mL पेरिटोनियल सेल निलंबन को ओवरले करें।
      नोट: सेल निलंबन और 54.8% घनत्व ढाल माध्यम के बीच इंटरफ़ेस को परेशान करने से बचने के लिए सावधानी बरतें।
    4. बिना ब्रेक लगाए 22 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    5. 54.8% घनत्व ढाल माध्यम और 70.2% घनत्व ढाल मध्यम परतों(चित्रा 1बी)के इंटरफेस पर न्यूट्रोफिल को एक नई ट्यूब पर एकत्र करें।
    6. एकत्र कोशिकाओं में आरपीएमआई-1640 पूर्ण माध्यम का 1 मिलील जोड़ें और कई बार धीरे-धीरे पाइपिंग करके कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक फिर से निलंबित करें। आरटी में 10 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और ध्यान से अतिशयोक्ति को हटा दें।
    7. वॉश स्टेप (स्टेप 1.2.6) को एक बार दोहराएं।
    8. गोली के लिए संस्कृति माध्यम के 0.5 mL जोड़ें और धीरे से कई बार पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित। एक स्वचालित हेमेटोलॉजी एनालाइजर का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक 50 μL aliquot ले लो।

2. न्यूट्रोफिल माइग्रेशन परख

  1. ट्रांसवेल परख9 या जिगमंड चैंबर परख द्वारा न्यूट्रोफिल प्रवास को मापें क्योंकि पहले10,11वर्णित थी ।

3. एयर पाउच परख

  1. पहला एयर इंजेक्शन
    1. 0 दिन पर, पूरी तरह से 2 L/min की गति से एक गैस संज्ञाहरण कक्ष में 3 मिन के लिए 5% isoflurane के साथ चूहों संज्ञाहरण, और 0.5 L/min की गति से 2% isoflurane के साथ एक ही श्वास इकाई में प्रत्येक माउस के संज्ञाहरण बनाए रखने।
      नोट: संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई कक्ष से एक श्वास इकाई में चूहों को ले जाने से पहले उंगलियों को चुटकी देकर सुनिश्चित की जाती है। पैरों को तब नहीं ले जाना चाहिए जब पैर ों पर चुटकी ली जाए।
    2. निष्फल हवा की 3 मिलील मात्रा प्राप्त करने के लिए 5 मिलील सिरिंज से जुड़े 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करें।
    3. चिमटी के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस की पीठ की त्वचा को उठाएं और 26 जी x 3/8 "सुई का उपयोग करके निष्फल हवा के 3 मिलीग्राम इंजेक्ट करें।
    4. उपचार के बाद, चूहों को श्वास इकाई से हटा दें। चूहों की निगरानी सुनिश्चित करने के लिए वे जीवित हैं जब तक कि वे चारों ओर जाना शुरू नहीं करते।
  2. दूसरा एयर इंजेक्शन
    1. 3 दिन, धारा 3.1 में वर्णित हवा की थैली को बनाए रखने के लिए पहले से स्थापित हवा की जेब में निष्फल हवा का एक अतिरिक्त 3 मिलील इंजेक्ट करें।
  3. उपचार
    1. बलिदान से पहले 6 दिन, 6 घंटे पर, हवा की थैली में विभिन्न उपचार इंजेक्ट करें। फास्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) का 1 मिलील नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इंजेक्ट करें। स्थानीय सूजन को प्रेरित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 1 μg/mL एलपीएस के 1 mL इंजेक्ट करें ।
    2. पूरी तरह से 2 L/min की गति से एक गैस संज्ञाहरण कक्ष में 3 मिन के लिए 5% isoflurane के साथ चूहों एनेस्थेटाइज, और 0.5 एल की गति से 2% isoflurane के साथ एक ही श्वास इकाई में प्रत्येक माउस के संज्ञाहरण बनाए रखने। सामग्री की तालिका केअनुसार धोने बफर तैयार करें।
      नोट: संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई कक्ष से एक श्वास इकाई में चूहों को ले जाने से पहले उंगलियों को चुटकी देकर सुनिश्चित की जाती है। पैरों को तब नहीं ले जाना चाहिए जब पैर ों पर चुटकी ली जाए।
    3. प्रत्येक हवा की थैली के लिए, हवा की थैली को 1 mL वॉश बफर से धोएं और 15 मीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में भड़काऊ एक्सयूडेट इकट्ठा करें। हवा की थैली को वॉश बफर 2x के 2 mL से धोएं और उसी अपकेंद्रित्र ट्यूब में भड़काऊ एक्सयूडेट इकट्ठा करें।
    4. आरटी में 10 मिन के लिए 100 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। 1 ग्राम वॉश बफर में सुपरनेटेंट को त्यागें और कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें। स्वचालित हेमेटोलॉजी एनालाइजर का उपयोग करके न्यूट्रोफिल अनुपात की मात्रा निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: चित्रा 2में प्रतिनिधि परिणाम देखें ।

4. adjuvant प्रेरित गठिया (ए.ए.) माउस मॉडल का शामिल

  1. कम से कम 5 एस भंवर द्वारा पूर्ण Freund के adjuvant (सीएफए) को निलंबित करें, फिर इंसुलिन इंजेक्टर में निलंबन के 100 माइक्रोन आकर्षित करें।
    नोट: हम बंध्यता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगों में पूरी तरह से नए सीएफए का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
  2. चरण 3.1.1 में वर्णित चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें।
  3. चुने हुए पंजा को चिह्नित करें और टखने के संयुक्त अंतरिक्ष में सीएफए के 20 माइक्रोन इंजेक्ट करें। चुने हुए पंजा (कुल में 80 μL) पर चार पेरिआर्टिकुलर स्पॉट में निलंबन के 20 μL इंजेक्ट करें।
  4. श्वास इकाई से चूहों को हटा दें और प्रसंस्कृत चूहों को एक नए कक्ष में रखें। चूहों की निगरानी यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे तब तक सांस ले रहे हैं जब तक कि वे स्थानांतरित करने की क्षमता हासिल न कर लें।
  5. हर 3 दिन में, जेब मोटाई गेज(चित्रा 3ए)का उपयोग करके टखने के संयुक्त व्यास को मापकर संयुक्त व्यास का आकलन करें।
  6. हर 3 दिन में, गठिया स्कोरिंग मापदंड(चित्रा 3सी):0, सामान्य, एरिथेमा और सूजन का कोई सबूत नहीं द्वारा गठिया की गंभीरता का आकलन करें; 1, सबसे हल्का गठिया, एरिथेमा और हल्की सूजन टार्सल या टखने के जोड़ तक ही सीमित है; 2, मध्यम गठिया, एरिथेमा और हल्की सूजन टखने से टार्सल तक फैली हुई है; 3, गंभीर गठिया, एरिथेमा और मध्यम सूजन टखने से प्रपदिकीय जोड़ों तक फैली हुई है; 4, सबसे गंभीर गठिया, एरिथेमा और गंभीर सूजन टखने, पैर और अंक, या अंग के एंकाइलोसिस शामिल हैं।

5. संयुक्त वर्गों के इम्यूनोहिस्टो केमिकल धुंधला

  1. संयुक्त अलगाव
    1. आइसोफ्लोरीन के साथ संज्ञाहरण के बाद सर्वाइकल अव्यवस्था का उपयोग करके धारा 4 में माउस का त्याग करें। माउस को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
    2. चिमटी और कैंची के साथ पिछले पैर से त्वचा और मांसपेशियों के हिस्से को हटा दें। 70% इथेनॉल के साथ संयुक्त स्प्रे करें और कागज के तौलिया का उपयोग करके बाकी मांसपेशियों को हटा दें।
    3. टी. डीक्कासिफाई में 2 दिनों के लिए टखने के जोड़ को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें। 1 महीने के लिए 10% ईटीए में संयुक्त को आरटी में बदलें और मीडियम वीकली बदलें।
    4. ऊतक को पैराफिन में एम्बेड करें और 4-μm-मोटी ऊतक अनुभाग तैयार करें।
      1. कुछ मात्रा के तरल पैराफिन के साथ एक चिह्नित मोल्ड में ऊतक रखें। संक्षेप में शांत करें।
      2. मोटाई को 4 माइक्रोमीटर पर सेट करें और माइक्रोटोम पर स्लाइस काट लें। 43 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में फ्लोट सेक्शन।
      3. स्लाइड पर अनुभाग माउंट और 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में स्लाइड डाल दिया. भविष्य के उपयोग के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइडका संरक्षण करें।
  2. सैफिन ओ और संयुक्त वर्गों के तेजी से हरे रंग का धुंधला
    नोट: निम्नलिखित धुंधला कदम आरटी में आयोजित कर रहे हैं।
    1. स्लाइड्स में रखें एक रैक में स्टेप 5.1.4.3 और आरटी पर रिहाइड्रेट के लिए निम्नलिखित वॉश करें: 5 मिन (3x), 2 मिन (2x) के लिए 100% इथेनॉल, 2 मिन के लिए 70% इथेनॉल, और 15 मिन के लिए 50% इथेनॉल।
    2. 5 मिन के लिए 0.1% फास्ट ग्रीन सॉल्यूशन में दाग। 10 एस के लिए 1% एसिटिक एसिड में कुल्ला करें।
    3. 20 मिन के लिए 0.1% सफ्राइन ओ धुंधला समाधान में दाग। निम्नलिखित वॉश में स्लाइड्स विसर्जित करें: 2 मिन (2x) के लिए 95% इथेनॉल, 2 मिन (2x) के लिए 100% इथेनॉल, और 2 मिन (2x) के लिए जाइलीन।
    4. ऊतक वर्गों माउंट और एक माइक्रोस्कोप के नीचे ऊतकों का निरीक्षण।
      नोट: चित्र 4एमें प्रतिनिधि छवियां देखें ।
  3. न्यूट्रोफिल की कल्पना करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला
    1. 78 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पैराफिन वर्गों सेंकना। स्लाइड्स को रैक में रखें और आरटी पर रिहाइड्रेट के लिए निम्नलिखित वॉश करें: 15 मिन (2x) के लिए जाइलीन, 5 मिन (2x) के लिए 100% इथेनॉल, 5 मिन के लिए 95% इथेनॉल, 5 मिन के लिए 80% इथेनॉल, 3 मिन के लिए एच2ओ, और 3 मिन के लिए पीबीएस।
      नोट: इस चरण के दौरान किसी भी समय स्लाइड को सूखने न दें।
    2. ऊतक को कवर करने के लिए परमीबिलाइजेशन बफर की एक बूंद जोड़ें। आर्द्रता नियंत्रित ट्रे में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट सेक्शन।
    3. 3 मिन (3x) के लिए PBS में स्लाइड कुल्ला । ऊतक को सीधे नकरने से बचें।
    4. प्रेशर बॉयलर का उपयोग करके गर्मी से प्रेरित एंटीजन एपिटोप रिट्रीवल करें।
      1. एक रैक में स्लाइड की व्यवस्था करें। पुनः प्राप्ति बफर से भरा दबाव बॉयलर में स्लाइड विसर्जित कर दिया।
      2. माइक्रोवेव ओवन पर प्रेशर बॉयलर लगाएं। 600 डब्ल्यू पर माइक्रोवेव ओवन सेट करें और 10 मिन के लिए स्लाइड गर्म करें।
      3. उबलने के बाद बॉयलर में स्लाइड ्स को 90 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा रखें। आगे की स्लाइड्स में देखें 3 मिन (3x) के लिए उन्हें पीबीएस में कुल्ला करें।
    5. 15 मिन (3x) के लिए पीबीएस में कुल्ला स्लाइड, 15 मिन (3x) के लिए आरटी पर हौसले से तैयार 3% एच2O2 में एंडोजेनस पेरोक्सिडाज गतिविधि को बुझाएं।
    6. एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ नमूने के चारों ओर एक बड़े सर्कल की रूपरेखा तैयार करें, नमूने को छूने से बचें। 60 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रता नियंत्रित कक्ष में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ ब्लॉक करें।
    7. अवरुद्ध समाधान निकालें। प्रत्येक खंड में पीबीएस-पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 माइक्रोन जोड़ें। इसके बाद रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रता नियंत्रित ट्रे में स्लाइड्स इनक्यूबेट करें।
      नोट: विभिन्न कमजोर पड़ने के अनुपात का उपयोग विभिन्न एंटीबॉडी (एमपीओ के लिए 1:25 और एनई के लिए 1:20) के लिए किया जाता है।
    8. दूसरे दिन ट्रे निकालकर 30 मिन के लिए आरटी पर खड़े होने दें। इसके बाद 3 मिन (3x) के लिए पीबीएस में स्लाइड्स खंगाल रहे हैं।
    9. ऊतक में पीबीएस-पतला द्वितीयक एंटीबॉडी के 50 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: विभिन्न कमजोर पड़ने के अनुपात लागू किए गए: एमपीओ के लिए 1:1,000 और एनई के लिए 1:1,500।
    10. 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रता नियंत्रित ट्रे में इनक्यूबेट स्लाइड। इसके बाद 3 मिन (3x) के लिए पीबीएस में स्लाइड्स खंगाल रहे हैं।
    11. 5 मिन के लिए पतला 3,3'-डायमानोबेंजिडीन (डीएबी) समाधान में विकसित करें। गहरे रंग के विकास के मामले में प्रतिक्रिया पर नजर रखें। स्लाइड्स में देखें आसुत पानी।
    12. आगे की स्लाइड्स में 10 एस के लिए हैमात्सीलिन 5 मिन के लिए नल के पानी में कुल्ला।
    13. 3 एस के लिए एसिड अल्कोहल सुपरफास्ट विभेदन समाधान में कुल्ला करें। फिर 10 मिन के लिए नल के पानी में कुल्ला करें।
    14. आगे की स्लाइड्स में देखें आरटी में: 5 मिन के लिए 80% इथेनॉल, 5 मिन के लिए 95% इथेनॉल, 5 मिन के लिए 100% इथेनॉल और 15 मिन (2x) के लिए जाइलीन। बढ़ते समाधान के साथ कवरस्लिप को ठीक करें। माइक्रोस्कोप के नीचे ऊतक का निरीक्षण करें।
      नोट: चित्र4बीमें प्रतिनिधि छवियां देखें ।

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Representative Results

पेरिटोनियल एक्सुडेट कोशिकाओं को चूहों के लैवेज तरल पदार्थ से एकत्र किया गया था। कोशिकाओं को RPMI-१६४० पूर्ण माध्यम के 1 mL में फिर से निलंबित कर दिया गया, एक दो कदम पर स्तरित (५४.८%/70.2%) 30 मिन के लिए 1,500 x ग्राम पर अवनिय घनत्व ढाल(चित्रा 1ए),और सेंट्रलाइज्ड 30 00 0. न्यूट्रोफिल्स (95%, ~ 1 x 107 न्यूट्रोफिल/माउस) निचले इंटरफ़ेस(चित्रा 1बी)से बरामद किए गए।

वीवो(चित्रा 2ए)में एलपीएस द्वारा उत्तेजित न्यूट्रोफिल भर्ती की जांच के लिए एयर पाउच प्रयोग किए गए थे। एयर पाउच एक्सयूडेट्स में ल्यूकोसाइट सबसेट मापा गया था(चित्रा 2बी)।

आरए में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन का मूल्यांकन सीएफए-प्रेरित गठिया मूत्र मॉडल के माध्यम से किया गया था। नियंत्रण समूह के साथ तुलना में, ए. ए. समूह पंजा में महत्वपूर्ण एडीमा दिखाया । ए. ए. समूह में, टखने के संयुक्त व्यास में वृद्धि हुई(चित्रा 3बी)और गठिया स्कोर लगातार गुलाब(चित्रा 3डी)।

उपास्थि क्षति आरए का प्रतिनिधि सिंड्रोम है, एए माउस में उपास्थि क्षति का आकलन करने के लिए सैफनिन ओ-फास्ट ग्रीन कार्टिलेज धुंधला किया गया था। जैसा कि चित्र 4एमें दिखाया गया है, सीएफए चैलेंज ने बड़ी मात्रा में ल्यूकोसाइट घुसपैठ, महत्वपूर्ण उपास्थि क्षरण और सिनोवियल हाइपरप्लासिया को प्रेरित किया। एमपीओ और एनई अभिव्यक्ति का स्तर न्यूट्रोफिल घुसपैठ के प्रतिनिधि मार्कर हैं। जोड़ों में न्यूट्रोफिल घुसपैठ का पालन करने के लिए इम्यूनोहिस्टो रासायनिक परख ों का प्रदर्शन किया गया । संयुक्त खंड(चित्रा 4बी)में एमपीओ और एनई अभिव्यक्ति को काफी बढ़ा दिया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: न्यूट्रोफिल अलगाव। (A)पेरिटोनियल एक्सुडेट कोशिकाओं को आरपीएमआई-1640 पूर्ण माध्यम के 1 मिलील में पुनः निलंबित किया गया था, जो दो चरण (54.8%/70.2%) असतत घनत्व ढाल। (ख)30 मिन के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड होने के बाद न्यूट्रोफिल (95%, ~ 1 x 107 न्यूट्रोफिल/माउस) लोअर इंटरफेस से बरामद किए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: हवा थैली परख के प्रतिनिधि परिणाम । (A)हवा की थैली परख का चित्रण। (ख)एयर पाउच परख में ल्यूकोसाइट सबसेट घुसपैठ के प्रतिनिधि परिणाम । पीबीएस: नियंत्रण; एलपीएस: 1 μg/mL एलपीएस । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: न्यायप्रेरित गठिया (ए.ए.) माउस मॉडल के प्रतिनिधि परिणाम। (क)टखने के संयुक्त व्यास को जेब मोटाई गेज का उपयोग करके मापा गया था। (ख)टखने के संयुक्त व्यास (एन = 7) के आधार पर संयुक्त सूजन का आकलन किया गया। (ग)प्रत्येक गठिया स्कोर की तस्वीरें । (D)गठिया की गंभीरता को 0−4 अंक (एन = 7) के पैमाने पर वर्गीकृत किया गया था। डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: नियंत्रण और ए. ए. चूहों से संयुक्त वर्गों के सैफराइन ओ-फास्ट ग्रीन उपास्थि धुंधला और इम्यूनोहिस्टो रासायनिक परख के प्रतिनिधि परिणाम। (क)संयुक्त वर्गों के सैफनिन ओ-फास्ट ग्रीन उपास्थि के प्रतिनिधि परिणाम । (ख)टखने के जोड़ों में बीपीओ और एनई के अभिव्यक्ति स्तर के प्रतिनिधि परिणाम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

परिधीय रक्त7,अस्थि मज्जा और ऊतकों18 से अत्यधिक शुद्ध न्यूट्रोफिल के विस्तृत प्रोटोकॉल लंबे समय से उपलब्ध हैं। यहां हम पेरिटोनियल द्रव19 से न्यूट्रोफिल को अलग करने की एक विधि अपनाते हैं जिसमें परिपक्व न्यूट्रोफिल आगे विरोधी भड़काऊ और एंटीऑक्सीडेंट अध्ययन के लिए निष्क्रिय रहते हैं।

हमने वीवो में न्यूट्रोफिल की एलपीएस-प्रेरित घुसपैठ का पता लगाने के लिए एयर पाउच प्रयोग का उपयोग किया। वीवो में सामान्य भड़काऊ वातावरण में सीधे सेल घुसपैठ को मापने के लिए इस विधि को संभावित विधि के रूप में प्रस्तावित किया गया है।

यह उल्लेखनीय है कि एयर पाउच परख केवल एक अंग-गैर विशिष्ट तरीके से न्यूट्रोफिल के कार्य को दर्शाता है और ल्यूकोसाइट भर्ती झरना के कई कदम ों को हटा देता है। चूंकि विशिष्ट अंगों में न्यूट्रोफिल भर्ती विभिन्न अंग गुणों, आसंजन अणुओं और केमोकिनपर भरोसा कर सकती है, अंग-विशिष्ट स्थितियों में न्यूट्रोफिल कार्यात्मक स्थिति की खोज करना उस भूमिका का अध्ययन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है जो न्यूट्रोफिल संभावित रूप से कुछ बीमारियों3में खेलते हैं। यह सुझाव दिया गया है कि न्यूट्रोफिल घुसपैठ की जांच के लिए एंडपॉइंट मॉडल की आवश्यकता है। इसलिए, ए. ए. मॉडल में चूहों के संयुक्त वर्गों पर इम्यूनोहिस्टो केमिकल धुंधला प्रदर्शन संयुक्त अंतरिक्ष में न्यूट्रोफिल पर एक व्यावहारिक परिप्रेक्ष्य प्रदान कर सकता है। हमारे आंकड़ों के अनुसार, न्यूट्रोफिल की विशाल संख्या संयुक्त ऊतक में भर्ती की जाती है और आरए के इलाज के लिए न्यूट्रोफिल की घुसपैठ में बाधा डालने पर आगे अनुसंधान के लिए मौलिक सबूत के रूप में काम करती है । इसके अलावा, व्यापक परख, उदाहरण के लिए, safranin ओ तेजी से हरे रंग धुंधला, आगे के अध्ययन के लिए रोग मॉडल का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैं ।

न्यूट्रोफिल भड़काऊ कोशिकाओं में घुसपैठ करने का प्रमुख सबसेट हैं और रोगजनकों या ऊतक चोट पर हमला करने के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में काम करते हैं20,21। यदि न्यूट्रोफिल बड़ी संख्या में ऊतकों में घुसपैठ करते हैं, तो साइटोकिन्स और एनईटीएस के उच्च स्तर स्रावित होते हैं, जो एक साथ ऊतकों में सुरक्षात्मक तंत्र को अभिभूत कर सकते हैं और ऊतक ों को नुकसान पहुंचा सकते हैं। ऊतक चोट आगे न्यूट्रोफिल घुसपैठ को उत्तेजित करती है, इस प्रकार एक दुष्चक्र22बनाने । लिम्फोड अंगों में सक्रिय कोशिकाओं को फंसाने के माध्यम से सेल माइग्रेशन में हस्तक्षेप करना एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है और इसे विभिन्न दुष्प्रभावों के साथ नैदानिक परीक्षणों में लागू किया गया है। न्यूट्रोफिल माइग्रेशन और भड़काऊ गतिविधि को समवर्ती रूप से विनियमित करने के लिए एक उपन्यास उपचार की खोज भविष्य में भड़काऊ रोगों के इलाज के लिए एक आशाजनक रणनीति है। इसके अलावा, यदि गतिशीलता-विनियमन एजेंटों को संयुक्त किया जाता है, तो न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता वाली दवा वितरण24 दवा विशिष्टता को बढ़ा सकता है, इस प्रकार दुष्प्रभाव कम हो सकता है।

हालांकि, उपरोक्त परखों के आवेदन को व्यापक बनाने के लिए आगे संशोधनों को जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, ए. ए. माउस मॉडल में, संयुक्त में भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ की समग्र छाप प्राप्त करने के लिए, शोधकर्ताओं को निवासी ल्यूकोसाइट आबादी को जारी करने के लिए उत्साहपूर्वक जोड़ों को पचाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है और फिर गिनती करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री लागू करते हैं आबादी।

इसमें प्रोटोकॉल में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन और घुसपैठ का आकलन करने के तीन तरीके शामिल हैं । इन प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग आरए और न्यूट्रोफिल से जुड़े अन्य भड़काऊ रोगों के लिए संभावित उपचार की खोज के लिए उपयोगी है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ८१४३००९९ और ३१५००७०४), अंतरराष्ट्रीय सहयोग और विनिमय परियोजनाओं (अनुदान संख्या २०१४DFA32950), और बीजिंग चीनी चिकित्सा विश्वविद्यालय के अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था ( अनुदान संख्या BUCM-2019-JCRC006 और 2019-JYB-TD013) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Fast Green Solution Solarbio 8348b Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining Solution Solarbio 8348a Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 Sigma 324506 Sterile
100% Ethanol Beijing Chemical Works
100% Methanol Beijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-959-53A
23 G x 1 1/4" Needle BD 305120
26 G x 3/8" Needle BD 305110
3% bovine serum albumin (BSA) Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2 Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit ZSGB-BIO ZLI-9018
30 G x 1/2" Needle BD 305106
30% H2O2 Beijing Chemical Works
5 mL Syringe BD Z683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-432-22
50% Ethanol Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% Percoll Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% Ethanol Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% Percoll Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% Ethanol Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% Ethanol Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution Beyotime C0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase Antibody Abcam ab208670
Anti-Neutrophil Elastase Antibody Abcam ab21595
Automatic Hematology Analyzer Sysmex XS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml sigma 1002036152
Cover Slip CITOGLAS 10212432C
Dial Thickness Gauge Mitutoyo 7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL Sigma Z606340
Foetal Bovine Serum (FBS) Premium PAN P30-1302
Gas Anesthesia System ZS Dichuang ZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) PPLYGEN C1309 This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Hematoxylin Staining Solution ZSGB-BIO ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit Solarbio G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma 47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100× Invitrogen 1514022
Percoll GE Healthcare 10245207 Density gradient medium
Permeabilization Buffer Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose Peptone Oxoid 1865317
Retrieval Buffer Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHC Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHC Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758
RPMI-1640 Complete Medium RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL BD 328421
Slide CITOGLAS 10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP) Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch Assay Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
Xylene Beijing Chemical Works

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References

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जीव विज्ञान अंक 156 न्यूट्रोफिल माइग्रेशन गठिया इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एयर पंच कीमोटैक्सिस
चूहों में न्यूट्रोफिल के प्रवास और घुसपैठ का पता लगाना
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Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., … More

Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., Huo, G., Jia, W., Huang, G., Xu, A. Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60543, doi:10.3791/60543 (2020).

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