Summary
Здесь мы представляем три метода оценки миграции нейтрофилов и инфильтрации как in vivo, так и in vitro. Эти методы могут быть использованы для обнаружения перспективных терапевтических препаратов, направленных на нейтрофилов миграции.
Abstract
Нейтрофилы являются одним из основных членов врожденной иммунной системы и играют ключевую роль в защите хозяина от патогенных микроорганизмов и патологических воспалительных реакций. Нейтрофилы могут быть завербованы в места воспаления с помощью цитокинов и хемокинов. Подавляющее проникновение нейтрофилов может привести к неизбирательному повреждению тканей, например, при ревматоидном артрите (РА). Нейтрофилы, изолированные от перитонеального эксцудата, реагируют на определенный химиоатант, N-формо-Мет-Леу-Пхе (fMLP), in vitro в Трансуэлле или Цигмонде камеры анализов. Эксперимент воздушной сумки может быть использован для оценки химиотаксиса нейтрофилов по отношению к липополисахариду (LPS) in vivo. Адъювантный индуцированный артрит (АА) мышь модель часто используется в исследовании РА, и иммуногистохимическое окрашивание совместных секций с анти-миелопероксидазы (MPO) или антитела антитела антибактериальных антитела антибактериальных антитела митрофилов (NE) является устоявшимся методом для измерения нейтрофил инфильтрации. Эти методы могут быть использованы для обнаружения перспективных методов лечения, направленных на нейтрофилов миграции.
Introduction
Нейтрофилы являются наиболее распространенными белыми кровяных телец и составляют 50-70% всей популяции белых кровяных клеток у людей1. Нейтрофилы являются одним из основных ответчиков во время острого воспаления. Нейтрофилы могут быть завербованы в места воспаления с помощью руководства цитокинов и хемокинов, выделяемых клетками-резидентамитканей2,3,4, который опосредован взаимодействиями между молекулами клеточной адгезии на поверхности нейтрофилов и сосудистых эндотелиевых клеток5. Нейтрофилы имеют основополагающее значение для размещения обороны и играют роль в патологических воспалительных реакций из-за их мощной способности повредить ткани через выпуск реактивных видов кислорода (ROS) и других тканей повреждения молекул3,6.
Предыдущие исследования описали несколько протоколов изоляции нейтрофилов от мышей или людей. Oh et al. продемонстрировали метод разделения градиента плотности для изоляции человека нейтрофилов от всей человеческой крови7. Однако, изоляция достаточного нейтрофилов из крови мыши затруднена из-за малого объема крови. Кроме того, большое количество чистых и жизнеспособных нейтрофилов мыши могут быть получены из мыши перитонеальной жидкости, и эти очищенные нейтрофилы могут быть использованы ex vivo для изучения нескольких аспектов клеточных функций ex vivo, в том числе нейтрофилов инфильтрации, миграции, хемотаксиса, окислительного всплеска, цитокина и нейтрофила внеклеточной ловушки (NET) производства8. Трансуэлл анализирует9 или Зигмонд камеры анализы10,11 могут быть использованы для оценки миграции нейтрофилов в пробирке. Модель воздушной сумки используется для оценки миграции и инфильтрации нейтрофилов in vivo. Подкожная модель воздушного мешка является удобной моделью in vivo для изучения миграции воспалительных клеток.
Традиционно нейтрофилы считались возбудителями в острых фазах воспаления. Однако последние результаты показали, что нейтрофилы являются сложными клетками, которые выполняют значительное разнообразие специализированных функций. Нейтрофилы могут регулировать многие процессы, такие как острая травма и ремонт, опухолевое, аутоиммунные реакции, и хроническое воспаление12,13. Нейтрофилы также модулировать адаптивные иммунные реакции и может регулировать В-клеток и Т-клеток14,15. Существенная нехватка нейтрофилов приводит к смертности или тяжелой иммунодефициту у людей и истощению нейтрофилов у мышей приводит к летальному исходу, в то время как чрезмерная активация или вербовка нейтрофилов в органы вызывает несколько иммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (РА) и системная эритематоза волчанки (СКВ)6. Нейтрофилы являются наиболее распространенными клетками в синовиальной жидкости пациентов РА. Нейтрофилы производят чрезмерное количество миелопероксидаза (MPO) и нейтрофил эластаза (NE) через деградацию, которая усугубляет эрозию хряща. MPO является ферментом пероксидаза в основном выражается в гранулы нейтрофилов16. NE связан с разрушением суставного хряща17. MPO и NE могут быть использованы для оценки состояния миграции нейтрофилов и инфильтрации в ткани пациентов РА.
Данная статья содержит три традиционных метода оценки миграции нормальных нейтрофилов, индуцированных как в виво, так и in vitro, а также проникновение патологических нейтрофилов в модель воспаления сустава мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены Пекинским университетом китайской медицины по уходу за животными и использованием комитета.
ПРИМЕЧАНИЕ: C57BL/6 мышей (7-8 недель) были использованы.
1. Нейтрофилов изоляция
- Приобретение перитонеальных эксследуетитных ячеек
- Приготовьте свежий 10% протеоз пептон раствор в ddH2O. Рассчитайте объем, необходимый в зависимости от количества мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установить количество мышей, как N, (2N'1) мл раствора должны быть распущены и отфильтрованы заранее. - Спрей рабочее пространство с 70% этанола. Используйте инсулиновый инжектор, чтобы нарисовать 1 мл пептоновой раствора и разрядить пузырьки.
- Проведите первую интраперитонеальную инъекцию 1 мл пептоновой раствора на мышь.
- Захватите мышь в голову вниз позиции с одной стороны. Дезинфицировать инъекционное место с помощью пропитанных алкоголем ватных шариков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительное положение инъекций лежит в боковом аспекте нижнего левого или правого квадранта живота. - Настоять реагенты быстро. Введите 1 мл в полость перитонеальной полости каждой мыши с помощью инсулинового инжектора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Угол между иглой и кожей должен быть примерно 15–30 градусов, чтобы избежать травм кишечника или других органов.
- Захватите мышь в голову вниз позиции с одной стороны. Дезинфицировать инъекционное место с помощью пропитанных алкоголем ватных шариков.
- Разрешить воспалительные реакции развиваться в одночасье. После 12 ч проведите вторую инъекцию так же, как и первую инъекцию.
- Через три часа после второй инъекции полностью анестезируйте мышей 5%-ным изофлураном в течение 5 мин в камере газовой анестезии со скоростью 2 л/мин. Удалите обезболиваенных мышей из камеры и пожертвуйте ими путем вывиха шейки матки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточная глубина анестезии обеспечивается защипыванием ног перед перемещением мышей из камеры в единый дыхательный аппарат. Ноги не должны двигаться, когда ноги ущипнул.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги должны быть обработаны в капюшоне культуры ткани. - Спрей мыши с 70% этанола. Положите мышь на стерильную пластиковую подушечку и зафиксировать конечности с помощью игл.
- Используйте стерильный набор хирургических инструментов, чтобы сделать горизонтальный разрез (1 см) в середине нижней части живота. Поднимите кожу верхней части живота с помощью щипков и разрезать вдоль средней линии живота и подвергать нетронутыми брюшной стенки.
- Введите 5 мл стерильной RPMI-1640 полной среды в брюшной полости с 30 G х 1/2 "иглы. Вставьте иглу через стенку перитонея с сбитом края иглы вверх и введите весь том.
- Встряхните площадку горизонтально в течение 5 мин. Массаж живота мягко несколько раз.
- Введите 23 G х 1 1 /4 "иглы в боковое пространство живота. Извлеките брюшную жидкость (5 мл) и соберите ее в 50 мл центрифуги трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубки на лед как можно скорее в случае активации нейтрофилов. - Введите еще 5 мл полной среды и повторите процедуру, чтобы удалить оставшиеся клетки из перитонеума. Бассейн перитонеальной жидкости в 50 мл центрифуги трубки.
- Центрифуга объединенной перитонеальной жидкости на 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
- Отбросьте супернатант. Resuspend клетки в 1 мл RPMI-1640 полной среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихрь, чтобы избежать активации нейтрофилов.
- Приготовьте свежий 10% протеоз пептон раствор в ddH2O. Рассчитайте объем, необходимый в зависимости от количества мышей.
- Изоляция нейтрофилов
- Добавьте 4 мл свежеприготовленной 70,2% градиентной среды плотности (например, Percoll) в 15 мл центрифуги трубки.
- Тщательно наложить 4 мл свежеприготовленных 54,8% плотности градиента среды на 70,2% плотности градиент ажиотажа среды медленно вдоль края трубки с острыми наконечниками пипетки в 15 мл центрифуги трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Упражнение осторожность, чтобы избежать нарушения интерфейса между 54,8% плотность градиента среды и 70,2% плотность градиента среды. - Тщательно наложить 1 мл перитонеальной клеточной подвески на верхней части 54,8% плотности градиент среднего слоя медленно с острыми кончиками пипетки(Рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Упражнение осторожность, чтобы избежать нарушения интерфейса между подвеской ячейки и 54,8% плотности градиента среды. - Центрифуга при 1500 х г в течение 30 мин при 22 градусах Цельсия без торможения.
- Соберите нейтрофилов на стыке 54,8% плотности градиента среднего и 70,2% плотности градиентсреднего слоя(рисунок 1B) в новую трубку.
- Добавьте 1 мл RPMI-1640 полной среды к собранным клеткам и тщательно resuspend клетки мягко pipetting несколько раз. Центрифуга при 100 х г в течение 10 мин на RT и тщательно удалить супернатант.
- Повторите шаг стирки (шаг 1.2.6) один раз.
- Добавьте 0,5 мл культуры среды к гранулы и resuspend клетки мягко pipetting несколько раз. Возьмите 50 qL aliquot для подсчета клеток с помощью автоматического гематолога анализатор.
2. Нейтрофил миграции анализ
- Измерение нейтрофилов миграции Transwell анализ9 или Зигмонд камеры анализа, как ранее описано10,11.
3. Воздушный мешок асссе
- Первая впрыска воздуха
- На 0 день полностью обезболивайте мышей с 5% изофлураном в течение 3 мин в камере газовой анестезии со скоростью 2 л/мин, и поддерживать анестезию каждой мыши в одном дыхательном блоке с 2% изофлураном со скоростью 0,5 л/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточная глубина анестезии обеспечивается защипыванием ног перед перемещением мышей из камеры в единый дыхательный аппарат. Ноги не должны двигаться, когда ноги ущипнул. - Используйте фильтр 0,22 мкм, прикрепленный к шприцу 5 мл, чтобы получить объем стерилизованного воздуха в 3 мл.
- Поднимите заднюю кожу анестезируемых мышей пинцетом и подкожно введите 3 мл стерилизованного воздуха с помощью иглы 26 G x 3/8.
- После лечения выньте мышей из дыхательного аппарата. Мониторинг мышей, чтобы убедиться, что они живы, пока они не начинают двигаться вокруг.
- На 0 день полностью обезболивайте мышей с 5% изофлураном в течение 3 мин в камере газовой анестезии со скоростью 2 л/мин, и поддерживать анестезию каждой мыши в одном дыхательном блоке с 2% изофлураном со скоростью 0,5 л/мин.
- Вторая впрыска воздуха
- На 3-й день введите дополнительно 3 мл стерилизованного воздуха в ранее установленный воздушный карман для поддержания воздушной сумки, как описано в разделе 3.1.
- Лечения
- На день 6, 6 ч до жертвы, вводить различные процедуры в воздушный мешок. Вводят 1 мл фосфатно-буферного солья (PBS) в качестве отрицательного контроля. Вводят 1 мл 1 мл 1 мг/мл ЛПС в качестве положительного контроля, чтобы вызвать местное воспаление.
- Полностью анестезируют мышей с 5% изофлураном в течение 3 мин в камере газовой анестезии со скоростью 2 л/мин, и поддерживать анестезию каждой мыши в одном дыхательном блоке с 2% изофлуран омовеном со скоростью 0,5 л/мин. Подготовьте буфер для мытья в соответствии с таблицей материалов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточная глубина анестезии обеспечивается защипыванием ног перед перемещением мышей из камеры в единый дыхательный аппарат. Ноги не должны двигаться, когда ноги ущипнул. - Для каждого воздушного мешка, мыть воздушный мешок с 1 мл мыть явки буфера и собирать воспалительные эксцудат в 15 мл центрифуги трубки. Вымойте воздушный мешок с 2 мл мыть буфера 2x и собирать воспалительные эксцудат в той же центрифуге трубки.
- Центрифуга при 100 х г в течение 10 мин на RT. Отбросьте супернатант и отбросите клетки в 1 мл буфера для мытья. Подсчитайте клетки, чтобы количественно соотношении нейтрофилов с помощью автоматического гематолога анализатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. репрезентативные результаты на рисунке 2.
4. Индукция адъювантного артрита (AA) мыши модели
- Приостановить полный адъювант Фрейнда (CFA) путем вихря по крайней мере 5 с, а затем обратить 100 л подвески в инсулин агтор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать совершенно новый CFA в экспериментах для обеспечения бесплодия. - Анестезия мышей, как описано в шаге 3.1.1.
- Отметьте выбранную лапу и введите 20 кЛ CFA в пространство сустава лодыжки. Введите 20 л суспензии в четыре периартикулярных пятна на выбранной лапе (всего 80 л).
- Удалить мышей из дыхательного блока и положить обработанных мышей в новую камеру. Мониторинг мышей, чтобы убедиться, что они дышат, пока они не восстановить способность двигаться.
- Каждые 3 дня, оценить диаметр сустава путем измерения диаметра голеностопного сустава с помощью датчика толщины кармана(рисунок 3A).
- Каждые 3 дня, оценить тяжесть артрита артрит скоринга критерий(Рисунок 3C): 0, нормальный, никаких доказательств эритемы и отек; 1, мягкий артрит, эритема и мягкий отек ограничивается tarsals или голеностопного сустава; 2, умеренный артрит, эритема и мягкий отек простирается от лодыжки до тарсалов; 3, тяжелый артрит, эритема и умеренный отек простирается от лодыжки до плюсневой суставов; 4, самый тяжелый артрит, эритема и сильный отек охватывают лодыжки, ноги и цифры, или анкилоз конечности.
5. Иммуногистохимическое окрашивание суставных секций
- Совместная изоляция
- Пожертвуйте мышью в разделе 4, используя вывих шейки матки после анестезии с изофлюраном. Спрей мыши с 70% этанола.
- Удалите кожу и часть мышцы от задней ноги с помощью пинцета и ножниц. Спрей сустава с 70% этанола и удалить остальные мышцы с помощью бумажного полотенца.
- Исправить голеностопного сустава в 4% параформальдегида в течение 2 дней на RT. Decalcify сустава в 10% EDTA в течение 1 месяца на RT и изменить среде еженедельно.
- Встраивай ткань в парафин и приготовьте 4-мкм-толстые участки ткани.
- Поместите ткань в маркированную форму с определенным объемом жидкого парафина. Прохладный кратко.
- Установите толщину на 4 мкм и нарезать ломтиками на микротоме. Поплавок разделов в 43 градусов воды ванны.
- Установите секции на слайды и поставьте слайды в духовку при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 2 ч. Для использования в будущем, сохранить слайды при -20 градусов по Цельсию.
- Safranin O и быстрое зеленое окрашивание совместных секций
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги окрашивания проводятся на RT.- Поместите слайды со ступени 5.1.4.3 в стойку и выполните следующие стирания для регидратации на RT: ксилен для 5 мин (3x), 100% этанол для 2 мин (2x), 95% этанола для 2 мин (2x), 70% этанола для 2 мин, и 50% этанола в течение 15 минут.
- Пятно в 0,1% быстрый зеленый раствор в течение 5 мин. Промыть в 1% уксусной кислоты в течение 10 с.
- Пятно в 0,1% safranin O отомленное решение для 20 мин. Погрузите слайды в следующих моет: 95% этанола для 2 мин (2x), 100% этанола для 2 мин (2x), и ксилен для 2 мин (2x).
- Смонтировать участки тканей и наблюдать за тканями под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите репрезентативные изображения на рисунке 4A.
- Иммуногистохимическое окрашивание для визуализации нейтрофилов
- Выпекать парафин разделы для 2 ч при температуре 78 градусов по Цельсию. Поместите слайды в стойку и выполнить следующие моления для регидратации на RT: ксилен в течение 15 мин (2x), 100% этанола для 5 мин (2x), 95% этанола в течение 5 мин, 80% этанола в течение 5 мин, H2O в течение 3 мин, и PBS в течение 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте слайды высохнуть в любое время во время этого шага. - Добавьте одну каплю буфера пермяки, чтобы покрыть ткани. Инкубировать секции в подносе с контролем влажности при 37 градусах Цельсия.
- Промыть слайды в PBS в течение 3 мин (3x). Избегайте непосредственной промывки тканей.
- Выполните тепло-индуцированный антиген эпитоп поиска с помощью котла давления.
- Упорядочить слайды в стойке. Погружение слайдов в котле давления заполнены поисковым буфером.
- Положите котла давления на микроволновую печь. Установите микроволновую печь на 600 Вт и нагрейте горки в течение 10 минут.
- После кипячения держите слайды в котле, чтобы охладиться до 90 градусов по Цельсию. Выньте слайды и промойте их в PBS в течение 3 мин (3x).
- Утоление эндогенной пероксидаза деятельности в свежеприготовленных 3% H2O2 на RT в течение 15 мин. Промыть слайды в PBS в течение 3 мин (3x).
- Очертите большой круг вокруг образца гидрофобной ручкой, избегайте прикосновения к образцу. Блок с 3% бычьей сыворотки альбумина (BSA) в влажности контролируемой камере при 37 градусов по Цельсию в течение 60 минут.
- Удалить блокирующее решение. Добавьте 50 зЛ пневс-разбавленных первичных антител к каждому разделу быстро. Затем инкубировать слайды в влажности контролируемых лоток на 4 кв кв ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные коэффициенты разбавления используются для различных антител (1:25 для MPO и 1:20 для NE). - На второй день, вынуть лоток и дайте ему стоять на RT в течение 30 минут. Затем промыть слайды в PBS в течение 3 мин (3x).
- Добавьте в ткани 50 л вторичных антител, разбавленных ПБС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применялись различные коэффициенты разбавления: 1:1,000 для MPO и 1:1,500 для NE. - Инкубировать слайды в влажности контролируемых лоток на 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Затем промыть слайды в PBS в течение 3 мин (3x).
- Развивайте в разбавленном 3,3'-диаминобензидине (DAB) растворе в течение 5 мин. Следите за реакцией в случае развития темного цвета. Промыть горки в дистиллированной воде.
- Противокоесть горки в гематаклине в течение 10 с. Промыть горки в водопроводной воде в течение 5 мин.
- Промыть кислотным спиртом сверхбыструю дифференциацию раствором на 3 с. Затем промыть в водопроводной воде в течение 10 минут.
- Погрузите слайды в следующих моетнах на RT: 80% этанола в течение 5 мин, 95% этанола в течение 5 мин, 100% этанола в течение 5 мин, и ксилен в течение 15 мин (2x). Исправьте крышку с монтажным решением. Наблюдайте за тканью под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите репрезентативные изображения на рисунке 4B.
- Выпекать парафин разделы для 2 ч при температуре 78 градусов по Цельсию. Поместите слайды в стойку и выполнить следующие моления для регидратации на RT: ксилен в течение 15 мин (2x), 100% этанола для 5 мин (2x), 95% этанола в течение 5 мин, 80% этанола в течение 5 мин, H2O в течение 3 мин, и PBS в течение 3 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перитонеальные эксследуетато-клетки были собраны из лаважной жидкости мышей. Клетки были переложены в 1 мл RPMI-1640 полной среде, слоистых на двухступенчатой (54,8%/70,2%) градиент плотности(рисунок 1А),и центрифуг на 1500 х г в течение 30 мин. Нейтрофилы (95%, 1 х 107 нейтрофилов/мышь) были извлечены из нижнего интерфейса(рисунок 1B).
Воздушные сумки эксперименты были проведены для исследования нейтрофилов вербовки стимулировали LPS in vivo(Рисунок 2A). Подмножества лейкоцитов в эксудатах воздушной сумки были измерены(рисунок 2B).
Нейтрофил миграции в РА была оценена с помощью CFA индуцированного артрита мурин модели. По сравнению с контрольной группой, группа АА показала значительный отек лапы. В группе АА, диаметр голеностопного сустава увеличилось(Рисунок 3B) и артрит оценка выросла последовательно (Рисунок 3D).
Повреждение хряща является репрезентативным синдромом РА, Safranin O-быстрый зеленый хрящ окрашивание было выполнено для оценки повреждения хряща в мыши АА. Как показано на рисунке 4A, CFA вызов индуцированных большое количество инфильтрации лейкоцитов, значительные эрозии хряща и синовиальной гиперплазии. Уровни выражения MPO и NE являются репрезентативными маркерами нейтрофилов. Иммуногистохимические анализы проводились для наблюдения за нейтрофилинтом инфильтрации в суставы. MPO и NE выражение было значительно upregulated в совместном разделе (Рисунок 4B).
Рисунок 1: Нейтрофилов изоляция. (A)Перитональные эксудатные клетки, вновь приостановленные в 1 мл полной среды RPMI-1640, были наложены на двухступенчатую (54,8%/70,2%) прерывистое градиент плотности. (B) После центрифугирования при 1500 х г в течение 30 мин, нейтрофилы (95%, 1 х 107 нейтрофилов/мышь) были извлечены из нижнего интерфейса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные результаты исследования воздушной сумки. (A) Иллюстрация воздушного мешка асссе. (B) Представитель результаты инфильтрации подмнопов лейкоцитов в воздушном мешке асссе. PBS: контроль; LPS: 1 мкг/мл ЛПС. Данные представлены в виде среднего значения SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентатрезультатные результаты адъювантного артрита (АА) мышимодели. (A) Диаметр голеностопного сустава был измерен с помощью датчика толщины кармана. (B) Отек суставов был оценен на основе диаметра голеностопного сустава (n No 7). (C) Фотографии каждого артрита оценка. (D) Тяжесть артрита была оценена по шкале от 0 до 4 баллов (n No 7). Данные представлены в виде среднего значения SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель результаты safranin O-быстрый зеленый хрящ окрашивания и иммуногистохимический анализ совместных разделов от контроля и АА мышей. (A) Представитель результаты safranin O-быстрый зеленый хрящ окрашивания совместных секций. (B) Представитель результаты уровня экспрессии MPO и NE в голеностопных суставов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подробные протоколы высокоочищенных нейтрофилов из периферической крови7,костного мозга и тканей18 имеются в наличии в течение длительного времени. Здесь мы принимаем метод изоляции нейтрофилов из брюшной жидкости19, в котором зрелые нейтрофилы остаются инактивированными для дальнейших противовоспалительных и антиоксидантных исследований.
Мы использовали эксперимент воздушной сумки для изучения LPS-индуцированной инфильтрации нейтрофилов in vivo. Этот метод был предложен в качестве потенциального метода непосредственного измерения проникновения клеток в общую воспалительную среду in vivo.
Примечательно, что анализ воздушной сумки лишь демонстрирует функцию нейтрофилов в органно-неспецифическом виде и удаляет несколько ступеней каскада набора лейкоцитов. Так как набор нейтрофилов в конкретные органы может опираться на различные свойства органов, молекулы адгезии и хемокины, изучение функционального состояния нейтрофилов в конкретных условиях органа имеет большое значение для изучения роли, которую нейтрофилы потенциально играют при определенных заболеваниях3. Было высказано предположение, что модели конечных точек необходимы для расследования инфильтрации нейтрофилов. Таким образом, выполнение иммуногистохимических окрашивания на совместных участках мышей в модели АА может обеспечить глубокий взгляд на нейтрофилов в совместном пространстве. По нашим данным, огромное количество нейтрофилов завербовываются в ткани суставов и служат фундаментальным доказательством для дальнейших исследований по прерыванию инфильтрации нейтрофилов для лечения РА. Кроме того, для дальнейшего изучения необходимы комплексные анализы, например, safranin O-fast green sining.
Нейтрофилы являются основным подмножеством проникновения воспалительных клеток и работать в качестве первой линии защиты от вторжения патогенов или повреждениятканей 20,21. Если нейтрофилы проникают в ткани в больших количествах, выделяются высокие уровни цитокинов и NET, которые вместе могут перегрузить защитные механизмы в тканях и привести к повреждению тканей. Повреждение тканей еще больше стимулирует инфильтрацию нейтрофилов, образуя тем самым порочный круг22. Вмешательство в миграцию клеток с помощью захвата активированных клеток в лимфоидных органах было предложено в качестве важного терапевтического подхода и было применено в клинических испытаниях с различными побочными эффектами23. Открытие нового метода лечения одновременного регулирования миграции нейтрофилов и воспалительной активности является перспективной стратегией для лечения воспалительных заболеваний в будущем. Кроме того, если подвижность регулирующих агентов объединены, нейтрофил-опосредованные доставки наркотиков24 может увеличить специфичность препарата, тем самым уменьшая побочные эффекты.
Однако дальнейшие изменения могут быть объединены для расширения применения вышеупомянутых анализов. Например, в модели мыши АА, чтобы получить общее впечатление инфильтрации воспалительных клеток в суставе, исследователям рекомендуется ферментативно переваривать суставы, чтобы освободить популяции лейкоцитов, а затем применить цитометрию потока, чтобы подсчитать населения.
Протоколы включают в себя три способа оценки миграции и инфильтрации нейтрофилов. Применение этих протоколов полезно для обнаружения потенциальных методов лечения РА и других воспалительных заболеваний с участием нейтрофилов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант номера 81430099 и 31500704), международного сотрудничества и обмена проектов (грант номер 2014DFA32950), а также научно-исследовательская программа Пекинского университета китайской медицины ( номера гранта BUCM-2019-JCRC006 и 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
