Summary
ここでは、インビボとインビトロの両方で好中球の移動および浸潤を評価する3つの方法を紹介する。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療薬を発見するために使用することができる。
Abstract
好中球は、自然免疫系の主要なメンバーであり、病原体および病理的炎症反応に対する宿主防御において極めて重要な役割を果たす。好中球は、サイトカインとケモカインの指導を介して炎症部位にリクルートすることができます。好中球の圧倒的な浸潤は、関節リウマチ(RA)のような無差別組織損傷を引き起こす可能性があります。腹膜滲出物から単離された好中球は、規定の化学誘引剤、N-ホルミル-メット・レウフェ(fMLP)、インビトロイントランスウェルまたはジグモンドチャンバーアッセイに応答する。空気袋実験は、生体内のリポ多糖(LPS)に対する好中球の走化力を評価するために使用することができる。アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルはRA研究で頻繁に使用され、抗骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)または抗好中球エラスターゼ(NE)抗体を有する関節切片の免疫組織化学的染色は、十分に確立された測定方法である好中球浸潤。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療法を発見するために使用することができる。
Introduction
好中球は最も豊富な白血球であり、ヒト1の白血球集団全体の50〜70%を占める。好中球は、急性炎症時の主要な応答者の1つである。好中球は、組織常駐細胞2、3、4によって放出されるサイトカインおよびケモカインの誘導を介して炎症部位にリクルートすることができるが、これは好中球と血管内皮細胞5の表面上の細胞接着分子との相互作用によって媒介される。好中球は、防御をホストする基礎であり、活性酸素種(ROS)および他の組織損傷分子3、6の放出を介して組織に損傷を与える強力な能力のために、病理的炎症反応の役割を果たす。
これまでの研究では、マウスまたはヒトからの好中球分離プロトコルをいくつか記載している。Ohら、ヒト好中球を全ヒト血液7から単離する密度勾配分離法を実証した。しかし、マウスの血液から十分な好中球の分離は、血液量が少ないため困難である。あるいは、マウス腹膜液から多数の純粋で生存可能なマウス好中球を引き出し、これらの精製された好中球は、好中球浸潤、移行、走化、酸化バースト、サイトカインおよび好中球細胞外トラップ(NET)産生を含む細胞機能エクスビボのいくつかの側面を調べるためにex vivoを使用することができる。トランスウェルアッセイ9またはジグモンドチャンバーアッセイ10,11は、インビトロで好中球移行を評価するために使用することができる。エアポーチモデルは、生体内の好中球の移動および浸潤を評価するために使用されます。皮下エアポーチモデルは、炎症性細胞の遊散を研究するのに便利な生体内動物モデルである。
従来、好中球は炎症の急性期における病原体排除物質と考えられていた。しかし、最近の知見は、好中球が特殊な機能のかなりの多様性を実行する複雑な細胞であることを示しています。好中球は、急性損傷および修復、腫瘍形成、自己免疫応答、および慢性炎症12、13などの多くのプロセスを調節することができる。好中球はまた、適応免疫応答を調節し、B細胞およびT細胞14、15を調節することができる。好中球の大幅な不足は、ヒトの死亡率または重度の免疫不全をもたらし、マウスの好中球の枯渇は死亡につながるが、臓器中の好中球の過剰な活性化または募集は、関節リウマチ(RA)および全身性エリテマトーシス(SLE)6などのいくつかの免疫疾患を引き起こす。好中球は、RA患者の滑液中で最も豊富な細胞である。好中球は、軟骨侵食を悪化させる分解を介して、骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)および好中球エラスターゼ(NE)の過剰な量を生成します。MPOは、主に好中球16の顆粒に発現するペルオキシダーゼ酵素である。NEは、関節軟骨破壊17に関連している。MPOおよびNEは、RA患者の組織における好中球移動および浸潤の状態を評価するために使用することができる。
本稿は、インビボとインビトロの両方で誘導される正常な好中球の移動を評価する3つの従来の方法と、マウス関節特異的炎症モデルにおける病理学的好中球の浸潤を提供する。
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Protocol
すべての実験手順は、北京中華医学大学動物ケアおよび使用委員会によって審査され、承認されました.
注:C57BL/6マウス(7〜8週齢)を使用した。
1. 好中球の分離
- 腹膜滲出細胞の取得
- ddH2Oで新鮮な10%プロテオースペプトン溶液を準備し、マウスの数に応じて必要な量を計算します。
注:マウスの数をN、(2N+1)mLの溶液をあらかじめ溶解し、濾過する必要があります。 - 70%エタノールでワークスペースをスプレーします。インスリンインジェクターを使用して、1 mLのペプトン溶液と排出気泡を描画します。
- マウス1回につき1mLのペプトン溶液の最初の腹腔内注射を行う。
- 片手でマウスを頭下の位置につかみます。アルコール漬けの綿球で注射スポットを消毒します。
注:好ましい注射位置は、腹部の左下または右象限の側面にあります。 - 試薬を迅速に注入する。インスリンインジェクターを使用して各マウスの腹腔に1 mLを注入する。
注:針と皮膚の間の角度は、腸や他の臓器を傷つけられないように、約15〜30°でなければなりません。
- 片手でマウスを頭下の位置につかみます。アルコール漬けの綿球で注射スポットを消毒します。
- 炎症反応を一晩で発症させる。12時間後、第1の注射と同様に第2の注射を行う。
- 2回目の注射の3時間後、ガス麻酔室で5分間5分間のイソフルランを2L/分の速度で完全に麻酔し、麻酔したマウスをチャンバーから取り出し、子宮頸部脱臼によって犠牲にした。
注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。
注: 以下のすべての手順は、組織培養フードで処理する必要があります。 - マウスに70%エタノールを噴霧する。無菌プラスチックパッドの上にマウスを置き、針で手足を固定します。
- 下腹部の真ん中に水平切開(約1cm)を作るために外科用具の無菌セットを使用する。上腹部の皮膚を鉗子で持ち上げ、腹部の正中線に沿って切断し、無傷の腹膜を露出させる。
- 30 G x 1/2 インチ針で 5 mL の無菌 RPMI-1640 完全培地を腹腔に注入します。針の縁を上に向けて腹膜を通して針を挿入し、ボリューム全体を注入します。
- パッドを左右に振って5分間、腹部を数回やさしくマッサージします。
- 腹部の横のスペースに23 G x 1 1/4インチの針を注入します。腹部の液体(~5mL)を抽出し、50mLの遠心管に回収します。
注:好中球が活性化した場合は、できるだけ早くチューブを氷の上に置きます。 - 完全な培地の別の5 mLを注入し、腹皮から残りの細胞を除去するために手順を繰り返す。50 mL遠心管で腹膜液をプールします。
- プールされた腹膜液を室温(RT)で10分間400 x gで遠心します。
- 上清を捨てます。RPMI-1640完全培地の1 mLで細胞を再懸濁します。
注:好中球の活性化を避けるために渦を起かないでください。
- ddH2Oで新鮮な10%プロテオースペプトン溶液を準備し、マウスの数に応じて必要な量を計算します。
- 好中球の単離
- 作製した70.2%濃度勾配培地(例えば、パーコール)の4 mLを15mL遠心管に加える。
- 慎重に15 mL遠心管の鋭いピペットの先端と管の端に沿って70.2%の密度勾配媒体に作製した54.8%の密度勾配媒体の4 mLを重ね合わせなさい。
注: 54.8% 密度勾配媒体と 70.2% 密度勾配媒体の間のインターフェースを乱さないように注意してください。 - 54.8%密度勾配培地層の上に1mLの腹膜細胞懸濁液を慎重に重ね、鋭利なピペットチップを用いてゆっくりと重ねられます(図1A)。
注: セルサスペンションと54.8%密度勾配媒体との間のインターフェースを乱さないように注意してください。 - 1,500 x gでの遠心分離機(ブレーキをかけずに22°Cで30分間)
- 54.8% 密度勾配媒体の界面で好中球を集め、70.2% 密度勾配培地層 (図 1B) を新しいチューブに集めます。
- 採取した細胞にRPMI-1640完全培地1mLを加え、数回穏やかにピペットで細胞を慎重に再懸濁させる。RTで10分間100xgで遠心分離し、慎重に上清を取り除きます。
- 洗浄手順(ステップ1.2.6)を1回繰り返します。
- ペレットに0.5 mLの培養培地を加え、数回穏やかにピペットで細胞を再懸濁します。50 μLのアリコートを使用して、自動血液分析装置を使用して細胞をカウントします。
2. 好中球移動アッセイ
- トランスウェルアッセイ9またはジグモンドチャンバーアッセイによる好中球移行を、前述の10,11で測定する。
3. エアポーチアッセイ
- 初のエアインジェクション
- 0日目、ガス麻酔室で3分間のイソフルランを5%のマウスを2L/分の速度で完全に麻酔し、2%のイソフルランを0.5L/分の速度で1回の呼吸単位で各マウスの麻酔を維持する。
注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。 - 5 mLシリンジに取り付けられた0.22μmのフィルターを使用して、3 mLの殺菌空気を得ます。
- 麻酔マウスの背中の皮膚をピンセットで持ち上げ、26 G x 3/8インチ針を使用して3 mLの滅菌空気を皮下に注入します。
- 治療後、マウスを呼吸ユニットから取り出す。マウスが動き始めるまで、マウスが生きていることを確認します。
- 0日目、ガス麻酔室で3分間のイソフルランを5%のマウスを2L/分の速度で完全に麻酔し、2%のイソフルランを0.5L/分の速度で1回の呼吸単位で各マウスの麻酔を維持する。
- 第2空気注入
- 3日目に、セクション3.1で説明したように、エアポーチを維持するために、以前に確立されたエアポケットに殺菌空気の追加3 mLを注入します。
- 治療
- 6日目、6時間前に、エアポーチに異なる治療を注入する。陰性コントロールとして1 mLのリン酸緩衝生理食塩基(PBS)を注入する。1 μg/mL LPS の 1 mL を、局所炎症を誘発する陽性コントロールとして注入します。
- ガス麻酔室で5%のイソフルランを2L/分の速度で3分間完全に麻酔し、各マウスの麻酔を2%のイソフルランを2%の速度で単一の呼吸単位に維持する。
注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。 - 各エアポーチについて、1 mLの洗浄バッファーでエアポーチを洗浄し、15 mL遠心管で炎症性の滲出液を回収します。2 mLの洗浄バッファー2xでエアポーチを洗浄し、同じ遠心管内に炎症性滲出液を回収する。
- RTで10分間100xgで遠心分離し、上清を捨て、1 mLの洗浄バッファーに細胞を再懸濁します。 自動血液分析装置を用いて細胞を数えて好中球比を定量化する。
注 : 図2の代表的な結果を参照してください。
4. アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルの誘導
- 少なくとも5秒の渦を引くことによってフロイントのアジュバント(CFA)を中断し、インスリンインジェクターに100μLの懸濁液を引き込む。
注:私たちは、無菌性を確保するために実験で完全に新しいCFAを使用することをお勧めします。 - ステップ3.1.1で説明したマウスを麻酔する。
- 選択した足にマークを付け、20 μLのCFAを足首の関節空間に注入します。選択した足の4つの関節のスポット(合計で80μL)に20 μLの懸濁液を注入します。
- マウスを呼吸ユニットから取り出し、処理したマウスを新しいチャンバーに入れます。マウスを監視して、動く能力を取り戻すまで呼吸していることを確認します。
- 3日毎に、ポケット厚さゲージを用いて足首関節径を測定して関節径を評価する(図3A)。
- 3日ごと、関節炎の採点基準により関節炎の重症度を評価する(図3C):0、正常、紅斑および腫脹の証拠はない。1、最も軽度の関節炎、紅斑および軽度の腫脹は、眼底または足首関節に限定;2、中等度の関節炎、紅斑および軽度の腫脹は、足首から眼底に及ぶ;3、重度の関節炎、紅斑および中等度の腫脹は、足首から中足関節に及ぶ;4、最も重度の関節炎、紅斑および重度の腫脹は、四肢の足首、足および数字、またはアンキローシスを包含する。
5. 関節部の免疫学的染色
- 共同分離
- イソファフルランで麻酔後の子宮頸部脱臼を用いてセクション4でマウスを屠殺する。マウスに70%エタノールを噴霧する。
- 後ろ足から皮と筋肉の一部をピンセットとハサミで取り除きます。70%エタノールで関節をスプレーし、ペーパータオルを使用して筋肉の残りの部分を削除します。
- RTで2日間4%パラホルムアルデヒドで足首関節を固定し、RTで1ヶ月間10%EDTAで関節を脱灰し、毎週培地を交換します。
- 組織をパラフィンに埋め込み、4μmの厚さの組織切片を準備します。
- 液体パラフィンの特定のボリュームでマークされた金型に組織を配置します。簡単に冷却します。
- 厚さを4μmに設定し、マイクロトームでスライスをカットします。43°Cの水浴でフロートセクション。
- セクションをスライドに取り付け、スライドをオーブンのオーブンに2時間2時間置きます。今後の使用のために、-20 °Cでスライドを保存してください。
- サフラニンOと関節部の高速緑色染色
メモ:RTでは、次の染色手順を実施しています。- ステップ5.1.4.3のスライドをラックに入れ、RTで水分補給するために次の洗浄を行います:5分(3x)のキシレン、2分(2x)の100%エタノール、2分の95%エタノール、2分の70%エタノール、3分間の水道水の50%エタノール。
- 0.1%の速いグリーン溶液で5分間のグリーン溶液を染色し、10sの1%酢酸でリンス。
- 0.1%のサフラニンO染色液で20分間染色します。スライドを2分間95%エタノール(2x)、100%エタノール2分(2x)、キシレンを2分(2x)に浸します。
- 組織切片を取り付け、顕微鏡下で組織を観察する。
注 : 図4Aの代表的な画像を参照してください。
- 好中球を可視化する免疫体化学的染色
- パラフィンの部分を78°Cで2時間焼きます。スライドをラックに入れ、RTで水分補給するために次のワッシュを行います:15分(2x)のキシレン、5分(2x)の100%エタノール、5分間の95%エタノール、5分間の80%エタノール、3分間のH2O、3分間のPBS。
注: この手順の実行中は、スライドを乾かさないで下します。 - 浸透性バッファーの 1 滴を加えます。37 °Cの湿度制御トレイにセクションをインキュベートします。
- PBSで3分間(3倍)のスライドをすすいでください。組織を直接すすぐいは避けてください。
- 圧力ボイラーを使用して熱誘導抗原エピトープの検索を行います。
- ラック内にスライドを配置します。取得バッファで満たされた圧力ボイラーにスライドを浸します。
- 電子レンジに圧力ボイラーを置きます。電子レンジを600Wに設定し、スライドを10分間加熱します。
- 沸騰後、90°Cに冷却するためにボイラー内のスライドを保ちます。スライドを取り出し、PBSで3分間(3倍)すすいでください。
- クエンチ内因性ペルオキシダーゼ活性を、RTで3%H2O2で15分間RTで調製し、PBS中の3分間(3x)のリンススライドを行った。
- 疎水性ペンでサンプルの周りに大きな円を輪郭を描き、サンプルに触れないようにします。湿度制御チャンバー内の3%ウシ血清アルブミン(BSA)を37°Cで60分間ブロックします。
- ブロックソリューションを削除します。各セクションに50μLのPBS希釈一次抗体を素早く加える。次いで、湿度制御されたトレイ内のスライドを一晩4°Cでインキュベートする。
注: 異なる抗体に対しては、異なる希釈率が使用されます(MPO の場合は 1:25、NE の場合は 1:20)。 - 2日目にトレイを取り出し、RTに30分間放置します。次いで、3分間PBSでスライドを3分間リンスする。
- 50 μLのPBS希釈二次抗体を組織に加える。
注: MPO の場合は 1:1,000、NE の場合は 1:1,500 という異なる希釈率が適用されました。 - 37 °Cの湿度制御トレイで30分間滑り込みます。次いで、3分間PBSでスライドを3分間リンスする。
- 希釈3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液で5分間開発。暗い色が生まれた場合は反応に目を光らせておく。蒸留水でスライドをすすいでください。
- 10分間ヘマトキシリンのスライドをカウンターステインし、スライドを水道水で5分間リンスします。
- 3sの酸性アルコール超高速分化溶液中でリンス。その後、水道水で10分間すすいます。
- RTで次のワッシュにスライドを浸す:5分間80%エタノール、5分の95%エタノール、5分間の100%エタノール、15分(2x)のキシレン。取り付けソリューションでカバースリップを修正します。顕微鏡で組織を観察する。
注 : 図4Bの代表的なイメージを参照してください。
- パラフィンの部分を78°Cで2時間焼きます。スライドをラックに入れ、RTで水分補給するために次のワッシュを行います:15分(2x)のキシレン、5分(2x)の100%エタノール、5分間の95%エタノール、5分間の80%エタノール、3分間のH2O、3分間のPBS。
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Representative Results
腹膜滲出細胞はマウスの洗浄液から採取した。細胞をRPMI-1640完全培地の1 mLで再懸濁し、2段階(54.8%/70.2%)に重ね合わせた不連続な密度勾配(図1A)、および30分間の1,500 x gで遠心分離し(≥95%、~1 x107好中球/マウス)下界面から回収した(図1B)。
空気パウチ実験を行い、LPSin vivoによって刺激された好中球のリクルートメントを調べた(図2A)。エアポーチの白血球サブセットを滲出物で測定した(図2B)。
RAにおける好中球移行は、CFA誘発関節炎マウスモデルを介して評価した。対照群と比較して、AA群は足に有意な浮腫を示した。AA群では、足首関節の直径が大きくなり(図3B)、関節炎スコアが一貫して上昇しました(図3D)。
軟骨損傷はRAの代表的な症候群であり、AAマウスにおける軟骨損傷を評価するためにサフラニンO高速緑色軟骨染色が行われた。図4Aに示すように、CFAの課題は、大量の白血球浸潤、著しい軟骨浸食および滑膜過形成を誘発した。MPOおよびNE発現レベルは、好中球浸潤の代表的なマーカーである。関節の好中球浸潤を観察するために免疫ヒストケミカルアッセイを行った。MPOおよびNE発現は、関節部において有意にアップレギュレートされた(図4B)。
図1:好中球単離。(A)RPMI-1640完全培地の1 mLで再懸濁した腹膜滲出細胞を2段階(54.8%/70.2%)に重ね合わせた不連続な密度勾配。(B)30分間の1,500xgで遠心分離後、好中球(≥95%、~1 x107好中球/マウス)を下界面から回収した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:エアポーチアッセイの代表的な結果。(A) エアポーチアッセイのイラスト。(B) エアポーチアッセイにおける白血球サブセット浸潤の代表的な結果。PBS: コントロール;LPS: 1 μg/mL LPS.データは平均値として表示されます ± SD.この図の大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図3:アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルの代表的な結果。(A) 足首関節径をポケット厚さゲージを用いて測定した。(B) 関節の腫脹は、足首関節径(n=7)に基づいて評価した。(C) 各関節炎のスコアの写真。(D) 関節炎の重症度は0~4点(n=7)のスケールで採点した。データは平均値として表示されます ± SD.この図の大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図4:コントロールおよびAAマウスからの関節切片のサフラニンO高速緑色軟骨染色および免疫体化学的アッセイの代表的な結果。(A)関節部のサフラニンO高速緑色軟骨染色の代表的な結果。(B)足首関節におけるMPO及びNEの発現レベルの代表的な結果。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
末梢血7、骨髄および組織18からの高度に精製された好中球の詳細なプロトコルは、長い間利用可能であった。ここでは、成熟した好中球がさらなる抗炎症および抗酸化研究のために不活性化されたままである腹膜液19から好中球を分離する方法を採用する。
空気ポーチ実験を用い、LPSによる好中球のインビボの浸潤を調べた。この方法は、生体内の一般的な炎症環境における細胞浸潤を直接測定する電位の方法として提案されている。
エアポーチアッセイは、好中球の機能を器官非特異的な方法でしか示すだけで、白血球のリクルートカスケードのいくつかのステップを取り除くのは注目に値する。特定の臓器への好中球の採用は、異なる器官特性、接着分子、およびケモカインに依存することができるので、臓器特異的な状態で好中球の機能状態を探索することは、好中球が特定の疾患において潜在的に果たす役割を研究するために非常に重要である3。好中球の浸潤を調べるには、エンドポイントモデルが必要とすることが示唆されている。したがって、AAモデルにおけるマウスの関節切片に免疫ヒストケミカル染色を行うことは、関節空間における好中球に関する洞察的な視点を提供することができる。我々のデータによると、多数の好中球が関節組織にリクルートされ、RAを治療するための好中球の浸潤を中断するさらなる研究の基本的な証拠として機能する。加えて、総合的なアッセイは、例えば、サフラニンO−高速緑色染色法、さらなる研究のために疾患モデルを評価することが要求される。
好中球は、炎症細胞に浸潤する主要なサブセットであり、侵入病原体または組織損傷20、21に対する防御の第一線として働く。好中球が大量に組織に浸透すると、高レベルのサイトカインとNETsが分泌され、組織の保護機構が圧倒され、組織の損傷につながる可能性があります。組織損傷はさらに好中球浸潤を刺激し、したがって悪循環22を形成する。リンパ器官における活性化細胞の捕捉によって細胞遊入を妨害することは、重要な治療アプローチとして提案され、様々な副作用23を有する臨床試験に適用されている。好中球の遊走と炎症活動を同時に調節する新しい治療法を発見することは、将来の炎症性疾患を治療するための有望な戦略である。さらに、運動性調節剤が組み合わされば、好中球媒介性薬物送達24は、薬物特異性を高めることができ、したがって副作用を減少させる。
しかしながら、さらなる改変は、上記のアッセイの適用を広げるために組み合わせることができる。例えば、AAマウスモデルでは、関節における炎症性細胞の浸潤の全体的な印象を得るために、研究者は、常駐白血球集団を放出するために関節を酵素的に消化し、その後、フローサイトメトリーを適用してカウントすることが奨励される人口。
本明細書のプロトコルは、好中球の移動および浸潤を評価する3つの方法を含む。これらのプロトコルの適用は、RAおよび好中球を含む他の炎症性疾患に対する潜在的な治療法を発見するのに有用である。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国自然科学財団(助成金番号81430099および31500704)、国際協力交流プロジェクト(助成金番号2014DFA32950)、北京中国医学大学の研究プログラム(中国) によって支援されました(補助金番号BUCM-2019-JCRC006および2019-JYB-TD013)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
