Summary
Her præsenterer vi tre metoder til at vurdere neutrofil migration og infiltration både in vivo og in vitro. Disse metoder kan bruges til at opdage lovende terapeutiske målretning neutrofile migration.
Abstract
Neutrofiler er et vigtigt medlem af det medfødte immunsystem og spiller afgørende roller i værtsforsvaret mod patogener og patologiske inflammatoriske reaktioner. Neutrofiler kan rekrutteres til inflammation websteder via vejledning af cytokiner og chemokiner. Overvældende infiltration af neutrofiler kan føre til vilkårlige vævsskader, såsom i leddegigt (RA). Neutrofiler isoleret fra peritoneal ekssudat reagere på en defineret kemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro i Transwell eller Zigmond kammer analyser. Den luft pose eksperiment kan bruges til at evaluere kemotaxis af neutrofiler mod lipopolysaccharid (LPS) in vivo. Den adjuvanske-induceret arthritis (AA) musemodel anvendes ofte i RA-forskning, og immunhistokemisk farvning af fælles sektioner med anti-myeloperoxidase (MPO) eller anti-neutrofile elastase (NE) antistoffer er en veletableret metode til at måle neutrofil infiltration. Disse metoder kan bruges til at opdage lovende behandlinger rettet mod neutrofile migration.
Introduction
Neutrofiler er de mest rigelige hvide blodlegemer og tegner sig for 50-70% af hele hvide blodlegemer population hos mennesker1. Neutrofiler er en af de primære responders under akut inflammation. Neutrofiler kan rekrutteres til inflammation ssteder via vejledning af cytokiner og chemokiner frigivet af væv-hjemmehørende celler2,3,4, som formidles af samspillet mellem celle vedhæftning molekyler på overfladen af neutrofiler og vaskulære endothelium celler5. Neutrofiler er grundlæggende for at være vært for forsvar og spille en rolle i patologiske inflammatoriske reaktioner på grund af deres magtfulde evne til at skade væv via frigivelse af reaktive iltarter (ROS) og andre vævsskadelige molekyler3,6.
Tidligere undersøgelser har beskrevet flere neutrofile isolationprotokoller fra mus eller mennesker. Oh et al. demonstrerede en densitetgradient separation metode til at isolere menneskelige neutrofiler fra hele humant blod7. Men isolationen af tilstrækkelige neutrofiler fra museblod er vanskelig på grund af den lille blodvolumen. Alternativt kan et stort antal rene og levedygtige mus neutrofiler fremkaldes fra museperitoneal væske, og disse rensede neutrofiler kan bruges ex vivo til at undersøge flere aspekter af cellulære funktioner ex vivo, herunder neutrofil infiltration, migration, kemotaxis, oxidativ brast, cytokin og neutrophil ekstracellulære fælde (NET) produktion8. Transwell assays9 eller Zigmond kammer assays10,11 kan bruges til at vurdere neutrofile migration in vitro. Luftposemodellen bruges til at evaluere migration og infiltration af neutrofiler in vivo. Den subkutane luft pose model er en bekvem in vivo dyremodel til at studere migration af inflammatoriske celler.
Traditionelt blev neutrofiler betragtet som patogeneliminatorer i akutte faser af inflammation. Men, nylige resultater har vist, at neutrofiler er komplicerede celler, der udfører en betydelig række specialiserede funktioner. Neutrofiler kan regulere mange processer såsom akut skade og reparation, tumorigenese, autoimmun reaktion, og kronisk inflammation12,13. Neutrofiler modulerer også adaptive immunrespons og kan regulere B-celler og T-celler14,15. Betydelig mangel på neutrofiler fører til dødelighed eller svær immundefekt hos mennesker og neutrofiludtynding hos mus fører til dødsfald, mens overdreven aktivering eller rekruttering af neutrofiler i organer forårsager flere immunsygdomme, såsom leddegigt (RA) og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofiler er de mest rigelige celler i synovial væsken af RA patienter. Neutrofiler producerer store mængder myeloperoxidase (MPO) og neutrofile elastase (NE) via nedbrydning, hvilket forværrer bruskerosion. MPO er et peroxidaseenzym, der hovedsagelig udtrykkes i granulatet af neutrofiler16. NE er forbundet med artikulær brusk ødelæggelse17. MPO og NE kunne anvendes til at vurdere status for neutrofil migration og infiltration i væv af RA patienter.
Denne artikel indeholder tre konventionelle metoder til at evaluere migration af normale neutrofiler induceret både in vivo og in vitro, samt infiltration af patologiske neutrofiler i en mus fælles-specifik inflammation model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev gennemgået og godkendt af Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.
BEMÆRK: C57BL/6 mus (7-8 uger gamle) blev brugt.
1. Neutrofil isolation
- Erhvervelse af peritoneale ekssudatceller
- Forbered frisk 10% proteose peptone opløsning i ddH2O. Beregn den nødvendige mængde i henhold til antallet af mus.
BEMÆRK: Indstil antallet af mus som N(2N+1) ml opløsning skal opløses og filtreres på forhånd. - Spray arbejdsområdet med 70% ethanol. Brug en insulininjektor til at tegne 1 ml peptoneopløsning og udflåde bobler.
- Den første intraperitoneale injektion af 1 ml peptoneopløsning pr. mus.
- Grib musen i en head-down position med den ene hånd. Desinficere injektionstedet med alkoholgennemblødte vatkugler.
BEMÆRK: Den foretrukne injektionsposition ligger i det laterale aspekt af mavens nederste venstre eller højre kvadrant. - Indgyde reagenserne hurtigt. Injicer 1 ml i bughulen af hver mus med insulininjektoren.
BEMÆRK: Vinklen mellem nålen og huden skal være ca. 15−30° for at undgå at skade tarmen eller andre organer.
- Grib musen i en head-down position med den ene hånd. Desinficere injektionstedet med alkoholgennemblødte vatkugler.
- Tillad inflammatorisk respons at udvikle natten over. Efter 12 timer skal den anden injektion udføres på samme måde som den første injektion.
- Tre timer efter den anden injektion, fuldt bedøvet mus med 5% isofluran i 5 min i en gasanæstesi kammer med en hastighed på 2 L / min. Fjern bedøvet mus fra kammeret og ofre dem ved cervikal dislokation.
BEMÆRK: Tilstrækkelig dybde af anæstesi sikres ved at klemme tæerne, før du flytter mus fra kammeret til den enkelte åndedrætsenhed. Benene bør ikke bevæge sig, når tæerne er klemt.
BEMÆRK: Alle følgende trin skal behandles i en vævskulturhætte. - Spray musen med 70% ethanol. Læg musen på en steril plastik pude og fastsætte lemmer med nåle.
- Brug et sterilt sæt kirurgiske værktøjer til at lave et vandret snit (~ 1 cm) midt i underlivet. Løft huden på den øvre del af maven med pincet og skæres langs midterlinjen i maven og udsætte den intakte peritoneal væg.
- Tilføres 5 ml sterilt RPMI-1640 komplet medium i bughulen med en 30 G x 1/2" nål. Sæt nålen gennem peritonealvæggen med nålens skrå kant opad og tilføre hele volumen.
- Ryst puden vandret i 5 min. Massage maven forsigtigt flere gange.
- Tilføres en 23 G x 1 1/4" nål i det laterale rum af maven. Udtræk abdominalvæsken (~5 ml) og saml den i et 50 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Anbring rørene på is så hurtigt som muligt i tilfælde af neutrofilaktivering. - Tilføre yderligere 5 ml komplet medium og gentag proceduren for at fjerne de resterende celler fra peritoneum. Bestil peritonealvæsken i 50 ml centrifugerøret.
- Centrifugeret den samlede peritonealvæske ved 400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Kassér supernatanten. Opslup cellerne igen i 1 ml RPMI-1640 komplet medium.
BEMÆRK: Må ikke vortex for at undgå neutrofil aktivering.
- Forbered frisk 10% proteose peptone opløsning i ddH2O. Beregn den nødvendige mængde i henhold til antallet af mus.
- Isolering af neutrofiler
- Der tilsættes 4 ml frisklavet gradientmedium på 70,2 % (f.eks. Percoll) i et 15 ml centrifugerør.
- Overlejr ing 4 ml frisklavet 54,8 % tæthedsgradientmedium på gradientmediet på 70,2 % overhængstallet med skarpe pipettespidser i 15 ml centrifugerøret.
BEMÆRK: Vær forsigtig for at undgå at forstyrre grænsefladen mellem gradientmediet på 54,8 % og 70,2 % tæthedsgradientmedium. - Overlejr forsigtigt 1 ml peritoneal celleaffjedring oven på det 54,8% tæthedsgradientmedium lag langsomt med skarpe pipettespidser (figur 1A).
BEMÆRK: Vær forsigtig for at undgå at forstyrre grænsefladen mellem celleaffjedringen og 54,8 % tæthedsgradientmedium. - Centrifugeres ved 1.500 x g i 30 min ved 22 °C uden bremsning.
- Saml neutrofiler ved grænsefladen af 54,8% tæthed gradient medium og 70,2% tæthed gradient mellemste lag(figur 1B)til et nyt rør.
- Tilføj 1 ml RPMI-1640 komplet medium til de indsamlede celler og forsigtigt resuspendere celler ved forsigtigt at pibe flere gange. Centrifugeres ved 100 x g i 10 min ved RT og fjern forsigtigt supernatanten.
- Brug vasketrinnet (trin 1.2.6) én gang.
- Tilsæt 0,5 ml kulturmedium til pellet og resuspendering celler ved forsigtigt pipetting flere gange. Tag en 50 μL aliquot for at tælle cellerne ved hjælp af en automatisk hæmatologianalysator.
2. Neutrofil migration assay
- Foranstaltning neutrofil migration af Transwell assay9 eller Zigmond kammer assay som tidligere beskrevet10,11.
3. Luftpose assay
- Første luftindsprøjtning
- På dag 0, fuldt anæstesi mus med 5% isofluran i 3 min i en gas anæstesi kammer med en hastighed på 2 L / min, og vedligeholde anæstesi af hver mus i en enkelt vejrtrækning enhed med 2% isofluran med en hastighed på 0,5 L / min.
BEMÆRK: Tilstrækkelig dybde af anæstesi sikres ved at klemme tæerne, før du flytter mus fra kammeret til den enkelte åndedrætsenhed. Benene bør ikke bevæge sig, når tæerne er klemt. - Brug et 0,22 μm filter fastgjort til en 5 ml sprøjte for at opnå en 3 ml volumen steriliseret luft.
- Løft baghuden på den besanderede mus med pincet og subkutan tiindsprøjtning 3 ml steriliseret luft ved hjælp af en 26 G x 3/8"-nål.
- Efter behandling skal musene fjernes fra åndedrætsenheden. Overvåg musene for at sikre, at de er i live, indtil de begynder at bevæge sig rundt.
- På dag 0, fuldt anæstesi mus med 5% isofluran i 3 min i en gas anæstesi kammer med en hastighed på 2 L / min, og vedligeholde anæstesi af hver mus i en enkelt vejrtrækning enhed med 2% isofluran med en hastighed på 0,5 L / min.
- Anden luftindsprøjtning
- På dag 3 injiceres yderligere 3 ml steriliseret luft i den tidligere etablerede luftlomme for at opretholde luftposen som beskrevet i punkt 3.1.
- Behandling
- På dag 6, 6 timer før ofringen, injicere forskellige behandlinger i luften posen. Tilføres 1 ml fosfatbufferede saltvand (PBS) som en negativ kontrol. Injicer 1 ml 1 μg/ml LPS som positiv kontrol for at fremkalde lokal inflammation.
- Helt anæstesi mus med 5% isofluran i 3 min i en gas anæstesi kammer med en hastighed på 2 L / min, og vedligeholde anæstesi af hver mus i en enkelt vejrtrækning enhed med 2% isofluran med en hastighed på 0,5 L / min. Forbered vask buffer i henhold til tabel over materialer.
BEMÆRK: Tilstrækkelig dybde af anæstesi sikres ved at klemme tæerne, før du flytter mus fra kammeret til den enkelte åndedrætsenhed. Benene bør ikke bevæge sig, når tæerne er klemt. - For hver luftpose vaskes luftposen med 1 ml vaskebuffer, og den inflammatoriske ekssudat opsamles i et 15 ml centrifugerør. Vask luftposen med 2 ml vaskebuffer 2x, og opsaml den inflammatoriske ekssudat i samme centrifugerør.
- Centrifugeres ved 100 x g i 10 min. ved RT. Kassér supernatanten og opslæm cellerne igen i 1 ml vaskebuffer. Tæl cellerne til at kvantificere neutrofil forholdet ved hjælp af den automatiske hæmatologi analysator.
BEMÆRK: Se repræsentative resultater i figur 2.
4. Induktion af adjuverende-induceret arthritis (AA) mus model
- Udbryd freunds adjuverende (CFA) ved at vortexing mindst 5 s, og træk derefter 100 μL af fjedring ind i en insulininjektor.
BEMÆRK: Vi anbefaler at bruge helt ny CFA i forsøg for at sikre sterilitet. - Bedøve mus som beskrevet i trin 3.1.1.
- Marker den valgte pote og tilføre 20 μL CFA i ankelleddet. Tilsprøjt 20 μL af suspension i fire periartikulære pletter på den valgte pote (80 μL i alt).
- Fjern mus fra åndedrætsenheden og læg de forarbejdede mus i et nyt kammer. Overvåg mus for at sikre, at de trækker vejret, indtil de genvinder evnen til at bevæge sig.
- Hver 3. dag skal leddiameteren vurderes ved at måle ankelleddiameteren ved hjælp af en lommetykkelsesmåler (Figur 3A).
- Hver 3 dage, vurdere gigt sværhedsgrad ved arthritis scoring kriterium (Figur 3C): 0, normal, ingen tegn på erythema og hævelse; 1, den mildeste gigt, erythema og mild hævelse begrænset til tarsals eller ankel led; 2, moderat gigt, erythema og mild hævelse strækker sig fra anklen til tarsals; 3, svær gigt, erythema og moderat hævelse strækker sig fra anklen til metatarsal leddene; 4, den mest alvorlige gigt, erythema og svær hævelse omfatter ankel, fod og cifre, eller ankylosis af lemmerne.
5. Immunhistokemisk farvning af fælles sektioner
- Fælles isolation
- Ofret musen i afsnit 4 ved hjælp af cervikal dislokation efter anæstesi med isofluran. Spray musen med 70% ethanol.
- Fjern huden og en del af musklen fra bagbenet med pincet og saks. Spray den fælles med 70% ethanol og fjerne resten af musklerne ved hjælp af et køkkenrulle.
- Fix ankel leddet i 4% paraformaldehyd i 2 dage på RT. Decalcify den fælles i 10% EDTA for 1 måned på RT og ændre mediet ugentligt.
- Vævet anbringes i paraffin, og der forberedes 4-μm tykke vævssektioner.
- Placer væv i en mærket form med visse mængder af flydende paraffin. Cool kort.
- Indstil tykkelsen på 4 μm og skær skiver på et mikrotom. Flydesektioner i et vandbad på 43 °C.
- Monter sektionerne på glider og læg diasene i ovnen ved 70 °C i 2 timer. Til fremtidig brug skal du bevare diasene ved -20 °C.
- Safranin O og hurtig grøn farvning af fælles sektioner
BEMÆRK: Følgende farvningstrin udføres på RT.- Placer dias fra trin 5.1.4.3 i et rack og udføre følgende vasker at rehydrere på RT: xylen i 5 min (3x), 100% ethanol i 2 min (2x), 95% ethanol i 2 min (2x), 70% ethanol i 2 min, og 50% ethanol i 15 min. Vask i rhanevand i 3 min.
- Plettet i 0,1% hurtig grøn opløsning i 5 min. Skyl i 1% eddikesyre i 10 s.
- Pletten i 0,1% safranin O farvningsopløsning i 20 min. Nedsænkes i følgende vaske: 95% ethanol i 2 min (2x), 100% ethanol i 2 min (2x) og xylen i 2 min (2x).
- Monter vævssektionerne, og overhold vævunder et mikroskop.
BEMÆRK: Se repræsentative billeder i figur 4A.
- Immunhistokemisk farvning for at visualisere neutrofiler
- Paraffinsektionerne bages i 2 timer ved 78 °C. Placer dias i et rack og udføre følgende vasker at rehydrere på RT: xylen i 15 min (2x), 100% ethanol i 5 min (2x), 95% ethanol i 5 min, 80% ethanol i 5 min, H2O i 3 min, og PBS i 3 min.
BEMÆRK: Lad ikke slides tørre på noget tidspunkt i løbet af dette trin. - Tilføj en dråbe permeabilisering buffer til at dække vævet. Inkuberede sektioner i en fugtighedsstyret bakke ved 37 °C.
- Skyl dias i PBS i 3 min (3x). Undgå at skyle vævet direkte.
- Udfør varme-induceret antigen epitophentning ved hjælp af en trykkedel.
- Arranger dias i et rack. Fordyb dias i trykkedlen fyldt med hentningsbuffer.
- Sæt trykkedlen på en mikrobølgeovn. Indstil mikrobølgeovnen til 600 W, og varm rutsjebanerne i 10 minutter.
- Hold gliderne i kedlen efter kogning for at køle af til 90 °C. Tag diasene ud og skyl dem i PBS i 3 min (3x).
- Dæmpning endogen peroxidase aktivitet i frisklavet 3% H2O2 på RT i 15 min. Skyl dias i PBS i 3 min (3x).
- Omrids en stor cirkel omkring prøven med en hydrofob pen, undgå at røre prøven. Bloker med 3% kvægserumalbumin (BSA) i et fugtighedskontrolleret kammer ved 37 °C i 60 min.
- Fjern blokeringsopløsningen. Der tilsættes hurtigt 50 μL PBS-fortyndet primært antistof til hver sektion. Derefter inkubere diasene i en fugtighedsstyret bakke ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Der anvendes forskellige fortyndingsforhold til forskellige antistoffer (1:25 for MPO og 1:20 for NE). - På den anden dag, tage bakken ud og lad det stå på RT i 30 min. Skyl derefter diasene i PBS i 3 min (3x).
- Der tilsættes 50 μL PBS-fortyndede sekundære antistoffer til vævet.
BEMÆRK: Der blev anvendt forskellige fortyndingsforhold: 1:1.000 for MPO og 1:1.500 for NE. - Inkubere glider i en fugtighedsstyret bakke ved 37 °C i 30 min. Skyl derefter diasene i PBS i 3 min (3x).
- Ududvikles i fortyndet 3,3'-diaminobenzidin (DAB) opløsning i 5 min. Hold øje med reaktionen i tilfælde af udvikling af en mørk farve. Skyl rutsjebanerne i destilleret vand.
- Counterstain dias i hæmatoxylin i 10 s. Skyl dias i postevand i 5 min.
- Skyl i syre alkohol superhurtig differentiering opløsning for 3 s. Skyl derefter vand fra hanen i 10 minutter.
- Slides i følgende vasker på RT: 80% ethanol i 5 min, 95% ethanol i 5 min, 100% ethanol i 5 min, og xylen i 15 min (2x). Fastgør dækselmed monteringsopløsning. Overhold vævet under et mikroskop.
BEMÆRK: Se repræsentative billeder i figur 4B.
- Paraffinsektionerne bages i 2 timer ved 78 °C. Placer dias i et rack og udføre følgende vasker at rehydrere på RT: xylen i 15 min (2x), 100% ethanol i 5 min (2x), 95% ethanol i 5 min, 80% ethanol i 5 min, H2O i 3 min, og PBS i 3 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peritoneale ekssudatceller blev indsamlet fra lavage væske af mus. Cellerne blev ophængt igen i 1 ml RPMI-1640 komplet medium, lagdelt på en to-trins (54,8% /70.2%) diskontinuerlig densitetsgradient (figur 1A) og centrifugeret ved 1.500 x g i 30 min. Neutrophils (≥95%, ~1 x 107 neutrofiler/mus) blev inddrevet fra den nederste grænseflade (figur 1B).
Der blev udført luftposeeksperimenter for at undersøge rekrutteringen af neutrofil stimuleret af LPS in vivo (figur 2A). Leukocyte-delsættene i luftposens exudates blev målt (figur 2B).
Neutrofil migration i RA blev evalueret via CFA-induceret arthritis murine model. Sammenlignet med kontrolgruppen viste AA-gruppen signifikant ødem i poten. I AA-gruppen steg ankelleddiameteren (figur 3B) og arthritis score steg konsekvent (Figur 3D).
Brusk skader er den repræsentative syndrom RA, safranin O-hurtig grøn brusk farvning blev udført for at vurdere brusk skader i AA mus. Som vist i figur 4Ainduceret CFA udfordring en stor mængde leukocyte infiltration, betydelig brusk erosion og synovial hyperplasi. MPO- og NE-udtryksniveauer er repræsentative markører for neutrofilinfiltration. Immunohistokemiske analyser blev udført for at observere neutrofil infiltration i leddene. MPO og NE udtryk blev væsentligt upregulated i den fælles sektion(figur 4B).
Figur 1: Neutrofil isolation. (A) Peritoneal exudate celler resuspenderet i 1 ml RPMI-1640 komplet medium blev lagdelt på en to-trins (54,8% /70.2%) diskontinuerlig tæthedgradient. (B) Efter centrifugering ved 1.500 x g i 30 min blev neutrofiler (≥95%, ~ 1 x 107 neutrofiler/mus) bjærget fra den nederste grænseflade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af luftposeanalysen. (A) Illustration af luftpose assay. (B) Repræsentative resultater af leukocyte delet infiltration i luftpose assay. PBS: kontrol; LPS: 1 μg/mL LPS. Data præsenteres som den gennemsnitlige ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultater af den adjuvanske-induceret arthritis (AA) musemodel. (A) Ankelleddiameteren blev målt ved hjælp af en lommetykkelsesmåler. B) Hævede ledblev vurderet på grundlag af ankelleddiameteren (n = 7). (C) Billeder af hver arthritis score. (D) Sværhedsgraden af gigt blev klassificeret på en skala fra 0−4 point (n = 7). Data præsenteres som den gennemsnitlige ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative resultater af safranin O-hurtig grøn brusk farvning og immunhistokemisk esay af fælles sektioner fra kontrol og AA mus. A) Repræsentative resultater af safranin O-hurtig grøn brusk farvning af fælles sektioner. B) Repræsentative resultater af mpo-og NE's udtryksniveau i ankelleddene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljerede protokoller af højt rensede neutrofiler fra perifert blod7,knoglemarv og væv18 har været tilgængelige i lang tid. Her vedtager vi en metode til at isolere neutrofiler fra peritoneal væske19, hvor modne neutrofiler forbliver inaktiveret for yderligere anti-inflammatoriske og antioxidant undersøgelser.
Vi brugte luftpose eksperimentet til at udforske LPS-induceret infiltration af neutrofiler in vivo. Denne metode er blevet foreslået som en potentiel metode til direkte måling af celleinfiltration i det generelle inflammatoriske miljø in vivo.
Det er bemærkelsesværdigt, at luftpose assay kun viser neutrofil funktion på en organ-uspecifik måde og fjerner flere trin i leukocyte rekruttering kaskade. Da neutrofil rekruttering til specifikke organer kan stole på forskellige organegenskaber, vedhæftning molekyler, og chemokiner, udforske neutrofil funktionelle tilstand i organspecifikke betingelser er af stor betydning for at studere den rolle, neutrofiler potentielt spiller i visse sygdomme3. Det er blevet foreslået, at slutpunktsmodeller er nødvendige for at undersøge neutrofil infiltration. Derfor kan udførelse af immunhistokemisk farvning på de fælles sektioner af mus i AA-modellen give et indsigtsfuldt perspektiv på neutrofiler i ledrummet. Ifølge vores data, er et stort antal neutrofiler rekrutteret i leddet væv og tjene som grundlæggende beviser for yderligere forskning i at afbryde infiltration af neutrofiler til behandling af RA. Derudover skal der vurderes sygdomsmodellen til yderligere undersøgelse, for eksempel safranin O-hurtig grøn farvning.
Neutrofiler er den største delmængde af infiltrerende inflammatoriske celler og arbejde som den første linje i forsvaret mod invaderende patogener eller væv skade20,21. Hvis neutrofiler infiltrerer væv i stort antal, udskilles høje niveauer af cytokiner og NET'er, hvilket tilsammen kan overvælde de beskyttende mekanismer i væv og føre til vævsskader. Vævsskade yderligere stimulerer neutrofil infiltration, og dermed danner en ond cirkel22. Forstyrrecellemigration ved hjælp af fældefangst af aktiverede celler i lymfoide organer er blevet foreslået som en vigtig terapeutisk tilgang og er blevet anvendt i kliniske forsøg med forskellige bivirkninger23. Opdage en ny behandling til samtidig at regulere neutrofile migration og inflammatorisk aktivitet er en lovende strategi for behandling af inflammatoriske sygdomme i fremtiden. Endvidere, hvis motilitet-regulerende midler kombineres, neutrofil-medieret stof levering24 kan øge narkotika specificitet, og dermed faldende bivirkninger.
Yderligere ændringer kan dog kombineres for at udvide anvendelsen af ovennævnte analyser. For eksempel, i AA mus model, for at opnå det samlede indtryk af infiltration af inflammatoriske celler i leddet, forskere opfordres til at enzymatisk fordøje leddene til at frigive hjemmehørende leukocyte populationer og derefter anvende flow cytometri at tælle befolkningerne.
Protokollerne heri omfatter tre måder at vurdere neutrofile migration og infiltration. Anvendelsen af disse protokoller er nyttig til at opdage potentielle behandlinger for RA og andre inflammatoriske sygdomme, der involverer neutrofiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud numre 81430099 og 31500704), Internationalt samarbejde og udvekslingsprojekter (tilskud nummer 2014DFA32950), og forskningsprogram af Beijing University of Chinese Medicine ( tilskudsnumre NEM-2019-JCRC006 og 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
