Summary
Hier presenteren we drie methoden om neutrofiele migratie en infiltratie zowel in vivo als in vitro te beoordelen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.
Abstract
Neutrofielen zijn een belangrijk lid van het aangeboren immuunsysteem en spelen een centrale rol in de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers en pathologische ontstekingsreacties. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines. Overweldigende infiltratie van neutrofielen kan leiden tot willekeurige weefselschade, zoals bij reumatoïde artritis (RA). Neutrofielen geïsoleerd van peritoneale exudate reageren op een gedefinieerde chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell of Zigmond kamer testen. Het luchtzakje experiment kan worden gebruikt om de chemotaxis van neutrofielen in de richting van lipopolysaccharide (LPS) in vivo te evalueren. Het adjuvante-geïnduceerde artritis (AA) muismodel wordt vaak gebruikt in RA-onderzoek, en immunohistochemische kleuring van gewrichtssecties met anti-myeloperoxidase (MPO) of anti-neutrofiele elastase (NE) antilichamen is een gevestigde methode om te meten neutrofiele infiltratie. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende witte bloedcellen en zijn goed voor 50−70% van de hele witte bloedcellen populatie bij de mens1. Neutrofielen zijn een van de primaire responders tijdens acute ontsteking. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines vrijgegeven door weefsel-resident cellen2,3,4, die wordt bemiddeld door de interacties tussen celhechting moleculen op het oppervlak van neutrofielen en vasculaire endothehelium cellen5. Neutrofielen zijn van fundamenteel belang voor de verdediging en spelen een rol in pathologische ontstekingsreacties vanwege hun krachtige vermogen om weefsel te beschadigen door het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en andere weefselbeschadigende moleculen3,6.
Eerdere studies hebben verschillende neutrofiele isolatieprotocollen van muizen of mensen beschreven. Oh et al. demonstreerde een dichtheidgradiëntscheidingsmethode om menselijke neutrofielen te isoleren van heel menselijk bloed7. Echter, de isolatie van voldoende neutrofielen van muisbloed is moeilijk vanwege het kleine bloedvolume. Als alternatief kunnen grote aantallen zuivere en levensvatbare muisneutrofielen worden ontlokt uit muisperitoneale vloeistof, en deze gezuiverde neutrofielen kunnen ex vivo worden gebruikt om verschillende aspecten van cellulaire functies ex vivo te onderzoeken, waaronder neutrofiele infiltratie, migratie, chemotaxis, oxidatieve uitbarsting, cytokine en neutrofiele extracellulaire val (NET) productie8. Transwell assays9 of Zigmond kamer assays10,11 kan worden gebruikt om neutrofiele migratie in vitro te evalueren. Het luchtzakjemodel wordt gebruikt om de migratie en infiltratie van neutrofielen in vivo te evalueren. Het onderhuidse luchtzakjemodel is een handig in vivo diermodel om de migratie van ontstekingscellen te bestuderen.
Traditioneel werden neutrofielen beschouwd als pathogene eliminators in acute ontstekingsfasen. Recente bevindingen hebben echter aangetoond dat neutrofielen gecompliceerde cellen zijn die een aanzienlijke verscheidenheid aan gespecialiseerde functies uitvoeren. Neutrofielen kunnen veel processen reguleren, zoals acuut letsel en reparatie, tumorigenese, auto-immuunrespons en chronische ontsteking12,13. Neutrofielen moduleren ook adaptieve immuunreacties en kunnen B-cellen en T-cellenreguleren 14,15. Een groot tekort aan neutrofielen leidt tot sterfte of ernstige immunodeficiëntie bij mensen en neutrofiele uitputting bij muizen leidt tot dodelijk ongeval, terwijl overmatige activering of rekrutering van neutrofielen in organen verschillende immuunziekten veroorzaakt, zoals reumatoïde artritis (RA) en systemische lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofielen zijn de meest voorkomende cellen in de synoviale vloeistof van RA-patiënten. Neutrofielen produceren overmatige hoeveelheden myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastasase (NE) via afbraak, wat kraakbeenerosie verergert. MPO is een peroxidase enzym voornamelijk uitgedrukt in de korrels van neutrofielen16. NE wordt geassocieerd met gewrichtskraakbeen vernietiging17. MPO en NE kunnen worden gebruikt om de status van neutrofiele migratie en infiltratie in het weefsel van RA-patiënten te evalueren.
Dit artikel biedt drie conventionele methoden om de migratie van normale neutrofielen geïnduceerd, zowel in vivo als in vitro, te evalueren, evenals de infiltratie van pathologische neutrofielen in een muisgewrichtspecifiek ontstekingsmodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.
LET OP: C57BL/6 muizen (7-8 weken oud) werden gebruikt.
1. Neutrofiele isolatie
- Verwerving van peritoneale ex-ex-datecellen
- Bereid verse 10% proteose peptone oplossing in ddH2O. Bereken het volume dat nodig is op basis van het aantal muizen.
OPMERKING: Stel het aantal muizen in als N, (2N+1) mL oplossing moet vooraf worden opgelost en gefilterd. - Spuit de werkruimte met 70% ethanol. Gebruik een insulineinjector om 1 mL peptoneoplossing te tekenen en bellen te ontladen.
- Voer de eerste intraperitoneale injectie van 1 mL peptone oplossing per muis.
- Pak de muis in een head-down positie met een hand. Desinfecteer de injectieplek met met alcohol doordrenkte katoenen balletjes.
OPMERKING: De gewenste injectiepositie ligt in het laterale aspect van het kwadrant linksonder of rechts van de buik. - Bezielen de reagentia snel. Injecteer 1 mL in de peritoneale holte van elke muis met de insulineinjector.
OPMERKING: De hoek tussen de naald en de huid moet ongeveer 15−30° zijn om te voorkomen dat de darm of andere organen gewond raakten.
- Pak de muis in een head-down positie met een hand. Desinfecteer de injectieplek met met alcohol doordrenkte katoenen balletjes.
- Laat ontstekingsreactie 's nachts ontwikkelen. Voer na 12 uur de tweede injectie op dezelfde manier uit als de eerste injectie.
- Drie uur na de tweede injectie, volledig verdoven muizen met 5% isoflurane voor 5 min in een gas anesthesie kamer met een snelheid van 2 L /min. Verwijder de verdoofde muizen uit de kamer en offer ze op door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Voldoende diepte van anesthesie wordt gewaarborgd door de tenen te knijpen voordat muizen van de kamer naar de enkele ademhalingseenheid worden verplaatst. De benen mogen niet bewegen wanneer de tenen worden geknepen.
OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden verwerkt in een weefselkweekkap. - Spray de muis met 70% ethanol. Leg de muis op een steriele plastic pad en bevestig de ledematen met naalden.
- Gebruik een steriele set chirurgische hulpmiddelen om een horizontale incisie (~ 1 cm) te maken in het midden van de onderbuik. Til de huid van de bovenbuik met tangen en snijd langs de middellijn van de buik en bloot de intacte buikwand.
- Injecteer 5 mL steriel RPMI-1640 compleet medium in de buikholte met een naald van 30 G x 1/2". Plaats de naald door de buikvlieswand met de afgeschuinde rand van de naald naar boven en injecteer het hele volume.
- Schud het pad horizontaal gedurende 5 min. Masseer de buik zachtjes meerdere malen.
- Injecteer een naald van 23 G x 1 1/4" in de zijdelingse ruimte van de buik. Haal de buikvloeistof (~ 5 mL) eruit en verzamel deze in een centrifugebuis van 50 mL.
LET OP: Plaats de buizen zo snel mogelijk op ijs in geval van neutrofiele activering. - Injecteer nog eens 5 mL volledig medium en herhaal de procedure om de resterende cellen uit het peritoneum te verwijderen. Vul de peritoneale vloeistof in de centrifugebuis van 50 mL.
- Centrifugeer de gepoolde peritoneale vloeistof met 400 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT).
- Gooi de supernatant weg. Resuspend de cellen in 1 mL rpmi-1640 complete medium.
LET OP: Niet vortex om neutrofiele activering te voorkomen.
- Bereid verse 10% proteose peptone oplossing in ddH2O. Bereken het volume dat nodig is op basis van het aantal muizen.
- Isolatie van neutrofielen
- Voeg 4 mL vers bereid 70,2% hellingsmedium met dichtheid (bijvoorbeeld Percoll) toe in een centrifugebuis van 15 mL.
- Voorzichtig overlay 4 mL vers bereid 54,8% dichtheid gradiënt medium op de 70,2% dichtheid gradiënt medium langzaam langs de rand van de buis met scherpe pipet tips in de 15 mL centrifuge buis.
OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de interface tussen het 54,8% dichtheidsverloopmedium en 70,2% het verloopmedium van de dichtheid wordt verstoord. - Bedek de 1 mL peritoneale celvering langzaam over de gemiddelde laag met een dichtheid van 54,8% met scherpe pipettips(figuur 1A).
OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de interface tussen de celvering en 54,8% de dichtheid gradiënt medium verstoren. - Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 30 min bij 22 °C zonder te remmen.
- Verzamel de neutrofielen op de interface van het 54,8% dichtheidsgradiënt en 70,2% hellingsgraadgemiddelde lagen(figuur 1B)op een nieuwe buis.
- Voeg 1 mL RPMI-1640 complete medium toe aan de verzamelde cellen en verwijder cellen voorzichtig door meerdere keren zachtjes te besuiaaiden. Centrifugeer bij 100 x g voor 10 min bij RT en verwijder voorzichtig de supernatant.
- Herhaal de wasstap (stap 1.2.6) eenmaal.
- Voeg 0,5 mL kweekmedium toe aan de pellet en bretel cellen opnieuw door meerdere keren zachtjes te besuisen. Neem een aliquot van 50 μL om de cellen te tellen met behulp van een automatische hematologieanalyzer.
2. Neutrofiele migratietest
- Meet de neutrofiele migratie door Transwell test9 of Zigmond kamertest zoals eerder beschreven10,11.
3. Luchtzakjetest
- Eerste luchtinjectie
- Op dag 0, volledig verdoven muizen met 5% isoflurane voor 3 min in een gas anesthesie kamer met een snelheid van 2 L /min, en onderhouden van de anesthesie van elke muis in een enkele ademhaling eenheid met 2% isoflurane met een snelheid van 0,5 L /min.
OPMERKING: Voldoende diepte van anesthesie wordt gewaarborgd door de tenen te knijpen voordat muizen van de kamer naar de enkele ademhalingseenheid worden verplaatst. De benen mogen niet bewegen wanneer de tenen worden geknepen. - Gebruik een 0,22 μm-filter dat aan een spuit van 5 mL is bevestigd om een volume van 3 mL gesteriliseerde lucht te verkrijgen.
- Til de rughuid van de verdoofde muis op met een pincet en injecteer onderhuids 3 mL gesteriliseerde lucht met behulp van een 26 G x 3/8"-naald.
- Verwijder na de behandeling de muizen uit de ademhalingsunit. Controleer de muizen om ervoor te zorgen dat ze leven totdat ze beginnen te bewegen.
- Op dag 0, volledig verdoven muizen met 5% isoflurane voor 3 min in een gas anesthesie kamer met een snelheid van 2 L /min, en onderhouden van de anesthesie van elke muis in een enkele ademhaling eenheid met 2% isoflurane met een snelheid van 0,5 L /min.
- Tweede luchtinjectie
- Injecteer op dag 3 nog eens 3 mL gesteriliseerde lucht in de eerder gevestigde luchtzak om het luchtzakje in stand te houden, zoals beschreven in punt 3.1.
- Behandeling
- Op dag 6, 6 uur voor het offer, injecteren verschillende behandelingen in de lucht zak. Injecteer 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) als negatieve controle. Injecteer 1 mL van 1 μg/mL LPS als de positieve controle om lokale ontstekingen te veroorzaken.
- Volledig verdoven muizen met 5% isoflurane voor 3 min in een gas anesthesie kamer met een snelheid van 2 L /min, en onderhouden van de anesthesie van elke muis in een enkele ademhaling eenheid met 2% isoflurane met een snelheid van 0,5 L /min. Bereid wassen buffer volgens Table of Materials.
OPMERKING: Voldoende diepte van anesthesie wordt gewaarborgd door de tenen te knijpen voordat muizen van de kamer naar de enkele ademhalingseenheid worden verplaatst. De benen mogen niet bewegen wanneer de tenen worden geknepen. - Voor elk luchtzakje was je het luchtzakje met 1 mL wasbuffer en verzamel je de ontstekingsexudate in een centrifugebuis van 15 mL. Was het luchtzakje met 2 mL wasbuffer 2x en verzamel de ontstekingsexudate in dezelfde centrifugebuis.
- Centrifugeer bij 100 x g voor 10 min bij RT. Gooi de supernatant weg en breg cellen opnieuw op in 1 mL wasbuffer. Tel de cellen om de neutrofiele verhouding te kwantificeren met behulp van de automatische hematologieanalyzer.
OPMERKING: Zie representatieve resultaten in figuur 2.
4. Inductie van het adjuvant-geïnduceerde artritis (AA) muismodel
- Hang de hulpvervant (CFA) van Complete Freund op door ten minste 5 s vortexing en trek vervolgens 100 μL suspensie in een insulineinjector.
OPMERKING: We raden aan om volledig nieuwe CFA te gebruiken in experimenten om steriliteit te garanderen. - Verdovende muizen zoals beschreven in stap 3.1.1.
- Markeer de gekozen poot en injecteer 20 μL CFA in de enkelgewrichtsruimte. Injecteer 20 μL suspensie in vier periarticulaire vlekken op de gekozen poot (in totaal 80 μL).
- Verwijder muizen uit de ademhalingsunit en zet de verwerkte muizen in een nieuwe kamer. Monitor muizen om ervoor te zorgen dat ze ademen totdat ze weer in staat om te bewegen.
- Beoordeel elke 3 dagen de gewrichtsdiameter door de diameter van het enkelgewricht te meten met behulp van een zakdiktemeter(figuur 3A).
- Elke 3 dagen, beoordelen artritis ernst door artritis scoren criterium (Figuur 3C):0, normaal, geen bewijs van erythema en zwelling; 1, de mildste artritis, erythema en milde zwelling beperkt tot de tarsals of enkelgewricht; 2, matige artritis, erythema en milde zwelling die zich uitstrekt van de enkel tot de tarsals; 3, ernstige artritis, erythema en matige zwelling die zich uitstrekt van de enkel tot middenvoetsbeentje gewrichten; 4, de meest ernstige artritis, erythema en ernstige zwelling omvatten de enkel, voet en cijfers, of ankylosis van de ledemaat.
5. Immunohistochemische kleuring van gewrichtsdelen
- Gezamenlijke isolatie
- Offer de muis op in sectie 4 met behulp van cervicale dislocatie na anesthesie met isoflurane. Spray de muis met 70% ethanol.
- Verwijder de huid en een deel van de spier uit het achterbeen met een pincet en schaar. Spray het gewricht met 70% ethanol en verwijder de rest van de spieren met behulp van een papieren handdoek.
- Bevestig het enkelgewricht in 4% paraformaldehyde gedurende 2 dagen bij RT. Ontcalcificer het gewricht in 10% EDTA gedurende 1 maand bij RT en verander het medium wekelijks.
- Veranker het weefsel in paraffine en bereid weefselsecties van 4 μm dik voor.
- Plaats weefsel in een gemarkeerde mal met een bepaald volume van vloeibare paraffine. Ga even koel.
- Stel de dikte in op 4 μm en snijd plakjes op een microtoom. Drijf secties in een waterbad van 43 °C.
- Monteer de secties op glijbanen en zet de glijbanen 2 uur lang op 70 °C in de oven. Voor toekomstig gebruik, behoud de glijbanen op -20 °C.
- Safranin O en snelle groene kleuring van gewrichtssecties
OPMERKING: De volgende kleuringsstappen worden uitgevoerd op RT.- Plaats de glijbanen van stap 5.1.4.3 in een rek en voer de volgende wasbeurten uit om te hydrateren bij RT: xyleen voor 5 min (3x), 100% ethanol voor 2 min (2x), 95% ethanol voor 2 min (2x), 70% ethanol voor 2 min en 50% ethanol gedurende 15 min. Was in stromend leidingwater gedurende 3 min.
- Vlek in 0,1% snelgroene oplossing voor 5 min. Spoel in 1% azijnzuur voor 10 s.
- Vlek in 0,1% safranin O kleuroplossing voor 20 min. Dompel de dia's onder in de volgende wasbeurten: 95% ethanol voor 2 min (2x), 100% ethanol voor 2 min (2x) en xyleen gedurende 2 min (2x).
- Monteer de weefselsecties en observeer de weefsels onder een microscoop.
OPMERKING: Zie representatieve afbeeldingen in figuur 4A.
- Immunohistochemische kleuring om neutrofielen te visualiseren
- Bak de paraffinesecties 2 uur bij 78 °C. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende wasbeurten uit om te hydrateren bij RT: xyleen gedurende 15 min (2x), 100% ethanol voor 5 min (2x), 95% ethanol voor 5 min, 80% ethanol voor 5 min, H2O voor 3 min en PBS voor 3 min.
OPMERKING: Laat dia's tijdens deze stap niet drogen. - Voeg een druppel permeabilisatie buffer om het weefsel te dekken. Incubeer secties in een vochtigheidsgecontroleerde lade bij 37 °C.
- Spoel dia's in PBS gedurende 3 min (3x). Vermijd spoelen het weefsel direct.
- Voer warmte-geïnduceerde antigeen epitoop ophalen met behulp van een drukketel.
- Plaats dia's in een rek. Dompel glijbanen onder in de drukketel gevuld met ophaalbuffer.
- Zet de drukketel op een magnetron. Zet de magnetron op 600 W en verwarm de glijbanen voor 10 min.
- Houd na het koken de glijbanen in de ketel om af te koelen tot 90 °C. Haal de glijbanen eruit en spoel ze in PBS voor 3 min (3x).
- Doof endogene peroxidaseactiviteit in vers bereide 3% H2O2 bij RT gedurende 15 min. Spoel dia's in PBS gedurende 3 min (3x).
- Schets een grote cirkel rond het monster met een hydrofobe pen, vermijd het aanraken van het monster. Blok met 3% runderserumalbumine (BSA) in een vochtgecontroleerde kamer bij 37 °C gedurende 60 min.
- Verwijder de blokkeringsoplossing. Voeg snel 50 μL PBS-verdunde primaire antilichaam toe aan elke sectie. Bebroed vervolgens de glijbanen in een vochtigheidsgestuurde lade bij 4 °C 's nachts.
OPMERKING: Voor verschillende antilichamen (1:25 voor MPO en 1:20 voor NE) worden verschillende verdunningsverhoudingen gebruikt. - Op de tweede dag, neem de lade en laat het staan op RT voor 30 min. Spoel vervolgens de glijbanen in PBS gedurende 3 min (3x).
- Voeg 50 μL PBS-verdunde secundaire antilichamen toe aan het weefsel.
OPMERKING: Er werden verschillende verdunningsverhoudingen toegepast: 1:1.000 voor MPO en 1:1.500 voor NE. - Incubeer gedurende 30 min glijbanen in een vochtigheidsgecontroleerde lade bij 37 °C. Spoel vervolgens de glijbanen in PBS gedurende 3 min (3x).
- Ontwikkel in verdunde 3,3'-diaminobenzidine (DAB) oplossing voor 5 min. Houd de reactie in de gaten in het geval van de ontwikkeling van een donkere kleur. Spoel de glijbanen af in gedestilleerd water.
- Counterstain de glijbanen in hematoxyline voor 10 s. Spoel de glijbanen in leidingwater gedurende 5 min.
- Spoel in zure alcohol supersnelle differentiatie oplossing voor 3 s. Spoel vervolgens 10 min kraanwater in.
- Dompel de dia's onder in de volgende wasbeurten bij RT: 80% ethanol voor 5 min, 95% ethanol voor 5 min, 100% ethanol voor 5 min en xyleen voor 15 min (2x). Bevestig de coverslip met montageoplossing. Observeer het weefsel onder een microscoop.
OPMERKING: Zie representatieve afbeeldingen in figuur 4B.
- Bak de paraffinesecties 2 uur bij 78 °C. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende wasbeurten uit om te hydrateren bij RT: xyleen gedurende 15 min (2x), 100% ethanol voor 5 min (2x), 95% ethanol voor 5 min, 80% ethanol voor 5 min, H2O voor 3 min en PBS voor 3 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peritoneale ex-exudate cellen werden verzameld uit lavage vloeistof van muizen. Cellen werden opnieuw onderbroken in 1 mL RPMI-1640 volledig medium, gelaagd op een twee-staps (54,8%/70,2%) discontinu dichtheidsgradiënt(figuur 1A) en gecentrifugeerd bij 1.500 x g gedurende 30 min. Neutrofielen (≥95%, ~1 x 107 neutrofielen/muis) werden teruggewonnen uit de onderste interface (figuur 1B).
Er werden luchtzakjesexperimenten uitgevoerd om de neutrofiele rekrutering te onderzoeken die door LPS in vivo wordt gestimuleerd (figuur 2A). De leukocyten subsets in de luchtzakje exudates werden gemeten (Figuur 2B).
Neutrofiele migratie in RA werd geëvalueerd via het CFA-geïnduceerde artritis murine model. Vergeleken met de controlegroep vertoonde de AA-groep aanzienlijk oedeem in de poot. In de AA-groep nam de diameter van het enkelgewricht toe (figuur 3B) en steeg de artritisscore consequent (figuur 3D).
Kraakbeenschade is het representatieve syndroom van RA, safranine O-snelle groene kraakbeenvlekken werden uitgevoerd om de kraakbeenschade bij aa-muis te beoordelen. Zoals blijkt uit figuur 4A, cfa uitdaging veroorzaakte een grote hoeveelheid leukocyteinfiltratie, aanzienlijke kraakbeenerosie en synoviale hyperplasie. MPO- en NE-expressieniveaus zijn representatieve markers van neutrofiele infiltratie. Immunohistochemische testen werden uitgevoerd om neutrofiele infiltratie in gewrichten waar te nemen. MPO- en NE-expressie werd aanzienlijk gereguleerd in de gezamenlijke sectie (figuur 4B).
Figuur 1: Neutrofiele isolatie. (A) Peritoneale ex-exudate cellen opnieuw opgehangen in 1 mL rpmi-1640 volledige medium werden gelaagd op een twee-stap (54,8%/70,2%) discontinu dichtheidsgradiënt. (B) Na een centrifugatie bij 1.500 x g voor 30 min werden neutrofielen (≥95%, ~1 x 107 neutrofielen/muis) teruggevonden uit de onderste interface. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van de test van het luchtzakje. (A) Illustratie van de luchtzakjetest. (B) Representatieve resultaten van leukocytesubset infiltratie in de test van het luchtzakje. PBS: controle; LPS: 1 μg/mL LPS. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van het door adjuvante geïnduceerde artritis (AA) muismodel. (A) De diameter van het enkelgewricht werd gemeten met behulp van een zakdiktemeter. (B) De zwelling van het gewricht werd beoordeeld op basis van de diameter van het enkelgewricht (n = 7). (C) Foto's van elke artritis score. (D) De ernst van artritis werd beoordeeld op een schaal van 0−4 punten (n = 7). Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van safranine O-snelle groene kraakbeenvlekken en immunohistochemische test van gewrichtssecties uit de controle en AA-muizen. (A) Representatieve resultaten van safranin O-snelle groene kraakbeenvlekken van gewrichtssecties. (B) Representatieve resultaten van het expressieniveau van MPO en NE in de enkelgewrichten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gedetailleerde protocollen van sterk gezuiverde neutrofielen uit perifeer bloed7,beenmerg en weefsels18 zijn beschikbaar voor een lange tijd. Hier nemen we een methode aan om neutrofielen te isoleren van peritoneale vloeistof19 waarin volwassen neutrofielen geïnactiveerd blijven voor verdere ontstekingsremmende en antioxidantstudies.
We gebruikten het luchtzakje experiment om de LPS-geïnduceerde infiltratie van neutrofielen in vivo te verkennen. Deze methode is voorgesteld als een mogelijke methode voor het direct meten van celinfiltratie in de algemene ontstekingsomgeving in vivo.
Het is opmerkelijk dat de luchtzakjestest alleen de functie van de neutrofiel op een orgaan-niet-specifieke manier aantoont en verschillende stappen van de leukocyten rekruteringscascade verwijdert. Aangezien neutrofiele rekrutering voor specifieke organen kan vertrouwen op verschillende orgaaneigenschappen, hechtingsmoleculen en chemokines, is het verkennen van de neutrofiele functionele toestand in orgaanspecifieke omstandigheden van groot belang voor het bestuderen van de rol die neutrofielen mogelijk spelen bij bepaalde ziekten3. Er is gesuggereerd dat endpoint modellen nodig zijn om neutrofiele infiltratie te onderzoeken. Daarom kan het uitvoeren van immunohistochemische vlekken op de gewrichtsdelen van muizen in het AA-model een inzichtelijk perspectief bieden op de neutrofielen in de gezamenlijke ruimte. Volgens onze gegevens worden enorme aantallen neutrofielen aangeworven in het gewrichtsweefsel en dienen ze als fundamenteel bewijs voor verder onderzoek naar het onderbreken van de infiltratie van neutrofielen om RA te behandelen. Daarnaast zijn uitgebreide tests, bijvoorbeeld safranin O-snelle groene kleuring, nodig om het ziektemodel te evalueren voor verder onderzoek.
Neutrofielen zijn de belangrijkste subset van infiltreren ontstekingscellen en werken als de eerste verdedigingslinie tegen binnendringende ziekteverwekkers of weefselletsel20,21. Als neutrofielen in grote aantallen weefsels infiltreren, worden hoge niveaus van cytokines en NET's afgescheiden, die samen de beschermende mechanismen in weefsels kunnen overweldigen en tot weefselschade kunnen leiden. Weefselletsel stimuleert verder neutrofiele infiltratie, waardoor een vicieuze cirkelontstaat 22. Het verstoren van celmigratie door middel van het vangen van geactiveerde cellen in lymfeorganen is voorgesteld als een belangrijke therapeutische benadering en is toegepast in klinische studies met verschillende bijwerkingen23. Het ontdekken van een nieuwe behandeling om tegelijkertijd neutrofiele migratie en ontstekingsactiviteit te reguleren is een veelbelovende strategie voor de behandeling van ontstekingsziekten in de toekomst. Bovendien, als beweeglijkheid-regulerende middelen worden gecombineerd, neutrofiele-gemedieerde levering van geneesmiddelen24 kan verhogen drug specificiteit, waardoor afnemende bijwerkingen.
Verdere wijzigingen kunnen echter worden gecombineerd om de toepassing van bovengenoemde tests te verbreden. Bijvoorbeeld, in de AA muis model, om de algemene indruk van infiltratie van ontstekingscellen in het gewricht te verkrijgen, onderzoekers worden aangemoedigd om enzymatisch verteren gewrichten om de ingezeten leukocyten populaties vrij te geven en vervolgens toe te passen stroom cytometrie te tellen de bevolking.
De protocollen hierin omvatten drie manieren om neutrofiele migratie en infiltratie te beoordelen. De toepassing van deze protocollen is nuttig voor het ontdekken van mogelijke behandelingen voor RA en andere ontstekingsziekten waarbij neutrofielen betrokken zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 81430099 en 31500704), Internationale Samenwerkings- en Uitwisselingsprojecten (subsidienummer 2014DFA32950) en het onderzoeksprogramma van de Beijing University of Chinese Medicine ( subsidienummers BUCM-2019-JCRC006 en 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
