Summary
Här presenterar vi tre metoder för att bedöma neutrofil migration och infiltration både in vivo och in vitro. Dessa metoder kan användas för att upptäcka lovande therapeutics inriktning neutrofil migration.
Abstract
Neutrofiler är en viktig medlem av det medfödda immunsystemet och spelar nyckelroller i värdförsvaret mot patogener och patologiskt inflammatoriska reaktioner. Neutrofiler kan rekryteras till inflammationsplatser via vägledning av cytokiner och kemokiner. Överväldigande infiltration av neutrofiler kan leda till urskillningslösa vävnadsskador, såsom vid reumatoid artrit (RA). Neutrofiler isolerade från peritoneal exsudat svara på en definierad chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro i Transwell eller Zigmond kammare analyser. Luftpåseexperimentet kan användas för att utvärdera neutrofilernas chemotlax mot lipopolysackarider (LPS) in vivo. Den adjuvant-inducerad artrit (AA) mus modell används ofta i RA forskning, och immunohistochemical färgning av gemensamma sektioner med anti-myeloperoxidas (MPO) eller anti-neutrofil elastas (NE) antikroppar är en väletablerad metod för att mäta neutrofil infiltration. Dessa metoder kan användas för att upptäcka lovande terapier som riktar sig till neutrofilmigration.
Introduction
Neutrofiler är de mest rikliga vita blodkropparna och står för 50−70% av hela vita blodkroppar befolkningen hos människor1. Neutrofiler är en av de primära responders under akut inflammation. Neutrofiler kan rekryteras till inflammationsplatser via vägledning av cytokiner och kemokineser som frigörs avvävnadsbosattaceller2,3,4, som förmedlas av interaktionermellan cellviddhesionsmolekyler på ytan av neutrofiler och kärlendotelceller5. Neutrofiler är grundläggande för att vara värd för försvar och spela en roll i patologiskt inflammatoriska reaktioner på grund av deras kraftfulla förmåga att skada vävnad genom utsläpp av reaktiva syrearter (ROS) och andra vävnadsskadliga molekyler3,6.
Tidigare studier har beskrivit flera neutrofilisoleringprotokoll från möss eller människor. Oh et al. visade en densitet gradient separation metod för att isolera mänskliga neutrofiler från hela mänskligt blod7. Isoleringen av tillräckligt med neutrofiler från musblod är dock svår på grund av den lilla blodvolymen. Alternativt kan ett stort antal rena och livskraftiga musneutrofiler framkallas från musperitoneal vätska, och dessa renade neutrofiler kan användas ex vivo för att undersöka flera aspekter av cellulära funktioner ex vivo, inklusive neutrofil infiltration, migration, chemotaxis, oxidativ burst, cytokin och neutrofil extracellulära fälla (NET) produktion8. Transwell assays9 eller Zigmond kammare assays10,11 kan användas för att utvärdera neutrophil migration in vitro. Luftpåsemodellen används för att utvärdera migration och infiltration av neutrofiler in vivo. Den subkutana luftpåsmodellen är en bekväm in vivo djurmodell för att studera migration av inflammatoriska celler.
Traditionellt ansågs neutrofiler som patogeneliminatorer i akuta faser av inflammation. De senaste rönen har dock visat att neutrofiler är komplicerade celler som utför en betydande mängd specialiserade funktioner. Neutrofiler kan reglera många processer såsom akut skada och reparation, tumorigenesis, autoimmun reaktion, och kronisk inflammation12,13. Neutrofiler modulerar också adaptiva immunsvar och kan reglera B-celler och T-celler14,15. Betydande brist på neutrofiler leder till dödlighet eller allvarlig immunbrist hos människor och neutrofil utarmning hos möss leder till dödsfall, medan överdriven aktivering eller rekrytering av neutrofiler i organ orsakar flera immunsjukdomar, såsom reumatoid artrit (RA) och systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofiler är de mest rikliga cellerna i RA-patienternas synovialvätska. Neutrofiler producerar stora mängder myeloperoxidas (MPO) och neutrofilelastas (NE) via nedbrytning, vilket förvärrar broskerosion. MPO är ett peroxidasenzym huvudsakligen uttryckt i granulat av neutrofiler16. NE är associerad med artikulär brosk förstörelse17. MPO och NE skulle kunna användas för att utvärdera status en neutrofil migration och infiltration i vävnaden av RA patienter.
Denna artikel ger tre konventionella metoder för att utvärdera migrationen av normala neutrofiler inducerad både in vivo och in vitro, samt infiltration av patologiska neutrofiler i en mus led-specifik inflammation modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden granskades och godkändes av Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.
OBS: C57BL/6 möss (7-8 veckor) användes.
1. Neutrofil isolering
- Förvärv av peritonealexsudat celler
- Förbered färsk 10% proteose pepton lösning i ddH2O. Beräkna den volym som behövs enligt antalet möss.
OBS: Ställ in antalet möss som N, (2N+1) mL av lösning måste lösas upp och filtreras i förväg. - Spraya arbetsytan med 70% etanol. Använd en insulininjektor för att rita 1 ml peptonlösning och urladdningsbubblor.
- Genomföra den första intraperitoneal injektion en 1 ml pepton lösning per mus.
- Ta musen i en head-down position med en hand. Desinficera injektionsplatsen med alkoholdränkta bomullsbollar.
OBS: Den föredragna injektionspositionen ligger i den laterala aspekten av nedre vänstra eller högra kvadranten i buken. - Ingjuta reagensen snabbt. Injicera 1 ml i peritoneal hålighet en mus med insulininjemertor.
OBS: Vinkeln mellan nålen och huden bör vara ca 15−30° för att undvika att skada tarmen eller andra organ.
- Ta musen i en head-down position med en hand. Desinficera injektionsplatsen med alkoholdränkta bomullsbollar.
- Låt inflammatoriska svar utvecklas över natten. Efter 12 h, genomföra den andra injektionen på samma sätt som den första injektionen.
- Tre timmar efter den andra injektionen, helt bedövning möss med 5% isofluran i 5 min i en gas anestesi kammare med en hastighet av 2 L / min. Ta bort de sövda möss från kammaren och offra dem genom massundersökning störning.
OBS: Tillräckligt djup anestesi säkerställs genom att nypa tårna innan du flyttar möss från kammaren till den enda andningsenheten. Benen ska inte röra sig när tårna kläms.
OBS: Alla följande steg bör bearbetas i en vävnad kultur huva. - Spraya musen med 70% etanol. Lägg musen på en steril plastpad och fixa lemmarna med nålar.
- Använd en steril uppsättning kirurgiska verktyg för att göra ett horisontellt snitt (~ 1 cm) i mitten av nedre delen av buken. Lyft huden i övre delen av buken med pincett och skär längs mittlinjen av buken och exponera intakt peritoneal vägg.
- Injicera 5 ml sterilrpmi-1640 komplett medium i bukhålan med en 30 G x 1/2"-nål. För in nålen genom peritonealväggen med nålens avveledda kant vänd uppåt och injicera hela volymen.
- Skaka dynan horisontellt i 5 min. Massera buken försiktigt flera gånger.
- Injicera en 23 G x 1 1/4"-nål i bukens laterala utrymme. Extrahera bukvätskan (~5 ml) och samla in den i ett 50 ml centrifugrör.
OBS: Placera rören på isså snart som möjligt vid neutrofil aktivering. - Injicera ytterligare 5 ml komplett medium och upprepa proceduren för att ta bort de återstående cellerna från buktett. Slå samman peritonealvätskan i 50 ml centrifugröret.
- Centrifugera den poolade peritonealvätskan vid 400 x g i 10 min vid rumstemperatur (RT).
- Kasta supernatanten. Återsuspendcellerna i 1 ml RPMI-1640 komplett medium.
OBS: Virvel inte för att undvika neutrofil aktivering.
- Förbered färsk 10% proteose pepton lösning i ddH2O. Beräkna den volym som behövs enligt antalet möss.
- Isolering av neutrofiler
- Tillsätt 4 ml nyförberett 70,2% densitetgradientmedium (t.ex. Percoll) i ett centrifugrör på 15 ml.
- Överlägg försiktigt 4 ml nyberedd 54,8% densitet gradient medium på 70,2% densitet lutning medium långsamt längs kanten av röret med skarpa pipett spetsar i 15 ml centrifugröret.
OBS: Var försiktig för att undvika att störa gränssnittet mellan 54,8% densitet gradient medium och 70,2% densitet gradient medium. - Överlägg försiktigt 1 ml peritoneal cell suspension ovanpå 54,8% densitet gradient medellager långsamt med skarpa pipett tips(figur 1A).
OBS: Var försiktig för att undvika att störa gränssnittet mellan cellfjädringen och 54,8% densitet gradient medium. - Centrifugera vid 1 500 x g i 30 min vid 22 °C utan bromsning.
- Samla neutrofiler vid gränssnittet för 54,8% densitet gradient medium och 70,2% densitet gradient medellager(figur 1B)till ett nytt rör.
- Tillsätt 1 ml RPMI-1640 komplett medium till de insamlade cellerna och försiktigt resuspend celler genom att försiktigt pipetting flera gånger. Centrifugera vid 100 x g i 10 min på RT och ta försiktigt bort supernatanten.
- Upprepa tvättsteget (steg 1.2.6) en gång.
- Tillsätt 0,5 ml odlingsmedium till pelleten och resuspend celler genom att försiktigt pipetting flera gånger. Ta en 50 μL alikvot för att räkna cellerna med hjälp av en automatisk hematologi analysator.
2. Neutrofil migration analys
- Mät neutrofil migration av Transwell assay9 eller Zigmond kammare analys som tidigare beskrivits10,11.
3. Luftpåse analys
- Första luftinjektionen
- På dag 0, helt bedövning möss med 5% isofluran i 3 min i en gas anestesi kammare med en hastighet av 2 L / min, och upprätthålla anestesi av varje mus i en enda andningsenhet med 2% isofluran med en hastighet av 0,5 L / min.
OBS: Tillräckligt djup anestesi säkerställs genom att nypa tårna innan du flyttar möss från kammaren till den enda andningsenheten. Benen ska inte röra sig när tårna kläms. - Använd ett 0,22 μm filter fäst vid en 5 ml spruta för att få en 3 ml volym steriliserad luft.
- Lyft den bakre huden på den sövda musen med pincett och subkutant injicera 3 ml steriliserad luft med en 26 G x 3/8"-nål.
- Efter behandlingen, ta bort mössen från andningsenheten. Övervaka mössen för att säkerställa att de lever tills de börjar röra sig.
- På dag 0, helt bedövning möss med 5% isofluran i 3 min i en gas anestesi kammare med en hastighet av 2 L / min, och upprätthålla anestesi av varje mus i en enda andningsenhet med 2% isofluran med en hastighet av 0,5 L / min.
- Andra luftinsprutning
- På dag 3, injicera ytterligare 3 ml steriliserad luft i den tidigare etablerade luftfickan för att upprätthålla luftpåsen enligt beskrivningen i avsnitt 3.1.
- Behandling
- På dag 6, 6 h före uppoffring, injicera olika behandlingar i luftpåsen. Injicera 1 ml fosfatbuffbuffrad realine (PBS) som en negativ kontroll. Injicera 1 ml av 1 μg/ml LPS som positiv kontroll för att framkalla lokal inflammation.
- Helt anestesi möss med 5% isofluran i 3 min i en gasanestesikammare med en hastighet av 2 L/min, och håll anestesin hos varje mus i en enda andningsenhet med 2% isofluran med en hastighet av 0,5 L/min. Förbered tvättbuffert enligt materialbord.
OBS: Tillräckligt djup anestesi säkerställs genom att nypa tårna innan du flyttar möss från kammaren till den enda andningsenheten. Benen ska inte röra sig när tårna kläms. - För varje luftpåse, tvätta luftpåsen med 1 ml tvättbuffert och samla in den inflammatoriska exsudat i ett centrifugrör på 15 ml. Tvätta luftpåsen med 2 ml tvättbuffert 2x och samla in den inflammatoriska exsudat i samma centrifugrör.
- Centrifugera vid 100 x g i 10 min på RT. Kasta de supernatant och resuspend cellerna i 1 ml tvättbuffert. Räkna cellerna för att kvantifiera neutrofilförhållandet med hjälp av den automatiska hematologianalysatorn.
SE representativa resultat i figur 2.
4. Induktion av adjuvant-inducerad artrit (AA) musmodell
- Avbryt komplett freunds adjuvans (CFA) genom att virvla minst 5 s och dra sedan 100 μL suspension till en insulininjektor.
OBS: Vi rekommenderar att du använder helt ny CFA i experiment för att säkerställa sterilitet. - Bedövningmössor möss enligt beskrivningen i steg 3.1.1.
- Markera den valda tassen och injicera 20 μL CFA i fotledens ledutrymme. Injicera 20 μl fjädring i fyra periartikulära fläckar på den valda tassen (totalt 80 μL).
- Ta bort möss från andningsenheten och lägg de bearbetade mössen i en ny kammare. Övervaka möss för att säkerställa att de andas tills de återfår förmågan att röra sig.
- Var tredje dag, bedöma leddiametern genom att mäta fotledens diameter med hjälp av en ficktjockleksmätare(figur 3A).
- Var tredje dag, bedöma artrit svårighetsgrad genom artrit scoring kriterium(Figur 3C): 0, normal, inga bevis för erytem och svullnad; 1, den mildaste artrit, erytem och mild svullnad begränsas till tarsals eller fotled fotled; 2, måttlig artrit, erytem och mild svullnad sträcker sig från fotleden till tarsals; 3, svår artrit, erytem och måttlig svullnad som sträcker sig från fotleden till mellanfotsleder; 4, den allvarligaste artrit, erytem och svår svullnad omfattar fotled, fot och siffror, eller ankylosis i lemmen.
5. Immunohistochemical färgning av gemensamma sektioner
- Gemensam isolering
- Offra musen i avsnitt 4 med hjälp av livmoderhalscancer störning efter anestesi med isofluran. Spraya musen med 70% etanol.
- Ta bort huden och en del av muskeln från bakbenet med pincett och sax. Spraya leden med 70% etanol och ta bort resten av musklerna med hjälp av en pappershandduk.
- Fixa fotleden i 4% paraformaldehyd i 2 dagar på RT. Decalcify leden i 10% EDTA i 1 månad på RT och ändra mediet varje vecka.
- Bädda in vävnaden i paraffin och förbered 4 μm tjocka vävnadssektioner.
- Placera vävnad i en märkt form med viss volym flytande paraffin. Cool kort.
- Ställ in tjockleken på 4 μm och skär skivor på ett mikrotom. Flyta sektioner i en 43 ° C vattenbad.
- Montera sektionerna på diabilder och lägg rutschkanorna i ugnen vid 70 °C för 2 h. För framtida bruk, spara bilderna vid -20 °C.
- Safranin O och snabb grön färgning av gemensamma sektioner
OBS: Följande färgningssteg utförs på RT.- Placera bilderna från steg 5.1.4.3 i ett rack och utför följande tvättar för att rehydrera på RT: xylen i 5 min (3x), 100% etanol i 2 min (2x), 95% etanol för 2 min (2x), 70% etanol för 2 min och 50% etanol i 15 min. Tvätta i rinnande kranvatten i 3 min.
- Fläck i 0,1% snabb grön lösning för 5 min. Skölj i 1% ättiksyra för 10 s.
- Fläck i 0,1% safranin O färgningslösning i 20 min. Sänk ner bilderna i följande tvättar: 95% etanol för 2 min (2x), 100% etanol för 2 min (2x) och xylen i 2 min (2x).
- Montera vävnadssektionerna och observera vävnaderna under ett mikroskop.
SE representativa bilder i figur 4A.
- Immunohistochemical färgning för att visualisera neutrofiler
- Grädda paraffinsektionerna för 2 h vid 78 °C. Placera rutschkanorna i ett rack och utför följande tvättar för att rehydrera på RT: xylen i 15 min (2x), 100% etanol i 5 min (2x), 95% etanol i 5 min, 80% etanol i 5 min, H2O i 3 min och PBS i 3 min.
OBS: Låt inte bilderna torka när som helst under detta steg. - Tillsätt en droppe permeabiliseringbuffert för att täcka vävnaden. Inkubera sektioner i en fuktighetsstyrd bricka vid 37 °C.
- Skölj rutschkanorna i PBS i 3 min (3x). Undvik sköljvävnaden direkt.
- Utför värmeinducerad antigenepitophämtning med hjälp av en tryckpanna.
- Ordna bilder i ett rack. Sänk ned gliderna i tryckpannan fylld med hämtningsbuffert.
- Sätt tryckpannan på en mikrovågsugn. Ställ mikrovågsugnen på 600 W och värm rutschbanorna i 10 min.
- Efter kokning, håll diabilder i pannan för att svalna till 90 °C. Ta ut bilderna och skölj dem i PBS i 3 min (3x).
- Släck endogen aoxidasaktivitet i nyberedd 3% H2O2 vid RT i 15 min. Skölj diabilder i PBS i 3 min (3x).
- Skissera en stor cirkel runt provet med en hydrofoba penna, undvik att vidröra provet. Block med 3% bovinserumalbumin (BSA) i en fuktighetsstyrd kammare vid 37 °C i 60 min.
- Ta bort blockeringslösning. Tillsätt 50 μl pbs-utspädd primär antikropp till varje avsnitt snabbt. Inkubera sedan rutschkanorna i ett fuktstyrt fack vid 4 °C över natten.
OBS: Olika utspädningsförhållanden används för olika antikroppar (1:25 för MPO och 1:20 för NE). - På den andra dagen, ta ut facket och låt den stå på RT i 30 min. Skölj sedan bilderna i PBS i 3 min (3x).
- Tillsätt 50 μl PBS-utspädda sekundära antikroppar till vävnaden.
OBS: Olika utspädningsförhållanden tillämpades: 1:1 000 för MPO och 1:1 500 för NE. - Inkubera rutschkanor i ett fuktstyrt fack vid 37 °C i 30 min. Skölj sedan bilderna i PBS i 3 min (3x).
- Utveckla i utspädd 3,3'-diaminobenzidin (DAB) lösning i 5 min. Håll ett öga på reaktionen i händelse av utvecklingen av en mörk färg. Skölj rutschkanorna i destillerat vatten.
- Motfärga bilderna i hematoxylin i 10 s. Skölj rutschkanorna i kranvatten i 5 min.
- Skölj i syra alkohol supersnabb differentieringlösning för 3 s. Skölj sedan i kranvatten i 10 min.
- Sänk ned rutschkanorna i följande tvättar på RT: 80% etanol i 5 min, 95% etanol för 5 min, 100% etanol i 5 min och xylen i 15 min (2x). Fäst täckslipen med monteringslösning. Observera vävnaden under ett mikroskop.
SE representativa bilder i figur 4B.
- Grädda paraffinsektionerna för 2 h vid 78 °C. Placera rutschkanorna i ett rack och utför följande tvättar för att rehydrera på RT: xylen i 15 min (2x), 100% etanol i 5 min (2x), 95% etanol i 5 min, 80% etanol i 5 min, H2O i 3 min och PBS i 3 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peritoneal exsudat celler samlades in från lavage vätska av möss. Cellerna avbröts i 1 ml RPMI-1640 komplett medium, skiktat på ett tvåstegs (54,8%/70,2%) diskontinuerlig densitetgradient(figur 1A)och centrifugeras vid 1 500 x g i 30 min. Neutrofiler (≥95%, ~1 x 107 neutrofiler/mus) återfanns från det nedre gränssnittet(figur 1B).
Luftpåse experiment utfördes för att undersöka neutrofil rekrytering stimuleras av LPS in vivo(Figur 2A). De leukocyte delmängder na i luftpåsen mättes (figur 2B).
Neutrofil migration i RA utvärderades via CFA-inducerad artrit murin modell. Jämfört med kontrollgruppen visade AA-gruppen betydande ödem i tassen. I AA-gruppen ökade fotledens diameter (figur 3B)och artritpoängen steg konsekvent (figur 3D).
Broskskador är det representativa syndromet av RA, safranin O-snabb grön brosk färgning utfördes för att bedöma brosk skador i AA mus. Som visas i figur 4A,CFA utmaning inducerad en stor mängd leukocyte infiltration, betydande brosk erosion och synovial hyperplasi. MPO och NE uttrycknivåer är representativa markörer för neutrofil infiltration. Immunohistokemiska analyser utfördes för att observera neutrofil infiltration i lederna. MPO- och NE-uttrycket var betydligt uppreglerat i det gemensamma avsnittet(figur 4B).
Figur 1: Neutrophil isolering. (A)Peritoneal exsudat celler återsuspenderade i 1 ml RPMI-1640 komplettmedium var skiktade på en tvåstegs (54,8%/70,2%) diskontinuerlig densitetgradient. (B)Efter centrifugering vid 1 500 x g i 30 min återfanns neutrofiler (≥95%, ~1 x 107 neutrofiler/mus) från det nedre gränssnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa resultat av luftpåsen analysen. (A)Illustration av luftpåsen analysen. (B)Representativa resultat av infiltration av leukocyte i analysen av luftpåse. PBS: kontroll; LPS: 1 μg/mL LPS. Data presenteras som medelvärdet ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa resultat av adjuvant-inducerad artrit (AA) mus modell. (A)Fotledens diameter mättes med hjälp av en ficktjockleksmätare. (B)Ledsvullnad bedömdes baserat på fotledens diameter (n = 7). (C)Bilder av varje artrit poäng. (D)Svårighetsgraden av artrit bedömdes på en skala från 0−4 punkter (n = 7). Data presenteras som medelvärdet ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa resultat av safranin O-snabb grön broskfärgning och immunohistochemical analys av gemensamma sektioner från kontroll och AA möss. A)Representativa resultat av safranin O-snabb grön broskfärgning av gemensamma sektioner. (B)Representativa resultat av uttrycksnivån för mpo och NE i fotlederna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljerade protokoll av mycket renade neutrofiler från perifert blod7,benmärg och vävnader18 har funnits under lång tid. Här antar vi en metod för att isolera neutrofiler från peritoneal vätska19 där mogna neutrofiler förblir inaktiverade för ytterligare antiinflammatoriska och antioxidant studier.
Vi använde luftpåsen experimentet för att utforska LPS-inducerad infiltration av neutrofiler in vivo. Denna metod har föreslagits som en potentiell metod för direkt mätning av cellinfiltration i den allmänna inflammatoriska miljön in vivo.
Det är anmärkningsvärt att luftpåsen analysen endast visar neutrofil funktion på ett organ-ospecifikt sätt och tar bort flera steg i leukocyte rekrytering kaskad. Eftersom neutrofil rekrytering till specifika organ kan förlita sig på olika organegenskaper, vidhäftning molekyler och kemokineser, utforska neutrofila funktionella tillstånd i organspecifika villkor är av stor betydelse för att studera den roll som neutrofiler potentiellt spelar i vissa sjukdomar3. Det har föreslagits att slutpunktmodeller krävs för att undersöka neutrofil infiltration. Därför kan utföra immunohistochemical färgning på de gemensamma delarna av möss i AA-modellen ge ett insiktsfullt perspektiv på neutrofiler i det gemensamma utrymmet. Enligt våra uppgifter rekryteras ett stort antal neutrofiler in i ledvävnaden och fungerar som grundläggande bevis för ytterligare forskning om att avbryta infiltrationen av neutrofiler för att behandla RA. Dessutom krävs omfattande analyser, till exempel safranin O-snabb grön färgning, för att utvärdera sjukdomsmodellen för vidare studier.
Neutrofiler är den stora delmängd av infiltrera inflammatoriska celler och fungerar som den första försvarslinjen mot invaderande patogener eller vävnadsskada20,21. Om neutrofiler infiltrerar vävnader i stort antal, utsöndras höga nivåer av cytokiner och nets, vilket tillsammans kan överväldiga de skyddande mekanismerna i vävnader och leda till vävnadsskador. Vävnadsskada stimulerar ytterligare neutrofil infiltration, vilket bildar en ond cirkel22. Störa cellmigration med hjälp av att fånga aktiverade celler i lymfoida organ har föreslagits som en viktig terapeutisk metod och har tillämpats i kliniska prövningar med olika biverkningar23. Att upptäcka en ny behandling för att samtidigt reglera neutrofilmigration och inflammatorisk aktivitet är en lovande strategi för behandling av inflammatoriska sjukdomar i framtiden. Dessutom, om motilitet-reglerande medel kombineras, neutrofil-medierad läkemedelsleverans24 kan öka läkemedelsspecificitet, vilket minskar biverkningar.
Ytterligare ändringar kan dock kombineras för att bredda tillämpningen av ovannämnda analyser. Till exempel, i AA musmodell, för att få helhetsintryck av infiltration av inflammatoriska celler i leden, forskare uppmuntras att enzymatiskt smälta leder för att frigöra de bosatta leukocyte populationer och sedan tillämpa flöde cytometri för att räkna populationerna.
Protokollen omfattar häri tre sätt att bedöma neutrofilmigration och infiltration. Tillämpningen av dessa protokoll är användbar för att upptäcka potentiella behandlingar för RA och andra inflammatoriska sjukdomar som involverar neutrofiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 81430099 och 31500704), International Cooperation and Exchange Projects (bidragsnummer 2014DFA32950) och forskningsprogrammet för Beijing University of Chinese Medicine ( bidragBUCM-2019-JCRC006 och 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
