Summary
Ici, nous présentons trois méthodes pour évaluer la migration et l’infiltration de neutrophiles in vivo et in vitro. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.
Abstract
Les neutrophiles sont un membre important du système immunitaire inné et jouent un rôle central dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes et les réactions inflammatoires pathologiques. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de cytokines et de chemokines. L’infiltration écrasante des neutrophiles peut mener aux dommages aveugles de tissu, tels que dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Les neutrophiles isolés de l’exsudation péritonéale répondent à un chimioattractant défini, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro dans les essais de chambre de Transwell ou de Zigmond. L’expérience de poche d’air peut être employée pour évaluer la chimiotaxis des neutrophiles vers le lipopolysaccharide (LPS) in vivo. Le modèle de souris de l’arthrite adjuvant-induite (AA) est fréquemment employé dans la recherche de RA, et la coloration immunohistochemical des sections articulaires avec des anticorps anti-myeloperoxidase (MPO) ou anti-neutrophile d’élastase (NE) est une méthode bien établie pour mesurer neutrophile infiltration. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.
Introduction
Les neutrophiles sont les globules blancs les plus abondants et représentent 50 à 70 % de l’ensemble de la population de globules blancs chez l’homme1. Les neutrophiles sont l’un des principaux intervenants pendant l’inflammation aigue. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de la direction des cytokines et des chimiokines libérées par les cellules de tissu-résident2,3,4, qui est médiée par les interactions entre les molécules d’adhérence cellulaire à la surface des neutrophiles et des cellules endothéliumvasculaires 5. Les neutrophiles sont fondamentaux pour accueillir la défense et jouent un rôle dans les réactions inflammatoires pathologiques en raison de leur capacité puissante à endommager les tissus par la libération d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et d’autres molécules tissulairesnuisibles 3,6.
Des études antérieures ont décrit plusieurs protocoles d’isolement des neutrophiles de souris ou d’humains. Oh et coll. ont démontré une méthode de séparation de gradient de densité pour isoler les neutrophiles humains du sang humain entier7. Cependant, l’isolement des neutrophiles suffisants du sang de souris est difficile en raison du petit volume sanguin. Alternativement, un grand nombre de neutrophiles purs et viables de souris peuvent être obtenus du fluide péritonéal de souris, et ces neutrophiles purifiés peuvent être employés ex vivo pour examiner plusieurs aspects des fonctions cellulaires ex vivo, y compris l’infiltration de neutrophile, migration, chemotaxis, burstoxydative, cytokine et neutrophil extracellulaire de production (NET)8. Transwell analyse9 ou Zigmond essais de chambre10,11 peut être utilisé pour évaluer la migration neutrophile in vitro. Le modèle de poche d’air est utilisé pour évaluer la migration et l’infiltration des neutrophiles in vivo. Le modèle sous-cutané de poche d’air est un modèle animal in vivo commode pour étudier la migration des cellules inflammatoires.
Traditionnellement, les neutrophiles étaient considérés comme des éliminateurs pathogènes dans les phases aigues de l’inflammation. Cependant, les résultats récents ont prouvé que les neutrophiles sont des cellules compliquées qui exécutent une variété significative de fonctions spécialisées. Neutrophils peuvent réguler de nombreux processus tels que les blessures et la réparation aigus, tumorigenesis, réponse auto-immune, et l’inflammation chronique12,13. Les neutrophiles modulent également les réponses immunitaires adaptatives et peuvent réguler les cellules B et les lymphocytes T14,15. La pénurie substantielle de neutrophiles entraîne la mortalité ou une grave immunodéficience chez l’homme et l’épuisement des neutrophiles chez la souris entraîne une mortalité, tandis qu’une activation ou un recrutement excessif de neutrophiles dans les organes provoque plusieurs maladies immunitaires, telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’érythématatus systémique (SLE)6. Les neutrophiles sont les cellules les plus abondantes dans le liquide synovial des patients atteints de PR. Les neutrophiles produisent des quantités excessives de myeloperoxidase (MPO) et d’élastase de neutrophile (NE) par dégradation, ce qui exacerbe l’érosion du cartilage. MPO est une enzyme peroxidase principalement exprimée dans les granules de neutrophiles16. NE est associé à la destruction du cartilage articulaire17. MPO et NE pourraient être utilisés pour évaluer l’état de la migration des neutrophiles et l’infiltration dans le tissu des patients atteints de PR.
Cet article fournit trois méthodes conventionnelles pour évaluer la migration des neutrophiles normaux induits in vivo et in vitro, aussi bien que l’infiltration des neutrophiles pathologiques dans un modèle d’inflammation joint-spécifique de souris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine chinoise de Beijing.
REMARQUE : Des souris C57BL/6 (7-8 semaines) ont été employées.
1. Isolement de Neutrophile
- Acquisition de cellules exsudatrices péritonéaux
- Préparer la solution peptone protéose fraîche de 10% dans ddH2O. Calculez le volume nécessaire en fonction du nombre de souris.
REMARQUE : Définir le nombre de souris en tant que N, (2N-1) mL de solution doit être dissous et filtré à l’avance. - Vaporiser l’espace de travail avec 70% d’éthanol. Utilisez un injecteur d’insuline pour dessiner 1 ml de solution de peptone et des bulles de décharge.
- Effectuer la première injection intrapéritonéale de 1 ml de solution peptone par souris.
- Prenez la souris en position tête baissée d’une main. Désinfecter le point d’injection avec des boules de coton imbibées d’alcool.
REMARQUE : La position d’injection préférée réside dans l’aspect latéral du quadrant inférieur gauche ou droit de l’abdomen. - Infuser les réactifs rapidement. Injecter 1 mL dans la cavité péritonéale de chaque souris avec l’injecteur d’insuline.
REMARQUE : L’angle entre l’aiguille et la peau doit être d’environ 15 à 30 degrés pour éviter de blesser l’intestin ou d’autres organes.
- Prenez la souris en position tête baissée d’une main. Désinfecter le point d’injection avec des boules de coton imbibées d’alcool.
- Laisser la réponse inflammatoire se développer pendant la nuit. Après 12 h, effectuez la deuxième injection de la même manière que la première injection.
- Trois heures après la deuxième injection, anesthésier entièrement les souris avec 5% d’isoflurane pendant 5 min dans une chambre d’anesthésie gazeuse à une vitesse de 2 L/min. Retirez les souris anesthésiées de la chambre et sacrifiez-les par luxation cervicale.
REMARQUE : Une profondeur suffisante de l’anesthésie est assurée en pinçant les orteils avant de déplacer les souris de la chambre à l’unité respiratoire unique. Les jambes ne doivent pas bouger lorsque les orteils sont pincés.
REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être traitées dans une hotte de culture tissulaire. - Vaporiser la souris avec 70% d’éthanol. Poser la souris sur un tampon en plastique stérile et fixer les membres avec des aiguilles.
- Utilisez un ensemble stérile d’outils chirurgicaux pour faire une incision horizontale (1 cm) au milieu du bas-ventre. Soulevez la peau du haut de l’abdomen avec des forceps et coupez le long de la ligne médiane de l’abdomen et exposez la paroi péritonéale intacte.
- Injecter 5 ml de RPMI-1640 stérile milieu complet dans la cavité abdominale avec une aiguille de 30 G x 1/2 po. Insérez l’aiguille à travers la paroi péritonéale avec le bord bevé de l’aiguille vers le haut et injectez tout le volume.
- Secouez le tampon horizontalement pendant 5 min. Massez doucement l’abdomen plusieurs fois.
- Injecter une aiguille de 23 G x 1 1/4 po dans l’espace latéral de l’abdomen. Extraire le liquide abdominal (5 ml) et le ramasser dans un tube centrifugeuse de 50 ml.
REMARQUE : Placez les tubes sur la glace dès que possible en cas d’activation du neutrophile. - Injecter un autre 5 ml de milieu complet et répéter la procédure pour enlever les cellules restantes du péritoine. Mettre en commun le liquide péritonéal dans le tube de centrifugeuse de 50 ml.
- Centrifuger le liquide péritonéal mis en commun à 400 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Jetez le supernatant. Resuspendre les cellules dans 1 ml de RPMI-1640 milieu complet.
REMARQUE : Ne pas vortex pour éviter l’activation de neutrophiles.
- Préparer la solution peptone protéose fraîche de 10% dans ddH2O. Calculez le volume nécessaire en fonction du nombre de souris.
- Isolement des neutrophiles
- Ajouter 4 ml de milieu de gradient de densité fraîchement préparé de 70,2 % (p. ex., Percoll) dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
- Recouvrez soigneusement 4 ml de milieu de gradient de densité fraîchement préparé de 54,8 % sur le milieu de gradient de densité de 70,2 % lentement le long du bord du tube avec des pointes pointues de pipette dans le tube de centrifugeuse de 15 ml.
REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter de perturber l’interface entre le milieu de gradient de densité de 54,8 % et le milieu de gradient de densité de 70,2 %. - Superposez soigneusement la suspension péritonéale de 1 ml sur la couche moyenne de gradient de densité de 54,8 % lentement avec des pointes pointues de pipette (Figure 1A).
REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter de perturber l’interface entre la suspension cellulaire et le milieu de gradient de densité de 54,8 %. - Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 30 min à 22 oC sans freinage.
- Recueillir les neutrophiles à l’interface du milieu de gradient de densité de 54,8 % et les couches moyennes de gradient de densité de 70,2 % (figure 1B) jusqu’à un nouveau tube.
- Ajouter 1 ml de RPMI-1640 milieu complet aux cellules recueillies et soigneusement resuspendre les cellules en pipetting doucement plusieurs fois. Centrifugeuse à 100 x g pendant 10 min à RT et retirez soigneusement le supernatant.
- Répétez l’étape de lavage (étape 1.2.6) une fois.
- Ajouter 0,5 ml de milieu de culture à la pastille et resuspendre les cellules en tapotage doucement plusieurs fois. Prenez un aliquot de 50 L pour compter les cellules à l’aide d’un analyseur d’hématologie automatique.
2. Neutrophile migration d’assay
- Mesurer la migration des neutrophiles partranswell 9 ou Zigmond chambre d’assay comme décrit précédemment10,11.
3. Air pouch assay
- Première injection d’air
- Le jour 0, anesthésier entièrement les souris avec 5% d’isoflurane pendant 3 min dans une chambre d’anesthésie gazeuse à une vitesse de 2 L/min, et maintenir l’anesthésie de chaque souris dans une seule unité respiratoire avec 2% d’isoflurane à une vitesse de 0,5 L/min.
REMARQUE : Une profondeur suffisante de l’anesthésie est assurée en pinçant les orteils avant de déplacer les souris de la chambre à l’unité respiratoire unique. Les jambes ne doivent pas bouger lorsque les orteils sont pincés. - Utilisez un filtre de 0,22 m fixé à une seringue de 5 ml pour obtenir un volume d’air stérilisé de 3 ml.
- Soulevez la peau arrière de la souris anesthésiée à l’aide d’une pince à épiler et injectez sous-cutanée 3 ml d’air stérilisé à l’aide d’une aiguille de 26 G x 3/8 po.
- Après le traitement, retirer les souris de l’unité respiratoire. Surveillez les souris pour s’assurer qu’elles sont vivantes jusqu’à ce qu’elles commencent à se déplacer.
- Le jour 0, anesthésier entièrement les souris avec 5% d’isoflurane pendant 3 min dans une chambre d’anesthésie gazeuse à une vitesse de 2 L/min, et maintenir l’anesthésie de chaque souris dans une seule unité respiratoire avec 2% d’isoflurane à une vitesse de 0,5 L/min.
- Deuxième injection d’air
- Le jour 3, injectez 3 ml d’air stérilisé de plus dans la poche d’air précédemment établie pour soutenir la poche d’air décrite à la section 3.1.
- Traitement
- Le jour 6, 6 h avant le sacrifice, injectez différents traitements dans la poche d’air. Injecter 1 ml de salin tamponné par le phosphate (PBS) comme un contrôle négatif. Injecter 1 ml de 1 G/mL LPS comme le contrôle positif pour induire l’inflammation locale.
- Anesthésier entièrement les souris avec 5% d’isoflurane pendant 3 min dans une chambre d’anesthésie à gaz à une vitesse de 2 L/min, et maintenir l’anesthésie de chaque souris dans une seule unité respiratoire avec 2% d’isoflurane à une vitesse de 0,5 L/min. Préparer tampon de lavage selon le tableau des matériaux.
REMARQUE : Une profondeur suffisante de l’anesthésie est assurée en pinçant les orteils avant de déplacer les souris de la chambre à l’unité respiratoire unique. Les jambes ne doivent pas bouger lorsque les orteils sont pincés. - Pour chaque sachet d’air, laver la poche d’air avec 1 ml de tampon de lavage et recueillir l’exsudat inflammatoire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Laver la poche d’air avec 2 ml de tampon de lavage 2x et recueillir l’exsudat inflammatoire dans le même tube de centrifugeuse.
- Centrifugeuse à 100 x g pendant 10 min à RT. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon de lavage. Compter les cellules pour quantifier le rapport neutrophile à l’aide de l’analyseur d’hématologie automatique.
REMARQUE : Voir les résultats représentatifs à la figure 2.
4. Induction du modèle de souris adjuvant-induite (AA) de souris
- Suspendre l’adjuvant complet de Freund (CFA) en vortexant au moins 5 s, puis tirer 100 l de suspension dans un injecteur d’insuline.
REMARQUE : Nous vous recommandons d’utiliser un CFA complètement nouveau dans des expériences pour assurer la stérilité. - Anesthésiez les souris telles que décrites à l’étape 3.1.1.
- Marquez la patte choisie et injectez 20 ll de CFA dans l’espace articulaire de la cheville. Injecter 20 ll de suspension en quatre taches périarticulaires sur la patte choisie (80 l au total).
- Retirez les souris de l’unité respiratoire et mettez les souris traitées dans une nouvelle chambre. Surveillez les souris pour s’assurer qu’elles respirent jusqu’à ce qu’elles retrouvent la capacité de se déplacer.
- Tous les 3 jours, évaluez le diamètre de l’articulation en mesurant le diamètre de l’articulation de la cheville à l’aide d’une jauge d’épaisseur de poche (Figure 3A).
- Tous les 3 jours, évaluer la gravité de l’arthrite selon le critère de notation de l’arthrite (figure 3C) : 0, normal, aucune preuve d’érythème et de gonflement; 1, l’arthrite la plus douce, l’érythème et l’enflure douce confinées aux goudrons ou à l’articulation de cheville ; 2, arthrite modérée, érythème et gonflement doux s’étendant de la cheville aux tarsales ; 3, arthrite grave, érythème et gonflement modéré s’étendant de la cheville aux joints métatarsiaux ; 4, l’arthrite la plus grave, l’érythème et l’enflure grave englobent la cheville, le pied et les chiffres, ou l’ankylose du membre.
5. coloration immunohistochimique des sections articulaires
- Isolement conjoint
- Sacrifiez la souris dans la section 4 en utilisant la dislocation cervicale après anesthésie avec l’isoflurane. Vaporiser la souris avec 70% d’éthanol.
- Retirer la peau et une partie du muscle de la patte postérieure à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux. Vaporiser l’articulation avec 70% d’éthanol et enlever le reste des muscles à l’aide d’un essuie-tout.
- Fixez l’articulation de la cheville dans 4% de paraformaldéhyde pendant 2 jours à RT. Décalcifier l’articulation dans 10% EDTA pendant 1 mois à RT et changer le moyen hebdomadaire.
- Enclenchez le tissu dans la paraffine et préparez des sections de tissu de 4 m d’épaisseur.
- Placer le tissu dans un moule marqué avec un certain volume de paraffine liquide. Refroidir brièvement.
- Fixer l’épaisseur à 4 m et couper les tranches sur un microtome. Sections de flotteur dans un bain d’eau de 43 oC.
- Monter les sections sur des toboggans et les mettre dans le four à 70 oC pendant 2 h. Pour une utilisation future, conservez les toboggans à -20 oC.
- Safranin O et coloration verte rapide des sections communes
REMARQUE : Les étapes de coloration suivantes sont effectuées à RT.- Placez les glissières de l’étape 5.1.4.3 dans un rack et effectuez les lavages suivants pour se réhydrater à RT : xylène pour 5 min (3x), 100% éthanol pour 2 min (2x), 95% d’éthanol pour 2 min (2x), 70% d’éthanol pour 2 min, et 50% d’éthanol pour 15 min. Laver dans l’eau courante du robinet pendant 3 min.
- Tache dans la solution verte rapide de 0.1% pendant 5 min. Rincer dans 1% acide acétique pendant 10 s.
- Tache dans la solution de coloration safranine O de 0,1 % pendant 20 min. Immerger les lames dans les lavages suivants : 95 % d’éthanol pour 2 min (2x), 100 % d’éthanol pour 2 min (2x) et xylène pendant 2 min (2x).
- Montez les sections de tissu et observez les tissus au microscope.
REMARQUE : Voir les images représentatives dans la figure 4A.
- Coloration immunohistochimique pour visualiser les neutrophiles
- Cuire les sections de paraffine pendant 2 h à 78 oC. Placez les lames dans une grille et effectuez les lavages suivants pour les réhydrater à RT : xylène pendant 15 min (2x), 100 % d’éthanol pour 5 min (2x), 95 % d’éthanol pour 5 min, 80 % d’éthanol pour 5 min, H2O pour 3 min et PBS pendant 3 min.
REMARQUE : Ne laissez pas sécher les glissières à tout moment pendant cette étape. - Ajouter une goutte de tampon de perméabilisation pour couvrir le tissu. Incuber les sections dans un plateau à humidité contrôlée à 37 oC.
- Rincer les diapositives en PBS pendant 3 min (3x). Évitez de rincer directement le tissu.
- Effectuer la récupération d’épitope d’antigène induite par la chaleur à l’aide d’une chaudière à pression.
- Disposer les glissières dans un rack. Immerger les glissières dans la chaudière à pression remplie d’un tampon de récupération.
- Mettre la chaudière à pression sur un four à micro-ondes. Placez le four à micro-ondes à 600 W et chauffez les lames pendant 10 min.
- Après l’ébullition, garder les glissières dans la chaudière pour les refroidir jusqu’à 90 oC. Sortez les diapositives et rincez-les en PBS pendant 3 min (3x).
- Éteind l’activité endogène peroxidase dans les 3% H2O 2 fraîchementpréparés à RT pendant 15 min. Rincer les diapositives en PBS pendant 3 min (3x).
- Décrivez un grand cercle autour de l’échantillon avec un stylo hydrophobe, évitez de toucher l’échantillon. Bloquer avec 3% d’albumine de sérum bovin (BSA) dans une chambre à humidité contrôlée à 37 oC pendant 60 min.
- Supprimer la solution de blocage. Ajouter rapidement 50 oL d’anticorps primaires dilués PBS à chaque section. Ensuite, incuber les toboggans dans un plateau à humidité contrôlée à 4 oC pendant la nuit.
REMARQUE : Différents rapports de dilution sont utilisés pour différents anticorps (1:25 pour LE MPO et 1:20 pour NE). - Le deuxième jour, sortir le plateau et laisser reposer à RT pendant 30 min. Ensuite, rincez les diapositives en PBS pendant 3 min (3x).
- Ajouter 50 L d’anticorps secondaires dilués par PBS dans le tissu.
REMARQUE : Différents ratios de dilution ont été appliqués : 1:1 000 pour MPO et 1:1,500 pour NE. - Incuber les toboggans dans un plateau à humidité contrôlée à 37 oC pendant 30 min. Ensuite, rincez les diapositives en PBS pendant 3 min (3x).
- Développer en dilué 3,3'-diaminobenzidine (DAB) solution pendant 5 min. Gardez un œil sur la réaction en cas de développement d’une couleur foncée. Rincer les lames dans de l’eau distillée.
- Counterstain les diapositives dans l’hématoxyline pendant 10 s. Rincer les diapositives dans l’eau du robinet pendant 5 min.
- Rincer à l’alcool acide solution de différenciation superrapide pour 3 s. Rincer ensuite à l’eau du robinet pendant 10 min.
- Immerger les diapositives dans les lavages suivants à RT : 80 % d’éthanol pour 5 min, 95 % d’éthanol pour 5 min, 100 % d’éthanol pour 5 min et xylène pendant 15 min (2x). Fixez le bordereau de couverture avec la solution de montage. Observez le tissu au microscope.
REMARQUE: Voir les images représentatives dans la figure 4B.
- Cuire les sections de paraffine pendant 2 h à 78 oC. Placez les lames dans une grille et effectuez les lavages suivants pour les réhydrater à RT : xylène pendant 15 min (2x), 100 % d’éthanol pour 5 min (2x), 95 % d’éthanol pour 5 min, 80 % d’éthanol pour 5 min, H2O pour 3 min et PBS pendant 3 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Des cellules d’exsudat péritonéal ont été rassemblées du fluide de lavage des souris. Les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu complet RPMI-1640, superposées sur une double étape (54,8 %/70,2 %) gradient de densité discontinu (Figure 1A), et centrifugé à 1 500 x g pendant 30 min. Les neutrophiles (95 %, 1 x 107 neutrophiles/souris) ont été récupérés à partir de l’interface inférieure (figure 1B).
Des expériences de poche d’air ont été réalisées pour étudier le recrutement de neutrophiles stimulé par Le SLS in vivo (figure 2A). Les sous-ensembles de leucocytes dans les exsudats de poche d’air ont été mesurés (Figure 2B).
La migration de Neutrophil dans la RA a été évaluée par l’intermédiaire du modèle murine d’arthrite CFA-induit. Comparé au groupe témoin, le groupe aa a montré l’oœma significatif dans la patte. Dans le groupe AA, le diamètre de l’articulation de la cheville a augmenté (figure 3B) et le score d’arthrite a augmenté de façon constante (figure 3D).
Les dommages de cartilage est le syndrome représentatif de RA, safranin O-rapide coloration verte de cartilage a été exécutée pour évaluer les dommages de cartilage dans la souris aA. Comme le montre la figure 4A, le défi de CFA a induit une grande quantité d’infiltration de leucocyte, l’érosion significative de cartilage et l’hyperplasie synoviale. Les niveaux d’expression DE MPO et de NE sont des marqueurs représentatifs de l’infiltration de neutrophiles. Des essais immunohistochimiques ont été exécutés pour observer l’infiltration de neutrophile dans des joints. L’expression du MPO et de l’EN a été considérablement régulée dans la section conjointe (figure 4B).
Figure 1 : Isolement des neutrophiles. (A) Les cellules exsudatrices péritonéales resuspendues dans 1 ml de milieu complet RPMI-1640 ont été superposées sur une double étape (54,8 %/70,2 %) gradient de densité discontinue. (B) Après centrifugation à 1 500 x g pendant 30 min, les neutrophiles (95 %, 1 x 107 neutrophiles/souris) ont été récupérés à partir de l’interface inférieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résultats représentatifs de l’analyse de la poche d’air. (A) Illustration de l’air poche d’assay. (B) Résultats représentatifs de l’infiltration du sous-ensemble de leucocytes dans l’analyse de la poche d’air. PBS: contrôle; LPS: 1 G/mL LPS. Les données sont présentées comme la moyenne - SD. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Résultats représentatifs du modèle de souris de l’arthrite adjuvant (AA). (A) Le diamètre de l’articulation de la cheville a été mesuré à l’aide d’une jauge d’épaisseur de poche. (B) L’enflure articulaire a été évaluée en fonction du diamètre de l’articulation de la cheville (n - 7). (C) Photos de chaque score d’arthrite. (D) La gravité de l’arthrite a été évaluée sur une échelle de 0 à 4 points (n - 7). Les données sont présentées comme la moyenne - SD. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résultats représentatifs de la coloration du cartilage vert o-rapide de safranine et de l’analyse immunohistochimique des sections articulaires des souris témoins et AA. (A) Résultats représentatifs de la coloration de cartilage vert o-rapide de safranin o-rapide des sections communes. (B) Résultats représentatifs du niveau d’expression de MPO et NE dans les articulations de la cheville. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Des protocoles détaillés de neutrophiles hautement purifiés provenant du sang périphérique7, de la moelle osseuse et des tissus18 sont disponibles depuis longtemps. Ici nous adoptons une méthode d’isoler des neutrophiles du fluide péritonéal19 dans lequel les neutrophiles mûrs restent inactivés pour d’autres études anti-inflammatoires et antioxydantes.
Nous avons utilisé l’expérience de poche d’air pour explorer l’infiltration LPS-induite des neutrophiles in vivo. Cette méthode a été proposée comme méthode potentielle pour mesurer directement l’infiltration cellulaire dans l’environnement inflammatoire général in vivo.
Il est à noter que l’assay de poche d’air démontre seulement la fonction du neutrophile d’une manière organe-non spécifique et enlève plusieurs étapes de la cascade de recrutement de leucocyte. Puisque le recrutement de neutrophiles à des organes spécifiques peut compter sur différentes propriétés d’organe, molécules d’adhérence, et chemokines, explorer l’état fonctionnel de neutrophile dans des conditions d’organe-spécifiques est d’une grande importance pour étudier le rôle que les neutrophiles jouent potentiellement dans certaines maladies3. Il a été suggéré que des modèles de point de terminaison sont nécessaires pour étudier l’infiltration de neutrophiles. Par conséquent, l’exécution de taches immunohistochimiques sur les sections articulaires des souris dans le modèle AA peut fournir une perspective perspicace sur les neutrophiles dans l’espace articulaire. Selon nos données, un grand nombre de neutrophiles sont recrutés dans le tissu articulaire et servent de preuves fondamentales pour d’autres recherches sur l’interruption de l’infiltration des neutrophiles pour traiter la polyarthrite rhumatoïde. En outre, des tests complets, par exemple, la safranine O-rapide coloration verte, sont nécessaires pour évaluer le modèle de la maladie pour une étude plus approfondie.
Les neutrophiles sont le principal sous-ensemble de l’infiltration des cellules inflammatoires et de travailler comme la première ligne de défense contre les agents pathogènes envahissants ou les lésions tissulaires20,21. Si les neutrophiles s’infiltrent dans les tissus en grand nombre, des niveaux élevés de cytokines et de NeTsont sont sécrétés, ce qui, ensemble, peut submerger les mécanismes de protection dans les tissus et entraîner des lésions tissulaires. Les lésions tissulaires stimulent encore l’infiltration de neutrophiles, formant ainsi un cercle vicieux22. Interférer avec la migration cellulaire au moyen du piégeage des cellules activées dans les organes lymphoïdes a été proposé comme une approche thérapeutique importante et a été appliqué dans des essais cliniques avec divers effets secondaires23. Découvrir un nouveau traitement pour réguler simultanément la migration des neutrophiles et l’activité inflammatoire est une stratégie prometteuse pour le traitement des maladies inflammatoires à l’avenir. En outre, si les agents de régulation de la motilité sont combinés, l’administration de médicaments médiés par neutrophiles24 peut augmenter la spécificité des médicaments, diminuant ainsi les effets secondaires.
Toutefois, d’autres modifications peuvent être combinées pour élargir l’application des essais mentionnés ci-dessus. Par exemple, dans le modèle de souris AA, pour obtenir l’impression globale d’infiltration des cellules inflammatoires dans l’articulation, les chercheurs sont encouragés à digérer enzymatiquement les articulations pour libérer les populations résidentes de leucocytes et appliquer ensuite la cytométrie de flux pour compter les populations.
Les protocoles ci-là comprennent trois façons d’évaluer la migration et l’infiltration des neutrophiles. L’application de ces protocoles est utile pour découvrir des traitements potentiels pour la polyarthrite rhumatoïde et d’autres maladies inflammatoires impliquant des neutrophiles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention 81430099 et 31500704), international Cooperation and Exchange Projects (numéro de subvention 2014DFA32950), et le programme de recherche de l’Université de médecine chinoise de Beijing ( numéros de subvention BUCM-2019-JCRC006 et 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
