Summary
Hier stellen wir drei Methoden zur Beurteilung der Neutrophilenmigration und -infiltration sowohl in vivo als auch in vitro vor. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapeutika zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.
Abstract
Neutrophile sind ein wichtiges Mitglied des angeborenen Immunsystems und spielen eine zentrale Rolle bei der Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger und pathologische Entzündungsreaktionen. Neutrophile können über die Anleitung von Zytokinen und Chemokinen an Entzündungsstellen rekrutiert werden. Überwältigende Infiltration von Neutrophilen kann zu wahllosen Gewebeschäden führen, wie bei rheumatoider Arthritis (RA). Neutrophile, die aus peritonealem Exutat isoliert sind, reagieren auf ein definiertes Chemolockan, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell- oder Zigmond-Kammertests. Das Luftbeutelexperiment kann verwendet werden, um die Chemotaxis von Neutrophilen in vivo zu Lipopolysaccharid (LPS) zu bewerten. Das adjuvantinduzierte Arthritis-Mausmodell (AA) wird häufig in der RA-Forschung verwendet, und die immunhistochemische Färbung von Gelenkabschnitten mit Antimyeloperoxidase (MPO) oder Anti-Neutrophilen-Elastase-Antikörpern (NE) ist eine etablierte Methode zur Messung Neutrophileninfiltration. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapien zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.
Introduction
Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden weißen Blutkörperchen und machen 50 bis 70% der gesamten weißen Blutkörperchen population beim Menschen1. Neutrophile sind einer der primären Responder bei akuter Entzündung. Neutrophile können an Entzündungsstellen über die Führung von Zytokinen und Chemokinen rekrutiert werden, die von geweberesidenten Zellen2,3,4freigesetzt werden, die durch die Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Neutrophilen und vaskulären Endothelzellen vermittelt wird5. Neutrophile sind von grundlegender Bedeutung für die Wirtsabwehr und spielen eine Rolle bei pathologischen Entzündungsreaktionen aufgrund ihrer starken Fähigkeit, Gewebe durch die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und anderen gewebeschädigenden Molekülen3,6zu schädigen.
Frühere Studien haben mehrere neutrophile Isolationsprotokolle von Mäusen oder Menschen beschrieben. Oh et al. demonstrierte eine Methode zur Trennung des Dichtegradienten, um menschliche Neutrophile aus ganzem menschlichen Blut zu isolieren7. Allerdings ist die Isolierung ausreichender Neutrophilen aus Mausblut aufgrund des geringen Blutvolumens schwierig. Alternativ kann eine große Anzahl von reinen und lebensfähigen Mausneutrophilen aus Mausperitonealflüssigkeit entlockt werden, und diese gereinigten Neutrophilen können ex vivo verwendet werden, um mehrere Aspekte der zellulären Funktionen ex vivo zu untersuchen, einschließlich neutrophiler Infiltration, Migration, Chemotaxis, oxidativen Bursts, Zytokin und neutrophiler extrazellulärer Falle (NET)Produktion 8. Transwell-Assays9 oder Zigmond-Kammer-Assays10,11 können verwendet werden, um neutrophile Migration in vitro zu bewerten. Das Luftbeutelmodell wird verwendet, um die Migration und Infiltration von Neutrophilen in vivo zu bewerten. Das subkutane Luftbeutelmodell ist ein praktisches in vivo Tiermodell, um die Migration von Entzündungszellen zu untersuchen.
Traditionell wurden Neutrophile als Pathogeneliminatoren in akuten Entzündungsphasen betrachtet. Jüngste Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass Neutrophile komplizierte Zellen sind, die eine signifikante Vielfalt an spezialisierten Funktionen ausführen. Neutrophile können viele Prozesse regulieren, wie akute Verletzungen und Reparaturen, Tumorgenese, Autoimmunreaktion und chronische Entzündung12,13. Neutrophile modulieren auch adaptive Immunantworten und können B-Zellen und T-Zellen14,15regulieren. Erheblicher Mangel an Neutrophilen führt zu Sterblichkeit oder schwerer Immunschwäche beim Menschen und neutrophiler Erschöpfung bei Mäusen führt zum Tod, während übermäßige Aktivierung oder Rekrutierung von Neutrophilen in Organen mehrere Immunerkrankungen verursacht, wie rheumatoide Arthritis (RA) und systemische Lupus erythematodes (SLE)6. Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Zellen in der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten. Neutrophile produzieren übermäßige Mengen an Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) durch Abbau, was die Knorpelerosion verschärft. MPO ist ein Peroxidase-Enzym, das hauptsächlich in den Granulaten von Neutrophilen16exprimiert wird. NE ist mit Gelenkknorpelzerstörungassoziiert 17. MPO und NE könnten verwendet werden, um den Status der Neutrophilenmigration und Infiltration im Gewebe von RA-Patienten zu bewerten.
Dieser Artikel enthält drei konventionelle Methoden zur Bewertung der Migration normaler Neutrophilen, die sowohl in vivo als auch in vitro induziert werden, sowie die Infiltration pathologischer Neutrophile in einem Mausgelenk-spezifischen Entzündungsmodell.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden vom Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt.
HINWEIS: Es wurden C57BL/6-Mäuse (7-8 Wochen alt) verwendet.
1. Neutrophile Isolation
- Erwerb von peritonealen Exutatzellen
- Bereiten Sie frische 10% Proteose Peptonlösung in ddH2O. Berechnen Sie das Volumen benötigt nach der Anzahl der Mäuse.
HINWEIS: Legen Sie die Anzahl der Mäuse auf N,(2N+1) ml der Lösung fest, die im Voraus gelöst und gefiltert werden muss. - Sprühen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Verwenden Sie einen Insulininjektor, um 1 ml Peptonlösung zu zeichnen und Blasen zu entladen.
- Führen Sie die erste intraperitoneale Injektion von 1 ml Peptonlösung pro Maus durch.
- Schnappen Sie sich die Maus in einer Head-Down-Position mit einer Hand. Desinfizieren Sie den Injektionspunkt mit alkoholgetränkten Baumwollkugeln.
HINWEIS: Die bevorzugte Injektionsposition liegt im seitlichen Aspekt des unteren linken oder rechten Quadranten des Bauches. - Die Reagenzien schnell einlösen. Mit dem Insulininjektor 1 ml in die Peritonealhöhle jeder Maus injizieren.
HINWEIS: Der Winkel zwischen der Nadel und der Haut sollte etwa 15 bis 30° betragen, um eine Verletzung des Darms oder anderer Organe zu vermeiden.
- Schnappen Sie sich die Maus in einer Head-Down-Position mit einer Hand. Desinfizieren Sie den Injektionspunkt mit alkoholgetränkten Baumwollkugeln.
- Lassen Sie entzündungshemmende Reaktionen über Nacht entwickeln. Führen Sie nach 12 h die zweite Injektion auf die gleiche Weise wie die erste Injektion durch.
- Drei Stunden nach der zweiten Injektion, vollständig anästhesieren Mäuse mit 5% Isofluran für 5 min in einer Gasanästhesiekammer mit einer Geschwindigkeit von 2 L/min. Entfernen Sie die anästhesierten Mäuse aus der Kammer und opfern Sie sie durch zervikale Dislokation.
HINWEIS: Eine ausreichende Tiefe der Anästhesie wird durch Kneifen der Zehen gewährleistet, bevor Mäuse aus der Kammer auf die einzelne Atemeinheit gebracht werden. Die Beine sollten sich nicht bewegen, wenn die Zehen eingeklemmt sind.
HINWEIS: Alle folgenden Schritte sollten in einer Gewebekulturhaube verarbeitet werden. - Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Legen Sie die Maus auf ein steriles Plastikpad und fixieren Sie die Gliedmaßen mit Nadeln.
- Verwenden Sie einen sterilen Satz von chirurgischen Werkzeugen, um einen horizontalen Schnitt (ca. 1 cm) in der Mitte des Unterbauchs zu machen. Heben Sie die Haut des Oberbauchs mit Zange und schneiden Sie entlang der Mittellinie des Bauches und setzen Sie die intakte Peritonealwand aus.
- Injizieren Sie 5 ml steriles RPMI-1640 komplettes Medium mit einer 30 G x 1/2" Nadel in die Bauchhöhle. Setzen Sie die Nadel durch die Peritonealwand mit der abgeschrägten Kante der Nadel nach oben und injizieren Sie das gesamte Volumen.
- Schütteln Sie das Pad horizontal für 5 min. Massieren Sie den Bauch sanft mehrmals.
- Injizieren Sie eine 23 G x 1 1/4" Nadel in den seitlichen Raum des Bauches. Extrahieren Sie die Bauchflüssigkeit (ca. 5 ml) und sammeln Sie sie in einem 50 ml Zentrifugenrohr.
HINWEIS: Legen Sie die Rohre so schnell wie möglich auf Eis, wenn Neutrophilen aktiviert werden. - Injizieren Sie weitere 5 ml vollständiges Medium und wiederholen Sie den Vorgang, um die verbleibenden Zellen aus dem Peritoneum zu entfernen. Die Peritonealflüssigkeit im 50 ml Zentrifugenrohr bündeln.
- Zentrifugieren Sie die gepoolte Peritonealflüssigkeit bei 400 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
- Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 1 ml RPMI-1640 komplettem Medium aus.
HINWEIS: Wirbel nicht, um die Neutrophilenaktivierung zu vermeiden.
- Bereiten Sie frische 10% Proteose Peptonlösung in ddH2O. Berechnen Sie das Volumen benötigt nach der Anzahl der Mäuse.
- Isolierung von Neutrophilen
- 4 ml frisch zubereitetes 70,2% Dichtegradientenmedium (z.B. Percoll) in ein 15 ml Zentrifugenrohr geben.
- Überlagern Sie vorsichtig 4 ml frisch zubereitetes 54,8% Dichtegradientenmedium auf dem 70,2%igen Dichtegradientenmedium langsam entlang der Randkante des Rohres mit scharfen Pipettenspitzen im 15 ml Zentrifugenrohr.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass die Schnittstelle zwischen dem Medium mit 54,8 % Dichtegradienten und einem Dichtegradientenmedium von 70,2 % gestört wird. - Überlagern Sie vorsichtig die 1 ml Peritonealzellaufhängung auf der 54,8%igen DichteGradienten-Mittelschicht langsam mit scharfen Pipettenspitzen (Abbildung 1A).
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass die Schnittstelle zwischen der Zellsuspension und dem Medium mit 54,8 % Dichtegradienten gestört wird. - Zentrifuge bei 1.500 x g für 30 min bei 22 °C ohne Bremsen.
- Sammeln Sie die Neutrophile an der Schnittstelle des 54,8%-Dichtegradientenmediums und der mittleren Schichten mit 70,2 % Dichtegradienten (Abbildung 1B) zu einem neuen Rohr.
- Fügen Sie 1 ml RPMI-1640 komplettes Medium zu den gesammelten Zellen hinzu und setzen Sie Zellen vorsichtig wieder auf, indem Sie mehrmals sanft pipetieren. Zentrifugieren Sie bei 100 x g für 10 min bei RT und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 1.2.6) einmal.
- Fügen Sie 0,5 ml Kulturmedium in das Pellet und resuspendieren Zellen durch sanfte Pipettierung mehrmals. Nehmen Sie ein 50-L-Aliquot, um die Zellen mit einem automatischen Hämatologie-Analysator zu zählen.
2. Neutrophile Rwanderung assay
- Messen Sie die Neutrophilenmigration durch Transwell-Assay9 oder Zigmond-Kammertest wie zuvor beschrieben10,11.
3. Luftbeutel-Assay
- Erste Lufteinspritzung
- An Tag 0 Mäuse mit 5% Isofluran für 3 min in einer Gasanästhesiekammer mit einer Geschwindigkeit von 2 L/min vollständig anästheisieren und die Anästhesie jeder Maus in einer einzigen Atemeinheit mit 2% Isofluran mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min aufrecht erhalten.
HINWEIS: Eine ausreichende Tiefe der Anästhesie wird durch Kneifen der Zehen gewährleistet, bevor Mäuse aus der Kammer auf die einzelne Atemeinheit gebracht werden. Die Beine sollten sich nicht bewegen, wenn die Zehen eingeklemmt sind. - Verwenden Sie einen 0,22 m-Filter, der an einer 5 ml Spritze befestigt ist, um ein 3 ml Volumen sterilisierter Luft zu erhalten.
- Heben Sie die Rückenhaut der anästhesierten Maus mit einer Pinzette an und injizieren Sie 3 ml sterilisierte Luft subkutan mit einer 26 G x 3/8" Nadel.
- Entfernen Sie die Mäuse nach der Behandlung von der Atemeinheit. Überwachen Sie die Mäuse, um sicherzustellen, dass sie am Leben sind, bis sie anfangen, sich zu bewegen.
- An Tag 0 Mäuse mit 5% Isofluran für 3 min in einer Gasanästhesiekammer mit einer Geschwindigkeit von 2 L/min vollständig anästheisieren und die Anästhesie jeder Maus in einer einzigen Atemeinheit mit 2% Isofluran mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min aufrecht erhalten.
- Zweite Lufteinspritzung
- Injizieren Sie am 3. Tag weitere 3 ml sterilisierte Luft in die zuvor eingerichtete Lufttasche, um den Luftbeutel gemäß Abschnitt 3.1 zu erhalten.
- Behandlung
- An Tag 6, 6 h vor dem Opfer, injizieren Verschiedene Behandlungen in den Luftbeutel. Injizieren Sie 1 ml Phosphat-gepufferte Saline (PBS) als Negativkontrolle. Injizieren Sie 1 ml von 1 g/ml LPS als positive Kontrolle, um lokale Entzündungen zu induzieren.
- Voll anästhesieren Mäuse mit 5% Isofluran für 3 min in einer Gasanästhesiekammer mit einer Geschwindigkeit von 2 L/min, und halten Sie die Anästhesie jeder Maus in einer einzigen Atemeinheit mit 2% Isofluran mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min. Bereiten Sie Waschpuffer nach Tabelle der Materialien.
HINWEIS: Eine ausreichende Tiefe der Anästhesie wird durch Kneifen der Zehen gewährleistet, bevor Mäuse aus der Kammer auf die einzelne Atemeinheit gebracht werden. Die Beine sollten sich nicht bewegen, wenn die Zehen eingeklemmt sind. - Für jeden Luftbeutel den Luftbeutel mit 1 ml Waschpuffer waschen und das entzündliche Exulat in einem 15 ml Zentrifugenrohr sammeln. Waschen Sie den Luftbeutel mit 2 ml Waschpuffer 2x und sammeln Sie das entzündliche Exudate im selben Zentrifugenrohr.
- Zentrifuge bei 100 x g für 10 min bei RT. Entsorgen Sie die Überstande und setzen Sie die Zellen in 1 ml Waschpuffer wieder auf. Zählen Sie die Zellen, um das Neutrophilenverhältnis mit dem automatischen Hämatologieanalysator zu quantifizieren.
HINWEIS: Siehe repräsentative Ergebnisse in Abbildung 2.
4. Induktion des adjuvantinduzierten Arthritis (AA) Mausmodells
- Unterbrechen Sie das gesamte Freund-Adjuvans (CFA), indem Sie mindestens 5 s wirbeln, und ziehen Sie dann 100 l Suspension in einen Insulininjektor.
HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung völlig neuer CFA in Experimenten, um Sterilität zu gewährleisten. - Anästhesisieren von Mäusen, wie in Schritt 3.1.1 beschrieben.
- Markieren Sie die gewählte Pfote und injizieren Sie 20 L CFA in den Sprunggelenksraum. Injizieren Sie 20 l Suspension in vier periartikuläre Flecken auf der gewählten Pfote (insgesamt 80 l).
- Entfernen Sie Mäuse aus der Atemeinheit und legen Sie die verarbeiteten Mäuse in eine neue Kammer. Überwachen Sie Mäuse, um sicherzustellen, dass sie atmen, bis sie wieder die Fähigkeit, sich zu bewegen.
- Bewerten Sie alle 3 Tage den Gelenkdurchmesser, indem Sie den Durchmesser des Sprunggelenks mit einem Taschendickenmessgerät messen (Abbildung 3A).
- Alle 3 Tage, bewerten Arthritis Schweregrad durch Arthritis Scoring-Kriterium (Abbildung 3C): 0, normal, keine Beweise für Erythem und Schwellung; 1, die mildeste Arthritis, Erythem und leichte Schwellung enden auf die Tarsals oder Knöchelgelenk; 2, moderate Arthritis, Erythem und leichte Schwellung, die sich vom Knöchel bis zu den Tarsals erstreckt; 3, schwere Arthritis, Erythem und moderate Schwellung, die sich vom Knöchel bis zu den metatarsalen Gelenken erstreckt; 4, die schwerste Arthritis, Erythem und schwere Schwellung enden den Knöchel, Fuß und Ziffern, oder Ankylose der Gliedmaße.
5. Immunhistochemische Färbung von Gelenkabschnitten
- Gemeinsame Isolierung
- Opfern Sie die Maus in Abschnitt 4 mit Zervixdislokation nach Anästhesie mit Isofluran. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol.
- Entfernen Sie die Haut und einen Teil des Muskels aus dem Hinterbein mit Pinzette und Schere. Sprühen Sie das Gelenk mit 70% Ethanol und entfernen Sie den Rest der Muskeln mit einem Papiertuch.
- Fixieren Sie das Sprunggelenk in 4% Paraformaldehyd für 2 Tage bei RT. Entkalken Sie das Gelenk in 10% EDTA für 1Monat bei RT und ändern Sie das Medium wöchentlich.
- Das Gewebe in Paraffin einbetten und 4-m-dicke Gewebeabschnitte vorbereiten.
- Legen Sie Gewebe in eine markierte Form mit einem bestimmten Volumen an flüssigem Paraffin. Kurz abkühlen.
- Stellen Sie die Dicke auf 4 m und schneiden Sie Scheiben auf ein Mikrotome. Schwimmerabschnitte in einem 43 °C Wasserbad.
- Montieren Sie die Abschnitte auf Rutschen und legen Sie die Rutschen bei 70 °C für 2 h in den Ofen. Für die zukünftige Verwendung die Dias bei -20 °C konservieren.
- Safranin O und schnelle grüne Färbung von Fugenabschnitten
HINWEIS: Die folgenden Färbeschritte werden bei RT durchgeführt.- Legen Sie die Dias aus Schritt 5.1.4.3 in ein Rack und führen Sie die folgenden Wäschen durch, um bei RT zu rehydrieren: Xylol für 5 min (3x), 100% Ethanol für 2 min (2x), 95% Ethanol für 2 min (2x), 70% Ethanol für 2 min und 50% Ethanol für 15 min. Waschen Sie in fließendem Leitungswasser für 3 min.
- Stain in 0.1% schnelle grüne Lösung für 5 min. Spülen Sie in 1% Essigsäure für 10 s.
- Stain in 0.1% Safranin O Färbung Lösung für 20 min. Tauchen Sie die Dias in die folgenden Wäbungen: 95% Ethanol für 2 min (2x), 100% Ethanol für 2 min (2x) und Xylol für 2 min (2x).
- Montieren Sie die Gewebeabschnitte und beobachten Sie das Gewebe unter dem Mikroskop.
HINWEIS: Siehe repräsentative Bilder in Abbildung 4A.
- Immunhistochemische Färbung zur Visualisierung von Neutrophilen
- Die Paraffinabschnitte 2 h bei 78 °C backen. Legen Sie die Dias in ein Rack und führen Sie die folgenden Wässen durch, um bei RT zu rehydrieren: Xylol für 15 min (2x), 100% Ethanol für 5 min (2x), 95% Ethanol für 5 min, 80% Ethanol für 5 min, H2O für 3 min und PBS für 3 min.
HINWEIS: Lassen Sie die Dias während dieses Schritts zu keinem Zeitpunkt trocknen. - Fügen Sie einen Tropfen Permeabilisierungspuffer hinzu, um das Gewebe zu bedecken. Inkubieren Sie Abschnitte in einem feuchtigkeitskontrollierten Fach bei 37 °C.
- Spülen Sie Dias in PBS für 3 min (3x). Vermeiden Sie das direkte Spülen des Gewebes.
- Führen Sie wärmeinduzierte Antigen-Epitop-Retrieval mit einem Druckkessel.
- Ordnen Sie Dias in einem Rack an. Eintauchen in den mit Abrufpuffer gefüllten Druckkessel.
- Setzen Sie den Druckkessel auf einen Mikrowellenherd. Stellen Sie den Mikrowellenherd auf 600 W und erhitzen Sie die Dias für 10 min.
- Nach dem Kochen die Dias im Kessel auf 90 °C abkühlen lassen. Nehmen Sie die Dias heraus und spülen Sie sie in PBS für 3 min (3x).
- Endogene Peroxidaseaktivität in frisch zubereiteten 3%H2O2 bei RT für 15 min. Spülgleitet in PBS für 3 min (3x).
- Umreißen Sie einen großen Kreis um die Probe mit einem hydrophoben Stift, vermeiden Sie es, die Probe zu berühren. Block mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) in einer feuchtigkeitsgesteuerten Kammer bei 37 °C für 60 min.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung. Fügen Sie jedem Abschnitt schnell 50 L PBS-verdünnten Primärantikörper hinzu. Dann inkubieren Sie die Dias in einem feuchtigkeitskontrollierten Tablett bei 4 °C über Nacht.
HINWEIS: Für verschiedene Antikörper werden unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse verwendet (1:25 für MPO und 1:20 für NE). - Nehmen Sie am zweiten Tag das Tablett heraus und lassen Sie es 30 min bei RT stehen. Dann spülen Sie die Dias in PBS für 3 min (3x).
- Fügen Sie dem Gewebe 50 l PBS-verdünnte sekundäre Antikörper hinzu.
HINWEIS: Es wurden unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse angewendet: 1:1.000 für MPO und 1:1.500 für NE. - Inkubieren Sie diagletten in einem feuchtigkeitsgesteuerten Tablett bei 37 °C für 30 min. Dann spülen Sie die Dias in PBS für 3 min (3x).
- Entwickeln Sie in verdünnter 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Lösung für 5 min. Behalten Sie die Reaktion im Falle der Entwicklung einer dunklen Farbe im Auge. Spülen Sie die Dias in destilliertem Wasser.
- Die Dias in Hämatoxylin für 10 s verfärben. Spülen Sie die Dias in Leitungswasser für 5 min.
- Spülen Sie in sauren Alkohol superschnelle Differenzierungslösung für 3 s. Dann in Leitungswasser für 10 min abspülen.
- Tauchen Sie die Dias in die folgenden Wässer bei RT ein: 80% Ethanol für 5 min, 95% Ethanol für 5 min, 100% Ethanol für 5 min und Xylol für 15 min (2x). Befestigen Sie den Coverslip mit Montagelösung. Beobachten Sie das Gewebe unter dem Mikroskop.
HINWEIS: Siehe repräsentative Bilder in Abbildung 4B.
- Die Paraffinabschnitte 2 h bei 78 °C backen. Legen Sie die Dias in ein Rack und führen Sie die folgenden Wässen durch, um bei RT zu rehydrieren: Xylol für 15 min (2x), 100% Ethanol für 5 min (2x), 95% Ethanol für 5 min, 80% Ethanol für 5 min, H2O für 3 min und PBS für 3 min.
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Representative Results
Peritoneale Exutatzellen wurden aus der Spülflüssigkeit von Mäusen gesammelt. Die Zellen wurden in 1 ml RPMI-1640-Gesamtmedium resuspendiert, auf einem zweistufigen (54,8%/70,2%) diskontinuierlicher Dichtegradient (Abbildung 1A) und zentrifugiert bei 1.500 x g für 30 min. Neutrophile (ca. 95 %, 1 x 107 Neutrophile/Maus) wurden von der unteren Schnittstelle(Abbildung 1B) wiederhergestellt.
Luftbeutelexperimente wurden durchgeführt, um die durch LPS in vivo stimulierte Neutrophilenrekrutierung zu untersuchen (Abbildung 2A). Die Leukozyten-Teilmengen in den Luftbeutelexsudaten wurden gemessen (Abbildung 2B).
Die Neutrophilenmigration in RA wurde über das CFA-induzierte Arthritis-Murine-Modell evaluiert. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die AA-Gruppe signifikante Ödeme in der Pfote. In der AA-Gruppe stieg der Sprunggelenkdurchmesser (Abbildung 3B) und der Arthritis-Score stieg kontinuierlich an (Abbildung 3D).
Knorpelschäden sind das repräsentative Syndrom von RA, Safranin O-schnelle grüne Knorpelfärbung wurde durchgeführt, um die Knorpelschäden in AA-Maus zu bewerten. Wie in Abbildung 4Agezeigt, induzierte die CFA-Herausforderung eine große Menge an Leukozyteninfiltration, signifikante Knorpelerosion und Synovialhyperplasie. MPO- und NE-Expressionsstufen sind repräsentative Marker für die Neutrophileninfiltration. Immunhistochemische Tests wurden durchgeführt, um die neutrophile Infiltration in den Gelenken zu beobachten. Die MPO- und NE-Expression wurde im gemeinsamen Abschnitt(Abbildung 4B) deutlich hochreguliert.
Abbildung 1: Neutrophile Isolation. (A) Peritoneale Exutatzellen, die in 1 ml RPMI-1640-Gesamtmedium resuspendiert wurden, wurden auf einen zweistufigen (54,8%/70,2%) diskontinuierlichen Dichtegradienten. (B) Nach der Zentrifugation bei 1.500 x g für 30 min wurden Neutrophile (ca. 95 %, 1 x 107 Neutrophile/Maus) von der unteren Schnittstelle wiederhergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse des Luftbeutel-Assays. (A) Abbildung des Luftbeutel-Assays. (B) Repräsentative Ergebnisse der Infiltration von Leukozyten-Teilmengen im Luftbeuteltest. PBS: Steuerung; LPS: 1 g/ml LPS. Die Daten werden als der Mittelwert sD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse des adjuvantinduzierten Arthritis-Mausmodells (AA). (A) Der Knöchelgelenkdurchmesser wurde mit einem Taschendickenmessgerät gemessen. (B) Die Gelenkschwellung wurde anhand des Sprunggelenkdurchmessers (n = 7) bewertet. (C) Bilder von jeder Arthritis Punktzahl. (D) Der Schweregrad der Arthritis wurde auf einer Skala von 0 x 4 Punkten (n = 7) eingestuft. Die Daten werden als der Mittelwert sD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von Safranin O-schnelle grüne Knorpelfärbung und immunhistochemische Assay von Gelenkabschnitten von Kontroll- und AA-Mäusen. (A) Repräsentative Ergebnisse der safranin O-schnellen grünen Knorpelfärbung von Gelenkabschnitten. (B) Repräsentative Ergebnisse der Expressionsstufe von MPO und NE in den Sprunggelenken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Detaillierte Protokolle von hochgereinigten Neutrophilen aus peripherem Blut7,Knochenmark und Gewebe18 sind seit langem verfügbar. Hier nehmen wir eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Peritonealflüssigkeit19 an, bei der reife Neutrophile für weitere entzündungshemmende und antioxidative Studien inaktiviert bleiben.
Wir nutzten das Luftbeutelexperiment, um die LPS-induzierte Infiltration von Neutrophilen in vivo zu erforschen. Diese Methode wurde als mögliche Methode zur direkten Messung der Zellinfiltration in der allgemeinen entzündlichen Umgebung in vivo vorgeschlagen.
Bemerkenswert ist, dass der Luftbeutel-Assay die Funktion des Neutrophilen nur organunspezifisch demonstriert und mehrere Schritte der Leukozytenrekrutierungskaskade entfernt. Da neutrophile Rekrutierung an bestimmte Organe auf verschiedene Organeigenschaften verlassen können, Adhäsionsmoleküle, und Chemokine, die Erforschung der neutrophilen Funktionszustand unter organspezifischen Bedingungen ist von großer Bedeutung für die Untersuchung der Rolle, die Neutrophile potenziell bei bestimmten Krankheiten spielen3. Es wurde vorgeschlagen, dass Endpunktmodelle erforderlich sind, um neutrophile Infiltration zu untersuchen. Daher kann die Durchführung immunohistochemischer Färbung an den Gelenkabschnitten von Mäusen im AA-Modell eine aufschlussreiche Perspektive auf die Neutrophilen im Gelenkraum bieten. Nach unseren Daten werden eine große Anzahl von Neutrophilen in das Gelenkgewebe rekrutiert und dienen als grundlegende Beweise für weitere Forschung entochern die Infiltration von Neutrophilen zur Behandlung von RA. Darüber hinaus sind umfassende Assays, z.B. Safranin O-schnelle grüne Färbung, erforderlich, um das Krankheitsmodell für weitere Studien zu bewerten.
Neutrophile sind die Hauptuntergruppe der infiltrierenden entzündlichen Zellen und arbeiten als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger oder Gewebeverletzungen20,21. Wenn Neutrophile Gewebe in großer Zahl infiltrieren, werden hohe Konzentrationen von Zytokinen und NETs abgesondert, die zusammen die Schutzmechanismen in Geweben überwältigen und zu Gewebeschäden führen können. Gewebeverletzungen stimulieren die Neutrophileninfiltration weiter und bilden so einen Teufelskreis22. Die Störung der Zellmigration durch das Einfangen aktivierter Zellen in Lymphorganen wurde als wichtiger therapeutischer Ansatz vorgeschlagen und in klinischen Studien mit verschiedenen Nebenwirkungen angewendet23. Die Entdeckung einer neuartigen Behandlung zur gleichzeitigen Regulierung der Neutrophilenmigration und der entzündlichen Aktivität ist eine vielversprechende Strategie zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen in der Zukunft. Darüber hinaus, wenn Motilität-regulierende Mittel kombiniert werden, neutrophil-vermittelte Medikamentenabgabe24 kann die Arzneimittelspezifität erhöhen, wodurch Nebenwirkungen abnehmen.
Es können jedoch weitere Änderungen kombiniert werden, um die Anwendung der oben genannten Assays zu erweitern. Im AA-Mausmodell werden die Forscher beispielsweise ermutigt, die Gelenke enzymatisch zu verdauen, um den Gesamteindruck der Infiltration von Entzündungszellen im Gelenk zu erhalten, und dann die Durchflusszytometrie anzuwenden, um die Bevölkerungen.
Die hierin enthalten drei Möglichkeiten, neutrophile Migration und Infiltration zu bewerten. Die Anwendung dieser Protokolle ist nützlich für die Entdeckung potenzieller Behandlungen für RA und andere entzündliche Erkrankungen mit Neutrophilen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 81430099 und 31500704), Internationalen Kooperations- und Austauschprojekten (Grant-Nummer 2014DFA32950) und dem Forschungsprogramm der Pekinger Universität für Chinesische Medizin ( BUCM-2019-JCRC006 und 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
