Summary
Aquí, presentamos tres métodos para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos tanto in vivo como in vitro. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.
Abstract
Los neutrófilos son un miembro importante del sistema inmunitario innato y desempeñan un papel fundamental en la defensa del huésped contra patógenos y reacciones inflamatorias patológicas. Los neutrófilos pueden ser reclutados a sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas. La infiltración abrumadora de neutrófilos puede provocar daño indiscriminado a los tejidos, como en la artritis reumatoide (AR). Neutrófilos aislados del exudado peritoneal responden a un quimioatraer definido, N-formilo-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro en los ensayos de cámara Transwell o Zigmond. El experimento de la bolsa de aire se puede utilizar para evaluar la quimiotaxis de los neutrófilos hacia el lipopolisacárido (LPS) in vivo. El modelo de ratón de artritis inducida por adyuvantes (AA) se utiliza con frecuencia en la investigación de RA, y la tinción inmunohistoquímica de secciones articulares con anticuerpos antimieloperoxidasa (MPO) o antineutrófilos elastasa (NE) es un método bien establecido para medir infiltración de neutrófilos. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.
Introduction
Los neutrófilos son los glóbulos blancos más abundantes y representan entre el 50 y el 70% de toda la población de glóbulos blancos en humanos1. Los neutrófilos son uno de los principales respondedores durante la inflamación aguda. Los neutrófilos pueden ser reclutados en sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas liberadas por células residentes entejidos 2,3,4, que está mediada por las interacciones entre las moléculas de adhesión celular en la superficie de los neutrófilos y las células de endotelio vascular5. Los neutrófilos son fundamentales para albergar defensa y desempeñar un papel en las reacciones inflamatorias patológicas debido a su poderosa capacidad para dañar el tejido a través de la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otras moléculas dañinas para el tejido3,6.
Estudios anteriores han descrito varios protocolos de aislamiento de neutrófilos de ratones o humanos. Oh y otros demostraron un método de separación de gradiente de densidad para aislar a los neutrófilos humanos de toda la sangre humana7. Sin embargo, el aislamiento de suficientes neutrófilos de la sangre del ratón es difícil debido al pequeño volumen sanguíneo. Alternativamente, un gran número de neutrófilos de ratón puros y viables pueden ser obtenidos del fluido peritoneal del ratón, y estos neutrófilos purificados se pueden utilizar ex vivo para examinar varios aspectos de las funciones celulares ex vivo, incluyendo la infiltración de neutrófilos, migración, quimiotaxis, ráfaga oxidativa, citoquina y trampa extracelular de neutrófilos (NET) producción8. Ensayos Transwell9 o ensayos de cámara Zigmond10,11 se pueden utilizar para evaluar la migración de neutrófilos in vitro. El modelo de bolsa de aire se utiliza para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos in vivo. El modelo de bolsa de aire subcutánea es un modelo animal in vivo conveniente para estudiar la migración de células inflamatorias.
Tradicionalmente, los neutrófilos eran considerados como eliminadores de patógenos en fases agudas de la inflamación. Sin embargo, los hallazgos recientes han demostrado que los neutrófilos son células complicadas que realizan una variedad significativa de funciones especializadas. Los neutrófilos pueden regular muchos procesos tales como lesión aguda y reparación, tumorigenesis, respuesta autoinmune, e inflamación crónica12,13. Los neutrófilos también modulan las respuestas inmunitarias adaptativas y pueden regular las células B y las células T14,15. La escasez sustancial de neutrófilos provoca mortalidad o inmunodeficiencia grave en humanos y el agotamiento de los neutrófilos en ratones conduce a la mortalidad, mientras que la activación o el reclutamiento excesivos de neutrófilos en los órganos provoca nifa tras las enfermedades inmunitarias, como la artritis reumatoide (AR) y el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Los neutrófilos son las células más abundantes en el líquido sinovial de los pacientes con AR. Los neutrófilos producen cantidades excesivas de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) a través de la degradación, que exacerba la erosión del cartílago. LA MPO es una enzima peroxidasa expresada principalmente en los gránulos de los neutrófilos16. NE se asocia con la destrucción del cartílago articular17. MPO y NE podrían utilizarse para evaluar el estado de la migración de neutrófilos y la infiltración en el tejido de los pacientes con AR.
Este artículo proporciona tres métodos convencionales para evaluar la migración de neutrófilos normales inducidos in vivo e in vitro, así como la infiltración de neutrófilos patológicos en un modelo de inflamación específica de la articulación del ratón.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina China de Beijing.
NOTA: Se utilizaron ratones C57BL/6 (7-8 semanas de edad).
1. Aislamiento de neutrófilos
- Adquisición de células de exudado peritoneal
- Preparar una solución fresca de peptona proteosa al 10% en ddH2O. Calcular el volumen necesario según el número de ratones.
NOTA: Establezca el número de ratones como N, (2N+1) ml de solución debe disolverse y filtrarse de antemano. - Rocíe el espacio de trabajo con 70% de etanol. Utilice un inyector de insulina para extraer 1 ml de solución de peptona y descargar burbujas.
- Realizar la primera inyección intraperitoneal de 1 ml de solución de peptona por ratón.
- Agarre el ratón en una posición de cabeza hacia abajo con una mano. Desinfecte el punto de inyección con bolas de algodón empapadas en alcohol.
NOTA: La posición de inyección preferida se encuentra en el aspecto lateral del cuadrante inferior izquierdo o derecho del abdomen. - Infundir los reactivos rápidamente. Inyectar 1 ml en la cavidad peritoneal de cada ratón con el inyector de insulina.
NOTA: El ángulo entre la aguja y la piel debe ser de aproximadamente 15 a 30o para evitar dañar el intestino u otros órganos.
- Agarre el ratón en una posición de cabeza hacia abajo con una mano. Desinfecte el punto de inyección con bolas de algodón empapadas en alcohol.
- Permita que la respuesta inflamatoria se desarrolle durante la noche. Después de las 12 h, realice la segunda inyección de la misma manera que la primera inyección.
- Tres horas después de la segunda inyección, anestesia completamente los ratones con 5% de isoflurano durante 5 minutos en una cámara de anestesia de gas a una velocidad de 2 L/min. Retire los ratones anestesiados de la cámara y sacrifique por luxación cervical.
NOTA: Se garantiza una profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos antes de mover los ratones de la cámara a la unidad de respiración única. Las piernas no deben moverse cuando se pellizcan los dedos de los dedos.
NOTA: Todos los pasos siguientes deben procesarse en una campana de cultivo de tejido. - Rocíe el ratón con 70% de etanol. Colocar el ratón sobre una almohadilla de plástico estéril y fijar las extremidades con agujas.
- Utilice un conjunto estéril de herramientas quirúrgicas para hacer una incisión horizontal (1 cm) en el centro de la parte inferior del abdomen. Levante la piel de la parte superior del abdomen con fórceps y corte a lo largo de la línea media del abdomen y exponga la pared peritoneal intacta.
- Inyectar 5 ml de RPMI-1640 estéril medio completo en la cavidad abdominal con una aguja de 30 G x 1/2". Inserte la aguja a través de la pared peritoneal con el borde biselado de la aguja hacia arriba e inyecte todo el volumen.
- Agitar la almohadilla horizontalmente durante 5 min. Masajee el abdomen suavemente varias veces.
- Inyecte una aguja de 23 G x 1 1 1/4" en el espacio lateral del abdomen. Extraiga el líquido abdominal (5 ml) y recórtelo en un tubo centrífugo de 50 ml.
NOTA: Coloque los tubos sobre hielo lo antes posible en caso de activación de neutrófilos. - Inyectar otros 5 ml de medio completo y repetir el procedimiento para eliminar las células restantes del peritoneo. Aunar el líquido peritoneal en el tubo centrífugo de 50 ml.
- Centrifugar el líquido peritoneal agrupado a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Descarta el sobrenadante. Resuspenda las células en 1 ml de medio completo RPMI-1640.
NOTA: No vórtice para evitar la activación de neutrófilos.
- Preparar una solución fresca de peptona proteosa al 10% en ddH2O. Calcular el volumen necesario según el número de ratones.
- Aislamiento de neutrófilos
- Añadir 4 ml de medio de gradiente de densidad del 70,2% recién preparado (por ejemplo, Percoll) en un tubo centrífugo de 15 ml.
- Superponga cuidadosamente 4 ml de medio de gradiente de densidad del 54,8% recién preparado en el medio de gradiente de densidad del 70,2% lentamente a lo largo del borde del tubo con puntas de pipeta afiladas en el tubo centrífugo de 15 ml.
NOTA: Tenga cuidado para evitar perturbar la interfaz entre el medio de gradiente de densidad del 54,8% y el medio de gradiente de densidad del 70,2%. - Superponga con cuidado la suspensión de celda peritoneal de 1 ml en la parte superior de la capa media de gradiente de densidad del 54,8% lentamente con puntas de pipeta afiladas(Figura 1A).
NOTA: Tenga cuidado para evitar perturbar la interfaz entre la suspensión celular y el medio de gradiente de densidad del 54,8%. - Centrífuga a 1.500 x g durante 30 min a 22oC sin frenada.
- Recoger los neutrófilos en la interfaz del medio de gradiente de densidad del 54,8% y las capas medias de gradiente de densidad del 70,2%(Figura 1B)a un nuevo tubo.
- Agregue 1 ml de RPMI-1640 medio completo a las células recogidas y resuspenda cuidadosamente las células pipeteando suavemente varias veces. Centrifugar a 100 x g durante 10 minutos en RT y retirar cuidadosamente el sobrenadante.
- Repita el paso de lavado (paso 1.2.6) una vez.
- Añadir 0,5 ml de medio de cultivo al pellet y resuspender las células pipeteando suavemente varias veces. Tome una alícuota de 50 l para contar las células usando un analizador de hematología automática.
2. Ensayo de migración de neutrófilos
- Mida la migración de neutrófilos mediante el ensayoTranswell 9 o el ensayo de cámara Zigmond como se describió anteriormente10,11.
3. Ensayo de bolsa de aire
- Primera inyección de aire
- En el día 0, anestesia completamente los ratones con 5% de isoflurano durante 3 minutos en una cámara de anestesia de gas a una velocidad de 2 L/min, y mantener la anestesia de cada ratón en una sola unidad de respiración con 2% de isoflurano a una velocidad de 0,5 L/min.
NOTA: Se garantiza una profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos antes de mover los ratones de la cámara a la unidad de respiración única. Las piernas no deben moverse cuando se pellizcan los dedos de los dedos. - Utilice un filtro de 0,22 m unido a una jeringa de 5 ml para obtener un volumen de 3 ml de aire esterilizado.
- Levante la piel posterior del ratón anestesiado con pinzas e inyecte por vía subcutánea 3 ml de aire esterilizado con una aguja de 26 G x 3/8".
- Después del tratamiento, retire los ratones de la unidad de respiración. Supervise a los ratones para asegurarse de que están vivos hasta que empiecen a moverse.
- En el día 0, anestesia completamente los ratones con 5% de isoflurano durante 3 minutos en una cámara de anestesia de gas a una velocidad de 2 L/min, y mantener la anestesia de cada ratón en una sola unidad de respiración con 2% de isoflurano a una velocidad de 0,5 L/min.
- Segunda inyección de aire
- El día 3, inyecte 3 ml adicionales de aire esterilizado en el bolsillo de aire previamente establecido para sostener la bolsa de aire como se describe en la sección 3.1.
- Tratamiento
- El día 6, 6 h antes del sacrificio, inyectar diferentes tratamientos en la bolsa de aire. Inyectar 1 ml de solución salina con fosfato (PBS) como control negativo. Inyectar 1 ml de 1 g/ml LPS como control positivo para inducir inflamación local.
- Ratones completamente anestesiados con 5% de isoflurano durante 3 min en una cámara de anestesia de gas a una velocidad de 2 L/min, y mantener la anestesia de cada ratón en una sola unidad de respiración con 2% de isoflurano a una velocidad de 0,5 L/min. Preparar tampón de lavado según la Tabla de Materiales.
NOTA: Se garantiza una profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos antes de mover los ratones de la cámara a la unidad de respiración única. Las piernas no deben moverse cuando se pellizcan los dedos de los dedos. - Para cada bolsa de aire, lave la bolsa de aire con 1 ml de tampón de lavado y recoja el exudado inflamatorio en un tubo centrífugo de 15 ml. Lave la bolsa de aire con 2 ml de tampón de lavado 2x y recoja el exudado inflamatorio en el mismo tubo centrífugo.
- Centrífuga a 100 x g durante 10 minutos en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lavado. Cuente las células para cuantificar la proporción de neutrófilos utilizando el analizador de hematología automática.
NOTA: Consulte los resultados representativos en la Figura 2.
4. Inducción del modelo de ratón de artritis inducida por adyuvantes (AA)
- Suspenda el adyuvante completo de Freund (CFA) vortexing al menos 5 s, luego extraiga 100 s de suspensión en un inyector de insulina.
NOTA: Recomendamos el uso de CFA completamente nuevo en experimentos para garantizar la esterilidad. - Anestetizar ratones como se describe en el paso 3.1.1.
- Marque la pata elegida e inyecte 20 ml de CFA en el espacio de la articulación del tobillo. Inyectar 20 s de suspensión en cuatro puntos periarticulares en la pata elegida (80 l en total).
- Retire los ratones de la unidad de respiración y coloque los ratones procesados en una nueva cámara. Supervise a los ratones para asegurarse de que respiran hasta que recuperen la capacidad de moverse.
- Cada 3 días, evalúe el diámetro de la articulación midiendo el diámetro de la articulación del tobillo utilizando un medidor de espesor de bolsillo(Figura 3A).
- Cada 3 días, evaluar la gravedad de la artritis por criterio de puntuación de la artritis(Figura 3C):0, normal, sin evidencia de eritema e hinchazón; 1, la artritis más leve, eritema e hinchazón leve confinado a los tarsals o la articulación del tobillo; 2, artritis moderada, eritema e hinchazón leve que se extiende desde el tobillo hasta los tarsallos; 3, artritis grave, eritema e hinchazón moderada que se extiende desde el tobillo hasta las articulaciones metatarsales; 4, la artritis más grave, eritema e hinchazón grave abarcan el tobillo, el pie y los dígitos, o anquilosis de la extremidad.
5. Tinción inmunohistoquímica de secciones articulares
- Aislamiento conjunto
- Sacrificar el ratón en la sección 4 usando dislocación cervical después de la anestesia con isoflurano. Rocíe el ratón con 70% de etanol.
- Retire la piel y parte del músculo de la pata trasera con pinzas y tijeras. Rocíe la articulación con 70% de etanol y retire el resto de los músculos con una toalla de papel.
- Fijar la articulación del tobillo en 4% paraformaldehído durante 2 días en RT. Descalcificar la articulación en 10% EDTA durante 1 mes en RT y cambiar el medio semanalmente.
- Incruste el tejido en parafina y prepare secciones de tejido de 4 m de espesor.
- Coloque el tejido en un molde marcado con cierto volumen de parafina líquida. Enfriar brevemente.
- Ajuste el espesor a 4 m y corte las rodajas en un microtome. Flotar secciones en un baño de agua a 43 oC.
- Montar las secciones en portaobjetos y poner los portaobjetos en el horno a 70 oC durante 2 h. Para su uso futuro, conserve las diapositivas a -20 oC.
- Safranina O y tinción verde rápida de secciones articulares
NOTA: Los siguientes pasos de tinción se llevan a cabo en RT.- Colocar los portaobjetos del paso 5.1.4.3 en un estante y realizar los siguientes lavados para rehidratar a RT: xileno durante 5 min (3x), 100% etanol para 2 min (2x), 95% etanol para 2 min (2x), 70% etanol para 2 min, y 50% etanol para 15 min.
- Mancha en 0.1% solución verde rápida durante 5 min. Enjuagar en ácido acético 1% durante 10 s.
- Mancha en 0,1% solución de tinción de safranina O durante 20 min. Sumergir los portaobjetos en los siguientes lavados: 95% etanol para 2 min (2x), 100% etanol para 2 min (2x), y xileno durante 2 min (2x).
- Monte las secciones de tejido y observe los tejidos bajo un microscopio.
NOTA: Consulte las imágenes representativas en la Figura 4A.
- Tinción inmunohistoquímica para visualizar neutrófilos
- Hornee las secciones de parafina durante 2 h a 78 oC. Colocar los portaobjetos en un estante y realizar los siguientes lavados para rehidratar a RT: xileno durante 15 min (2x), 100% etanol para 5 min (2x), 95% etanol para 5 min, 80% etanol para 5 min, H2O para 3 min, y PBS durante 3 min.
NOTA: No deje que las diapositivas se sequen en ningún momento durante este paso. - Agregue una gota de tampón de permeabilización para cubrir el tejido. Incubar secciones en una bandeja controlada por humedad a 37oC.
- Enjuague los portaobjetos en PBS durante 3 min (3x). Evite enrredarse el tejido directamente.
- Realice la recuperación de epítopos de antígeno inducidos por calor utilizando una caldera de presión.
- Organizar diapositivas en un bastidor. Sumerja las diapositivas en la caldera de presión llena de búfer de recuperación.
- Ponga la caldera de presión en un horno microondas. Ajuste el horno microondas a 600 W y caliente los portaobjetos durante 10 minutos.
- Después de hervir, mantenga los portaobjetos en la caldera para enfriara a 90 oC. Saque las diapositivas y enjuáguelas en PBS durante 3 min (3x).
- Quench actividad endógena de peroxidasa en recién preparado 3% H2O2 a RT durante 15 min. Enjuagar diapositivas en PBS durante 3 min (3x).
- Delinee un círculo grande alrededor de la muestra con una pluma hidrófoba, evite tocar la muestra. Bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en una cámara controlada por humedad a 37 oC durante 60 min.
- Retire la solución de bloqueo. Añadir rápidamente 50 l de anticuerpo primario diluido en PBS a cada sección. A continuación, incubar los portaobjetos en una bandeja controlada por humedad a 4 oC durante la noche.
NOTA: Se utilizan diferentes relaciones de dilución para diferentes anticuerpos (1:25 para MPO y 1:20 para NE). - En el segundo día, saque la bandeja y déjela reposar en RT durante 30 minutos. A continuación, enjuague las diapositivas en PBS durante 3 min (3x).
- Añadir 50 l de anticuerpos secundarios diluidos en PBS al tejido.
NOTA: Se aplicaron diferentes relaciones de dilución: 1:1.000 para MPO y 1:1.500 para NE. - Incubar los portaobjetos en una bandeja controlada por humedad a 37oC durante 30 min. A continuación, enjuague las diapositivas en PBS durante 3 min (3x).
- Desarrollar en solución diluida de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) durante 5 min. Mantenga un ojo en la reacción en caso de desarrollo de un color oscuro. Enjuague los portaobjetos en agua destilada.
- Contratin los portaobjetos en hematoxilina durante 10 s. Enjuague los portaobjetos en agua del grifo durante 5 min.
- Enjuagar en alcohol ácido solución de diferenciación superrápida para 3 s. A continuación, enjuague en agua del grifo durante 10 minutos.
- Sumerja los portaobjetos en los siguientes lavados a RT: 80% etanol para 5 min, 95% etanol para 5 min, 100% etanol durante 5 min y xileno durante 15 min (2x). Fije la cubierta con solución de montaje. Observe el tejido bajo un microscopio.
NOTA: Consulte las imágenes representativas en la Figura 4B.
- Hornee las secciones de parafina durante 2 h a 78 oC. Colocar los portaobjetos en un estante y realizar los siguientes lavados para rehidratar a RT: xileno durante 15 min (2x), 100% etanol para 5 min (2x), 95% etanol para 5 min, 80% etanol para 5 min, H2O para 3 min, y PBS durante 3 min.
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Representative Results
Las células de exudado peritoneal se recogieron del líquido de lavado de ratones. Las células se resuspendieron en 1 ml de medio completo RPMI-1640, en capas en dos pasos (54,8%/70,2%) gradiente de densidad discontinua(Figura 1A) y centrifugado a 1.500 x g para 30 min. Los neutrófilos (95%, 1 x 107 neutrófilos/ratón) se recuperaron de la interfaz inferior(Figura 1B).
Se realizaron experimentos con bolsas de aire para investigar el reclutamiento de neutrófilos estimulado por LPS in vivo(Figura 2A). Se midieron los subconjuntos de leucocitos en los exudados de la bolsa de aire(Figura 2B).
La migración de neutrófilos en RA se evaluó a través del modelo murino de artritis inducida por CFA. En comparación con el grupo de control, el grupo AA mostró un edema significativo en la pata. En el grupo AA, el diámetro de la articulación del tobillo aumentó(Figura 3B)y la puntuación de artritis aumentó consistentemente(Figura 3D).
El daño del cartílago es el síndrome representativo de la AR, la safranina O-fast green se realizó la tinción del cartílago verde para evaluar el daño del cartílago en el ratón AA. Como se muestra en la Figura 4A, desafío CFA indujo una gran cantidad de infiltración de leucocitos, erosión significativa del cartílago e hiperplasia sinovial. Los niveles de expresión MPO y NE son marcadores representativos de infiltración de neutrófilos. Se realizaron ensayos inmunohistoquímicos para observar la infiltración de neutrófilos en las articulaciones. La expresión MPO y NE se reguló significativamente en la sección conjunta(Figura 4B).
Figura 1: Aislamiento de neutrófilos. (A) Las células de exudado peritoneal resuspendidas en 1 ml de medio completo RPMI-1640 se colocaron en capas en un paso de dos pasos (54,8%/70,2%) gradiente de densidad discontinua. (B) Después de la centrifugación a 1.500 x g durante 30 min, los neutrófilos (95%, 1 x 107 neutrófilos/ratón) se recuperaron de la interfaz inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos del ensayo de la bolsa de aire. (A) Ilustración del ensayo de la bolsa de aire. (B) Resultados representativos de la infiltración de subconjuntos de leucocitos en el ensayo de la bolsa de aire. PBS: control; LPS: 1 g/mL LPS. Los datos se presentan como la media de SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos del modelo de ratón de artritis inducida por adyuvantes (AA). (A) El diámetro de la articulación del tobillo se midió utilizando un medidor de espesor de bolsillo. (B) Se evaluó la hinchazón articular basada en el diámetro de la articulación del tobillo (n.o 7). (C) Imágenes de cada puntuación de artritis. (D) La gravedad de la artritis se calificó en una escala de 0 a 4 puntos (n a 7). Los datos se presentan como la media de SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la tinción de cartílago verde O-fast de safranina y el ensayo inmunohistoquímico de secciones articulares de ratones de control y AA. (A) Resultados representativos de la tinción de cartílago verde o-rápida de safranina de las secciones articulares. (B) Resultados representativos del nivel de expresión de MPO y NE en las articulaciones del tobillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los protocolos detallados de neutrófilos altamente purificados de sangre periférica7, médula ósea y tejidos18 han estado disponibles durante mucho tiempo. Aquí adoptamos un método de aislar a los neutrófilos del líquido peritoneal19 en el que los neutrófilos maduros permanecen inactivados para estudios antiinflamatorios y antioxidantes adicionales.
Usamos el experimento de la bolsa de aire para explorar la infiltración inducida por LPS de neutrófilos in vivo. Este método se ha propuesto como un método potencial para medir directamente la infiltración celular en el ambiente inflamatorio general in vivo.
Cabe destacar que el ensayo de la bolsa de aire sólo demuestra la función del neutrófilo de una manera inespecífica en los órganos y elimina varios pasos de la cascada de reclutamiento de leucocitos. Dado que el reclutamiento de neutrófilos en órganos específicos puede basarse en diferentes propiedades de órganos, moléculas de adhesión y quimiopelinas, explorar el estado funcional de los neutrófilos en condiciones específicas de órganos es de gran importancia para estudiar el papel que los neutrófilos potencialmente desempeñan en ciertas enfermedades3. Se ha sugerido que los modelos de punto final son necesarios para investigar la infiltración de neutrófilos. Por lo tanto, la realización de tinción inmunohistoquímica en las secciones articulares de ratones en el modelo AA puede proporcionar una perspectiva perspicaz sobre los neutrófilos en el espacio articular. Según nuestros datos, un gran número de neutrófilos son reclutados en el tejido articular y sirven como evidencia fundamental para seguir investigando la infiltración de neutrófilos para tratar la AR. Además, se requieren ensayos exhaustivos, por ejemplo, la tinción verde de safranina O-fast, para evaluar el modelo de enfermedad para su estudio posterior.
Los neutrófilos son el principal subconjunto de células inflamatorias infiltrantes y trabajan como la primera línea de defensa contra patógenos invasores o lesiones tisulares20,21. Si los neutrófilos se infiltran en los tejidos en grandes cantidades, se secretan altos niveles de citoquinas y NETs, lo que juntos pueden abrumar los mecanismos protectores en los tejidos y conducir a daño tisular. La lesión tisular estimula aún más la infiltración de neutrófilos, formando así un círculo vicioso22. La interferencia con la migración celular mediante la captura de células activadas en órganos linfoides se ha propuesto como un importante enfoque terapéutico y se ha aplicado en ensayos clínicos con diversos efectos secundarios23. Descubrir un tratamiento novedoso para regular simultáneamente la migración de neutrófilos y la actividad inflamatoria es una estrategia prometedora para el tratamiento de enfermedades inflamatorias en el futuro. Además, si se combinan agentes reguladores de la motilidad, la administración de fármacos mediada por neutrófilos24 puede aumentar la especificidad de los medicamentos, disminuyendo así los efectos secundarios.
Sin embargo, pueden combinarse nuevas modificaciones para ampliar la aplicación de los ensayos antes mencionados. Por ejemplo, en el modelo de ratón AA, para obtener la impresión general de infiltración de células inflamatorias en la articulación, se alienta a los investigadores a digerir enzimáticamente las articulaciones para liberar las poblaciones de leucocitos residentes y luego aplicar la citometría de flujo para contar las poblaciones.
Los protocolos aquí presentes incluyen tres formas de evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos. La aplicación de estos protocolos es útil para descubrir posibles tratamientos para la AR y otras enfermedades inflamatorias que involucran a neutrófilos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81430099 y 31500704), Proyectos de Cooperación Internacional e Intercambio (número de subvención 2014DFA32950), y el programa de investigación de la Universidad de Medicina China de Beijing ( números de subvención BUCM-2019-JCRC006 y 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
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