Summary
Burada nötrofil göçünü ve infiltrasyonu hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için üç yöntem sayılmaktadır. Bu yöntemler nötrofil göç hedefleyen umut verici terapötik keşfetmek için kullanılabilir.
Abstract
Nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir üyesidir ve patojenlere ve patolojik inflamatuar reaksiyonlara karşı konak savunmasında önemli rol oynarlar. Nötrofiller sitokinler ve kemokinler rehberliği ile inflamasyon sitelerine işe alınabilir. Nötrofillerin ezici infiltrasyonu romatoid artrit (RA) gibi gelişigüzel doku hasarına yol açabilir. Periton eksüdasından izole edilen nötrofiller, Transwell veya Zigmond oda tahlillerinde in vitro in in vitro, tanımlanmış bir kemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) yanıt verir. Hava kese deneyi, nötrofillerin lipopolisakkarite (LPS) in vivo doğru kemotaksisini değerlendirmek için kullanılabilir. Adjuvanin neden olduğu artrit (AA) fare modeli RA araştırmalarında sıklıkla kullanılır ve eklem kesitlerinin anti-miyeloperoksidaz (MPO) veya anti-nötrofil elastaz (NE) antikorları ile immünohistokimyasal boyama, ölçüm yapmak için iyi kurulmuş bir yöntemdir. nötrofil infiltrasyonu. Bu yöntemler nötrofil göç hedefleyen umut verici tedaviler keşfetmek için kullanılabilir.
Introduction
Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresidir ve insanlardaki tüm beyaz kan hücresi popülasyonunun %50−70'ini oluşturmaktadır1. Nötrofiller akut inflamasyon sırasında birincil yanıt layıcılarından biridir. Nötrofiller inflamasyon sitelerine doku yerleşik hücreler tarafından yayımlanan sitokinler ve kemokinler rehberlik yoluyla işe alınabilir2,3,4, nötrofiller ve vasküler endotel hücrelerinin yüzeyindehücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşimler aracılık 5 . Nötrofiller savunma barındırmak için temel ve reaktif oksijen türlerinin serbest bırakılması yoluyla doku zarar güçlü kapasitesi nedeniyle patolojik inflamatuar reaksiyonlarda bir rol oynamak (ROS) ve diğer doku zarar molekülleri3,6.
Önceki çalışmalarda fareler veya insanlar birkaç nötrofil izolasyon protokolleri açıklanmıştır. Oh ve ark. insan nötrofillerini bütün insan kanından izole etmek için yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gösterdi7. Ancak, fare kanyeterli nötrofillerin izolasyon küçük kan hacmi nedeniyle zordur. Alternatif olarak, saf ve canlı fare nötrofil çok sayıda fare periton sıvısı elde edilebilir, ve bu saflaştırılmış nötrofiller nötrofil infiltrasyon, göç, kemotaksis, oksidatif patlama, sitokin ve nötrofil ekstrasellüler tuzak (NET) üretim8dahil olmak üzere hücresel fonksiyonları ex vivo çeşitli yönlerini incelemek için ex vivo kullanılabilir . Transwell tahliller9 veya Zigmond odası tahlilleri10,11 in vitro nötrofil göç değerlendirmek için kullanılabilir. Hava kese modeli in vivo nötrofillerin göç ve infiltrasyon değerlendirmek için kullanılır. Deri altı hava torbası modeli inflamatuar hücrelerin göçincelemek için uygun bir in vivo hayvan modelidir.
Geleneksel olarak, nötrofiller inflamasyon akut aşamalarında patojen eliminatörler olarak kabul edildi. Ancak, son bulgular nötrofiller özel işlevleri önemli bir çeşitlilik gerçekleştirmek karmaşık hücreler olduğunu göstermiştir. Nötrofiller akut yaralanma ve onarım, tümörigenez, otoimmün yanıt ve kronik inflamasyon12,13gibi birçok süreci düzenleyebilir. Nötrofiller de adaptif bağışıklık yanıtları modüle ve B hücreleri ve T hücreleri düzenleyebilir14,15. Nötrofillerin önemli sıkıntısı insanlarda mortalite veya şiddetli immün yetmezlik ve farelerde nötrofil tükenmesine yol açarken, aşırı aktivasyon veya organlarda nötrofil lerin işe alınması romatoid artrit (RA) vesistemik lupus eritematosus (SLE) 6 gibi çeşitli bağışıklık hastalıklarına neden olur. Nötrofiller RA hastalarının sinovyal sıvıen bol hücrelerdir. Nötrofiller, kıkırdak erozyonunu şiddetlendiren bozulma yoluyla aşırı miktarda miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) üretirler. MPO esas olarak nötrofillerin granüllerinde ifade edilen bir peroksidaz enzimdir16. NE eklem kıkırdağı yıkımı ile ilişkilidir17. MPO ve NE, RA hastalarının dokularında nötrofil göçü ve infiltrasyon durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Bu makalede, hem in vivo hem de in vitro indüklenen normal nötrofillerin göçünü değerlendirmek için üç geleneksel yöntem invivo, hem de bir fare eklem özgü inflamasyon modelipatolojik nötrofillerin infiltrasyonu sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler gözden geçirildi ve Pekin Üniversitesi Çin Tıbbı Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
NOT: C57BL/6 fareler (7-8 haftalık) kullanıldı.
1. Nötrofil izolasyonu
- Periton eksüda hücrelerinin edinimi
- Hazırlayın taze% 10 proteoz peptoneçözeltisiddH 2 O. Fare sayısına göre gerekli hacmi hesaplamak.
NOT: Fare sayısını N olarak ayarlayın, (2N+1) mL çözeltisi önceden çözülmeli ve filtrelenmelidir. - Sprey çalışma alanı% 70 etanol ile. Peptone çözeltisi ve deşarj kabarcıkları 1 mL çizmek için bir insülin enjektörü kullanın.
- Fare başına 1 mL peptone çözeltisi ilk intraperitoneal enjeksiyonuyguluyor.
- Fareyi tek elle baş aşağı pozisyonunda yakalayın. Enjeksiyon noktasını alkolle ıslatılmış pamuk toplarla dezenfekte edin.
NOT: Tercih edilen enjeksiyon pozisyonu karın alt sol veya sağ kadranda lateral yönü yatıyor. - Reaktifleri hızla aşıla. İnsülin enjektörü ile her farenin periton boşluğuna 1 mL enjekte edin.
NOT: İğne ile deri arasındaki açı, bağırsak veya diğer organların yaralanmasını önlemek için yaklaşık 15−30° olmalıdır.
- Fareyi tek elle baş aşağı pozisyonunda yakalayın. Enjeksiyon noktasını alkolle ıslatılmış pamuk toplarla dezenfekte edin.
- Bir gecede iltihaplı yanıtın gelişmesine izin verin. 12 saat sonra, ilk enjeksiyon ile aynı şekilde ikinci enjeksiyon uyguluyor.
- İkinci enjeksiyondan üç saat sonra, 2 L/dk hızda bir gaz anestezi odasında 5 dakika boyunca %5 izofluran ile fareleri tamamen anestezi edin.
NOT: Fareleri odadan tek solunum ünitesine taşımadan önce parmak parmaklarının kıstırılarak yeterli anestezi derinliği sağlanır. Ayak parmaklar sıkıştığınızda bacaklar hareket etmemelidir.
NOT: Aşağıdaki tüm adımlar bir doku kültürü başlık içinde işlenmelidir. - Sprey% 70 etanol ile fare. Fareyi steril bir plastik pedin üzerine yerleştirin ve uzuvları iğnelerle düzeltin.
- Alt karın ortasında yatay bir kesi (~ 1 cm) yapmak için cerrahi araçlar steril bir set kullanın. Forseps ile üst karın deri kaldırın ve karın orta hattı boyunca kesilmiş ve bozulmamış periton duvarı ortaya çıkarmak.
- 30 G x 1/2" iğne ile karın boşluğuna 5 mL steril RPMI-1640 komple orta enjekte edin. İğneyi periton duvarına, iğnenin dikeli kenarı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve tüm hacmi enjekte edin.
- 5 dk. Masaj karın için yatay olarak yastık çalkalayın birkaç kez.
- Karın lateral boşluğuna 23 G x 1 1"lik bir iğne enjekte edin. Karın sıvısını ayıklayın (~5 mL) ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
NOT: Nötrofil aktivasyonu durumunda tüpleri mümkün olan en kısa sürede buzüzerine yerleştirin. - Başka bir 5 mL tam orta enjekte ve periton kalan hücreleri kaldırmak için prosedürü tekrarlayın. Periton sıvısını 50 mL santrifüj tüpte birleştirin.
- Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika 400 x g'de havuzlu periton sıvısını santrifüj edin.
- Supernatant atın. RPMI-1640 tam orta 1 mL hücreleri resuspend.
NOT: Nötrofil aktivasyonu önlemek için girdap etmeyin.
- Hazırlayın taze% 10 proteoz peptoneçözeltisiddH 2 O. Fare sayısına göre gerekli hacmi hesaplamak.
- Nötrofillerin İzolasyon
- 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 4 mL taze hazırlanmış %70,2 yoğunluk gradyan ortamı (örneğin, Percoll) ekleyin.
- 15 mL santrifüj tüpte keskin pipet uçları ile tüpün kenarı boyunca yavaşça %70,2 yoğunluk gradyan ortamına 4 mL taze hazırlanmış %54,8 yoğunluk gradyan ortamı dikkatlice yerleştirin.
NOT: %54,8 yoğunluk gradyan orta ve %70,2 yoğunluk gradyan orta arasındaki arabirimi rahatsız etmemek için dikkatli olun. - 1 mL periton hücreli süspansiyonu %54,8 yoğunlukgradyan orta tabakanın üzerine keskin pipet uçlarıyla yavaşça yerleştirin(Şekil 1A).
NOT: Hücre süspansiyonu ile %54,8 yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arabirimi rahatsız etmemek için dikkatli olun. - Frenleme yapmadan 22 °C'de 30 dk için 1.500 x g'de santrifüj.
- Nötrofilleri %54,8 yoğunluk gradyan orta ve %70,2 yoğunluk gradyan orta katmanların(Şekil 1B)arabiriminde yeni bir tüpe toplayın.
- Toplanan hücrelere 1 mL RPMI-1640 tam orta ekleyin ve birkaç kez yavaşça borulama yaparak hücreleri dikkatlice yeniden askıya alın. 10 0 0 0 0 0 0 0 0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 0
- Yıkama adımını (adım 1.2.6) bir kez tekrarlayın.
- Pelete 0,5 mL kültür ortamı ekleyin ve birkaç kez hafifçe borulandırarak hücreleri yeniden askıya alın. Otomatik hematoloji analizörü kullanarak hücreleri saymak için 50 μL aliquot alın.
2. Nötrofil göç tofmej
- Transwell dosay9 veya Zigmond oda tsay tarafından ölçü nötrofil göç daha önce açıklandığı gibi10,11.
3. Hava kese sabunu
- İlk hava enjeksiyonu
- 0. günde, 2 L/dk hızda bir gaz anestezi odasında 3 dakika boyunca %5 izofluran ile fareleri tamamen anestezi edin ve her farenin anestezisini tek bir solunum ünitesinde %2 izofluran ile 0,5 L/dk hızda koruyun.
NOT: Fareleri odadan tek solunum ünitesine taşımadan önce parmak parmaklarının kıstırılarak yeterli anestezi derinliği sağlanır. Ayak parmaklar sıkıştığınızda bacaklar hareket etmemelidir. - Sterilize hava3 mL hacim elde etmek için 5 mL şırınga bağlı 0,22 μm filtre kullanın.
- Anestezili farenin arka derisini cımbızla kaldırın ve 26 G x 3/8" iğne kullanarak 3 mL sterilize havaenjekte edin.
- Tedaviden sonra, fareleri solunum ünitesinden çıkarın. Hareket etmeye başlayana kadar hayatta olduğundan emin olmak için fareleri izleyin.
- 0. günde, 2 L/dk hızda bir gaz anestezi odasında 3 dakika boyunca %5 izofluran ile fareleri tamamen anestezi edin ve her farenin anestezisini tek bir solunum ünitesinde %2 izofluran ile 0,5 L/dk hızda koruyun.
- İkinci hava enjeksiyonu
- 3. günde, bölüm 3.1'de açıklandığı gibi hava kesesini sürdürmek için önceden kurulmuş hava cebine 3 mL daha sterilize edilmiş hava enjekte edin.
- Tedavi
- 6. günde, kurban kesmeden önce 6 saat, hava kesesine farklı tedaviler enjekte edin. Negatif kontrol olarak 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin. Lokal iltihabı tetiklemek için pozitif kontrol olarak 1 mL 1 μg/mL LPS enjekte edin.
- 2 L/dk hızda bir gaz anestezi odasında 3 dakika boyunca %5 izofluran ile fareleri tamamen anestezi edin ve her farenin anestezisini %2 izofluran ile tek bir solunum ünitesinde 0,5 L/dk hızla koruyun. Malzeme Tablosunagöre yıkama tamponu hazırlayın.
NOT: Fareleri odadan tek solunum ünitesine taşımadan önce parmak parmaklarının kıstırılarak yeterli anestezi derinliği sağlanır. Ayak parmaklar sıkıştığınızda bacaklar hareket etmemelidir. - Her hava kesesi için hava kesesini 1 mL yıkama tamponu ile yıkayın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde inflamatuar eksüdayı toplayın. Hava kesesini 2 mL yıkama tamponu 2x ile yıkayın ve aynı santrifüj tüpünde inflamatuar eksüdayı toplayın.
- 10 dk'da 10 0 0 00 x g'da santrifüj. Otomatik hematoloji analizörü kullanarak nötrofil oranını ölçmek için hücreleri sayın.
NOT: Şekil 2'dekitemsili sonuçlara bakın.
4. Adjuvan indüklenen artrit indüksiyonu (AA) fare modeli
- Freund'un adjuvanını (CFA) en az 5 s girdap yaparak askıya alın, ardından 100 μL'lik süspansiyonu insülin enjektöre çekin.
NOT: Steriliteyi sağlamak için deneylerde tamamen yeni CFA kullanmanızı öneririz. - Adım 3.1.1'de açıklandığı gibi fareleri anestezi edin.
- Seçilen pençeyi işaretleyin ve ayak bileği eklem boşluğuna 20°L CFA enjekte edin. Seçilen pençede dört periartiküler noktalara 20 μL süspansiyon enjekte edin (toplamda 80°L).
- Fareleri solunum ünitesinden çıkarın ve işlenmiş fareleri yeni bir odaya koyun. Hareket etme yeteneğini yeniden kazanana kadar nefes aldıklarından emin olmak için fareleri izleyin.
- Her 3 günde bir, ayak bileği eklem çapını cep kalınlığı göstergesi ile ölçerek eklem çapını değerlendirin (Şekil 3A).
- Her 3 günde bir artrit şiddetini artrit puanlama kriterine göre değerlendirin (Şekil 3C): 0, normal, eritem ve şişlik bulgusu yok; 1, en hafif artrit, eritem ve hafif şişlik tarsals veya ayak bileği eklemsınırlı; 2, orta artrit, eritem ve hafif şişlik tarsals ayak bileği nden uzanan; 3, şiddetli artrit, eritem ve metatarsal eklemlere ayak bileği uzanan orta şişlik; 4, en şiddetli artrit, eritem ve şiddetli şişlik ayak bileği kapsar, ayak ve basamak, veya ekstremite ankiloz.
5. Eklem kesitlerinin immünohistokimyasal boyanması
- Eklem izolasyonu
- Isofluran e-anestezi sonrası servikal çıkığı kullanarak 4. Sprey% 70 etanol ile fare.
- Cımbız ve makas ile arka bacaktan deri ve kas parçası çıkarın. Sprey% 70 etanol ile eklem ve bir kağıt havlu kullanarak kasların geri kalanı çıkarın.
- RT 2 gün boyunca% 4 paraformaldehit ayak bileği eklemi düzeltin.
- Dokuyu parafinle gömün ve 4-μm kalınlığında doku kesitleri hazırlayın.
- Belirli hacimli sıvı parafin içeren işaretli bir kalıba doku yerleştirin. Kısaca soğutun.
- Kalınlığı 4 μm olarak ayarlayın ve bir mikrotom üzerinde dilimler kesti. 43 °C'lik su banyosunda float bölümleri.
- Bölümleri slaytların üzerine yerleştirin ve slaytları 70 °C'de 2 saat fırına koyun. İleride kullanılmak üzere, -20 °C'de slaytları koruyun.
- Safranin O ve eklem kesitlerinin hızlı yeşil boyama
NOT: Aşağıdaki boyama adımları RT'de gerçekleştirilir.- Bir rafa adım 5.1.4.3 slaytlar yerleştirin ve RT rehydrate için aşağıdaki yıkar gerçekleştirmek: 5 dakika (3x) için ksilen, 2 dakika (2x için% 100 etanol), 2 dakika için% 95 etanol (2x), 2 dakika için% 70 etanol ve 15 dakika boyunca akan musluk için% 50 etanol.
- 5 dk. 10 s için% 1 asetik asit durulayın için% 0.1 hızlı yeşil çözeltileke.
- 20 dk. 20 dakika boyunca %0,1 safranin O boyama çözeltisinde leke: 2 dk (2x) için %95 etanol, 2 dk (2x) için %100 etanol ve 2 dk (2x) için ksilen.
- Doku bölümlerini monte edin ve bir mikroskop altında dokuları gözlemleyin.
NOT: Şekil 4A'dakitemsili resimlere bakın.
- Nötrofilleri görselleştirmek için immünohistokimyasal boyama
- Parafin kesitlerini 78 °C'de 2 saat pişirin. Slaytları bir rafa yerleştirin ve RT'de rehidrat için aşağıdaki yıkıntıları yapın: 15 dakika (2x), 5 dakika (2x) için %100 etanol, 5 dakika için %95 etanol, 5 dakika için %80 etanol, 3 dakika için H2O ve 3 dakika pbs.
NOT: Bu adımda slaytların hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin. - Dokuyu kapsayacak şekilde bir damla permeabilizasyon tamponu ekleyin. 37 °C'de nem kontrollü tepside kuluçka bölümleri.
- PBS'deki slaytları 3 dakika (3x) durula. Dokuyu doğrudan durulamaktan kaçının.
- Bir basınç kazanı kullanarak ısı kaynaklı antijen epitop alma gerçekleştirin.
- Slaytları rafa yerleştirin. Alma tamponu ile dolu basınç kazanı slaytlar batırın.
- Basınç kazanını mikrodalga fırına koyun. Mikrodalga fırını 600 W'a ayarlayın ve slaytları 10 dk ısıtın.
- Kaynadıktan sonra 90 °C'ye kadar soğuması için kazanda slaytlar tutun. Slaytları çıkarve PBS'de 3 dakika (3x) durulayın.
- Taze hazırlanmış 3% H2O2 15 dakika pbs içinde durulama slaytlar için 3 dakika (3x) için endojen peroksidaz aktivitesi niyok etmek.
- Numunenin etrafında hidrofobik bir kalemle büyük bir daire çizin, numuneye dokunmaktan kaçının. Nem kontrollü bir odada %3 büyükbaş serum albumini (BSA) ile 37 °C'de 60 dk.
- Engelleme çözümlerini kaldırın. Her bölüme 50 μL PBS seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Daha sonra, bir gecede 4 °C'de nemi kontrol eden tepside kaydırakları kuluçkaya yatırın.
NOT: Farklı antikorlar için farklı seyreltme oranları kullanılır (MPO için 1:25 ve NE için 1:20). - İkinci gün, tepsiyi çıkarın ve 30 dakika RT'de bekletin. Daha sonra PBS'deki slaytları 3 dakika (3x) durulayın.
- Dokuya 50 μL PBS seyreltilmiş sekonder antikor ekleyin.
NOT: Farklı seyreltme oranları uygulandı: MPO için 1:1.000 ve NE için 1:1.500. - 37 °C'de nem kontrollü tepside 30 dk boyunca inküler. Daha sonra PBS'deki slaytları 3 dakika (3x) durulayın.
- 5 dk. Seyreltilmiş 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi geliştirin. Damıtılmış suda slaytları durulayın.
- 10 s. 5 dakika musluk suyundaki slaytları durulayın hematoksilin slaytlar karşı leke.
- 3 s için asit alkol superfast diferansiyasyon çözeltisi durulayın. Daha sonra 10 dakika musluk suyunda durulayın.
- Aşağıdaki yıkarlar içinde slaytlar batırın: 80% etanol 5 dakika için, 5 dakika için% 95 etanol, 5 dakika için% 100 etanol ve 15 dakika (2x) için ksilen. Montaj çözeltisi ile coverslip'i düzeltin. Bir mikroskop altında doku gözlemleyin.
NOT: Şekil 4B'dekitemsili resimlere bakın.
- Parafin kesitlerini 78 °C'de 2 saat pişirin. Slaytları bir rafa yerleştirin ve RT'de rehidrat için aşağıdaki yıkıntıları yapın: 15 dakika (2x), 5 dakika (2x) için %100 etanol, 5 dakika için %95 etanol, 5 dakika için %80 etanol, 3 dakika için H2O ve 3 dakika pbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Periton eksüda hücreleri farelerin lavaj sıvısından toplanmıştır. Hücreler RPMI-1640 tam orta 1 mL yeniden askıya alındı, iki adım üzerine katmanlı (54.8% / 70.2%) kesintili yoğunluk gradyanı (Şekil 1A), ve 30 dk. Nötrofiller için 1.500 x g olarak santrifüj (≥%95, ~1 x 107 nötrofil/fare) alt arabirimden kurtarılmıştır (Şekil 1B).
LpS in vivo tarafından uyarılan nötrofil alımını araştırmak için hava kese deneyleri yapılmıştır (Şekil 2A). Hava kese uçlarında bulunan lökosit alt kümeleri ölçüldü (Şekil 2B).
RA'daki nötrofil göçü CFA'ya bağlı artrit ürinen model ile değerlendirildi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, AA grubu pençeönemli ödem gösterdi. AA grubunda ayak bileği eklem çapı artmış(Şekil 3B) ve artrit skoru sürekli olarak artmıştır (Şekil 3D).
Kıkırdak hasarıra temsili sendromdur, safranin O-hızlı yeşil kıkırdak boyama aa fare kıkırdak hasarı değerlendirmek için yapıldı. Şekil 4A'dagösterildiği gibi CFA mücadelesi büyük miktarda lökosit infiltrasyonu, önemli kıkırdak erozyonu ve sinovyal hiperplaziye neden oldu. MPO ve NE ekspresyonu düzeyleri nötrofil infiltrasyonunun temsili belirteçleridir. Eklemlerde nötrofil infiltrasyonunu gözlemlemek için immünohistokimyasal çalışmalar yapıldı. MPO ve NE ekspresyonu eklem kesitinde önemli ölçüde döşeli idi(Şekil 4B).
Şekil 1: Nötrofil izolasyonu. (A) RPMI-1640 komple orta 1 mL resuspended periton eksüda hücreleri iki adım üzerine katmanlı edildi (54.8% / 70.2%) kesintili yoğunluk degradesi. (B) 30 dk için 1.500 x g santrifüjden sonra alt arabirimden nötrofiller (≥%95, ~1 x 107 nötrofil/fare) ele geçirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hava kesesinin temsili sonuçları. (A) Hava kesesi suresinin çizimi. (B) Hava kesesinde lökosit alt kümesiin infiltrasyonunun temsili sonuçları. PBS: kontrol; LPS: 1 μg/mL LPS. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur.
Şekil 3: Adjuvan kaynaklı artrit (AA) fare modelinin temsili sonuçları. (A)Ayak bileği eklem çapı bir cep kalınlığı göstergesi kullanılarak ölçüldü. (B) Eklem şişmesi ayak bileği eklem çapına göre değerlendirildi (n = 7). (C) Her artrit skoru resimleri. (D) Artritin şiddeti 0−4 puan (n = 7) ölçeğinde derecelendirildi. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur.
Şekil 4: Safranin O-hızlı yeşil kıkırdak boyama ve kontrol ve AA fareler eklem bölümlerinin immünohistokimyasal tahsin temsil sonuçları. (A) Eklem kesitlerinin safranin o-hızlı yeşil kıkırdak boyama temsil sonuçları. (B) Ayak bileği eklemlerinde MPO ve NE ekspresyon düzeyinin temsili sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Periferik kan dan yüksek saflaştırılmış nötrofillerin ayrıntılı protokolleri7, kemik iliği ve dokular18 uzun bir süre için kullanılabilir olmuştur. Burada, erişkin nötrofillerin daha fazla anti-inflamatuar ve antioksidan çalışmalar için inaktive kaldığı periton sıvısı19'dan nötrofilleri izole etme yöntemini benimsemekteyiz.
Hava kese deneyini, nötrofillerin LPS kaynaklı infiltrasyonlarını araştırmak için kullandık. Bu yöntem, in vivo in genel inflamatuar ortamda hücre infiltrasyon doğrudan ölçmek için potansiyel bir yöntem olarak önerilmiştir.
Bu hava kese sataşsadece organ nonspesifik bir şekilde nötrofil işlevini gösterir ve lökosit işe çağlayan birkaç adım kaldırır dikkat çekicidir. Belirli organlara nötrofil işe farklı organ özellikleri, adezyon molekülleri ve kemokinler güvenebilirsiniz bu yana, organa özgü koşullarda nötrofil fonksiyonel durumu keşfetmek potansiyel nötrofiller potansiyel olarak bazı hastalıklarda oynadığı rolü incelemek için büyük önem taşımaktadır3. Nötrofil infiltrasyonunun araştırılması için uç nokta modellerinin gerekli olduğu ileri sürülmüştür. Bu nedenle, AA modelinde farelerin eklem bölümlerinde immünohistokimyasal boyama yapmak eklem uzayında nötrofiller üzerinde anlayışlı bir bakış açısı sağlayabilir. Verilerimize göre, nötrofillerin çok sayıda eklem dokusu içine işe ve RA tedavisi için nötrofillerin infiltrasyon kesme üzerinde daha fazla araştırma için temel kanıt olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, kapsamlı tahliller, örneğin, safranin O-hızlı yeşil boyama, daha fazla çalışma için hastalık modeli değerlendirmek için gereklidir.
Nötrofiller inflamatuar hücrelere sızma ana alt kümesi dir ve işgal patojenler veya doku yaralanması20karşı savunma ilk satırı olarak çalışmak20 ,21. Nötrofiller dokulara çok sayıda sızıyorsa, yüksek düzeyde sitokin ve NET salgılanır, bu da dokularda koruyucu mekanizmaları bastırabilir ve doku hasarına yol açabilir. Doku yaralanması daha nötrofil infiltrasyon uyarır, böylece bir kısır döngü oluşturan22. Lenfoid organlarda aktif hücrelerin hapsi yoluyla hücre göçüne müdahale etmek önemli bir tedavi yaklaşımı olarak önerilmiş ve çeşitli yan etkileri olan klinik çalışmalarda uygulanmıştır23. Nötrofil göç ve inflamatuar aktiviteyi eş zamanlı olarak düzenlemek için yeni bir tedavi keşfetmek gelecekte inflamatuar hastalıkların tedavisi için umut verici bir stratejidir. Ayrıca, motilite düzenleyici ajanlar kombine edilirse, nötrofil aracılı ilaçteslimatı 24 ilaç özgüllüğünü artırabilir, böylece yan etkileri azaltarak.
Ancak, yukarıda belirtilen tahlillerin uygulanmasını genişletmek için daha fazla değişiklik birleştirilebilir. Örneğin, AA fare modelinde, eklemde inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu genel izlenimi elde etmek için, araştırmacılar enzimatik yerleşik lökosit popülasyonları serbest bırakmak ve daha sonra saymak için akış sitometri uygulamak için eklemleri sindirmek için teşvik edilir nüfus.
Buradaki protokoller nötrofil göçünü ve infiltrasyonu değerlendirmenin üç yolunu içermektedir. Bu protokollerin uygulanması RA ve nötrofiller içeren diğer inflamatuar hastalıklar için potansiyel tedaviler keşfetmek için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 81430099 ve 31500704), Uluslararası İşbirliği ve Değişim Projeleri (hibe numarası 2014DFA32950) ve Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi araştırma programı ( hibe numaraları BUCM-2019-JCRC006 ve 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
