Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Biopartikel mikroarrays til kemotaktisk og molekylær analyse af human neutrofil sværmer in vitro

Published: February 16, 2020 doi: 10.3791/60544

Summary

Denne protokol genererer biopartikel mikroarrays, der giver rumligt kontrolleret neutrofil sværmer. Det giver nem adgang til de mæglere, neutrofiler frigive under migration og giver mulighed for kvantitative billeddannelse analyse.

Abstract

Neutrofil sværmer er et kooperativ proces, hvorved neutrofiler forsegle et sted for infektion og fremme væv reorganisering. Sværmer er klassisk blevet undersøgt in vivo i dyremodeller, der viser karakteristiske mønstre for cellemigration. Men in vivo modeller har flere begrænsninger, herunder intercellulære mæglere, der er vanskelige at få adgang til og analysere, samt den manglende evne til direkte at analysere menneskelige neutrofiler. På grund af disse begrænsninger er der behov for en in vitro-platform, der studerer sværmer med menneskelige neutrofiler og giver nem adgang til de molekylære signaler, der genereres under sværmer. Her, en multistep mikrostamping proces bruges til at generere en biopartikel mikroarray, der stimulerer sværmer ved at efterligne en in vivo infektion. Biopartikelmikrosystemet får neutrofiler til at sværme på en kontrolleret og stabil måde. På mikroarray, neutrofiler stigning i hastighed og danne stabile sværme omkring biopartikel klynger. Derudover blev supernatant genereret af neutrophils analyseret og 16 proteiner blev opdaget at være blevet differentieret udtrykt i løbet af sværmer. Denne in vitro sværmer platform letter direkte analyse af neutrofile migration og protein frigivelse på en reproducerbar, rumligt kontrolleret måde.

Introduction

Neutrophils, den mest rigelige hvide blodlegemer i blodbanen1,får opmærksomhed som potentielle diagnostiske og terapeutiske mål2,3 fordi de kan være involveret i en række medicinske tilstande, herunder gigt4,sepsis3,traumer5,6,kræft1,7,8, og forskellige autoimmune sygdomme5,9. Neutrofil sværmer er en flertrins, stramt reguleret proces med en kompleksitet, der gør det til et særligt interessant fokus for studie5,10,11. Under sværmer, neutrofiler isolere et sted af betændelse fra det omgivende sunde væv5,10,11. Korrekt regulering af neutrofil sværmer er afgørende for at fremme sårheling og i sidste ende inflammation opløsning5,12. Neutrophil sværmer er primært blevet undersøgt in vivo i gnaver12,13,14,15 og zebrafisk10,11,12,15 modeller. Arten af disse in vivo dyremodeller giver imidlertid anledning til begrænsninger5. For eksempel er de mæglere udgivet af neutrofiler under sværmer ikke let tilgængelige for analyse5. Derudover er der mange potentielle kilder til en given mægler in vivo, så en in vivo eksperiment skal indføre en genetisk mangel for at hæmme cellulære produktion og / eller interaktion med henblik på at undersøge den rolle, som mægler i en given proces13. Et in vitro-eksperiment omgår denne komplikation ved at muliggøre neutrofilobservation uden yderligere cellers kontekst. Derudover er forskning, der beskriver menneskelig neutrofil koordineret migration begrænset16. På en in vitro sværmer platform, menneskelige neutrofiler kan analyseres direkte. En in vitro sværmer platform kunne udvide den viden, der opnås fra in vivo undersøgelser ved at give muligheder for at udfylde de huller efterladt af begrænsningerne i in vivo undersøgelser.

For at imødekomme behovet for en in vitro-platform, der efterligner in vivo neutrophil sværmer, udviklede vi en mikrostamping platform, der gør det muligt for os at mønstre biopartikel mikroarrays, der stimulerer neutrofil sværmer på en rumligt kontrolleret måde. Vi genererer biopartikelmikroarrays på glasdias i en to-trins proces. For det første bruger vi microstamping til at generere en mikroarray af kationiske polyelektrolyt (CP) pletter. For det andet tilføjer vi en opløsning af biopartikler, der klæber til CP-pletterne via elektrostatisk interaktion. Ved først at mønstre CP lag, kan vi selektivt mønster negativt ladede biopartikler til at generere den ønskede neutrofile sværmer mønster. Det positivt ladede lag holder de negativt ladede biopartikler gennem det kraftige vasketrin, der fjerner biopartiklerne fra områderne på glasslidsen, der ikke har CP. Desuden er cp'en, der anvendes her, en copolymer af acrylamid og kvatisk kationisk monomer, biokompatibel, så det fremkalder ikke et svar fra neutrofile. Det har en meget høj overflade afgift, der immobiliserer mikron-størrelse biopartikler til glasset dias, hvilket hæmmer neutrofiler fra at fjerne partiklerfra den mønstrede position på glasset dias. Dette resulterer i biopartikelklynger arrangeret i et mikroarray. Da vi tilføjede neutrofiler til mikroarrayet, dannede de stabile sværme omkring biopartikelklyngerne. Gennem sporing neutrofile migration, fandt vi, at sværmer neutrofiler aktivt migrere mod biopartikel klynger. Desuden brugte vi denne platform til at analysere visse mæglere, at neutrofiler frigivelse under sværmer. Vi fandt 16 mæglere, der er forskelligt udtrykt under sværmer. Deres koncentrationer følger tre generelle tendenser over tid: stigning, fald, eller spike. Vores in vitro neutrofile sværmer platform letter analysen af rumligt kontrolleret human neutrofil sværmer, samt indsamling og analyse af mæglere udgivet af neutrofil sværmer. I en tidligere publikation, viste vi, at patienter med visse medicinske tilstande (traumer, autoimmunsygdom, og sepsis), havde neutrofiler, der fungerede anderledes end dem fra raske donorer5. I fremtidige forskningsundersøgelser, vores platform kunne bruges til at analysere neutrofile funktion blandt en række patientpopulationer. Denne platform kan kvantitativt analysere den komplekse koordinering, der er involveret i neutrofil sværmer. Yderligere undersøgelser kan gøres for at give indsigt i neutrofil funktionen af en bestemt patientpopulation eller neutrofile reaktion på et patogen af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forfatterne anerkender de raske frivillige, der venligt doneret deres blod. Blodprøver blev opnået efter informeret frivilligt samtykke i henhold til institutionelle review board (IRB) protokol #2018H0268 gennemgået af Biomedical Sciences Committee på The Ohio State University.

1. Mikrofabrikation af biopartikelmikroarray

  1. Ved hjælp af standard fotolithografi procedurer, generere master silicium wafer.
    1. Generer et bevis på det ønskede design ved hjælp af en CAD-software (computeraided design), og send derefter til en fotomaskeproducent for at producere en kromfotomaske. Det design, der anvendes her, er 4 mm x 4 mm rektangulære arrays med en diameter på 30 μm fyldt i cirkler med en 150 μm center-to-center afstand. Dette design kan ændres efter ønske til forskellige applikationer.
    2. Spincoat et 40 μm tykt lag af en negativ fotoresist på en silicium wafer. Waferen bages ved 65 °C i 5 min og 95 °C i 10 min.
    3. Udsæt wafer en UV-lys gennem en krom fotomaske med 150-160 mJ/cm2 (Figur 1A).
    4. Kafkanten bages ved 65 °C i 5 min og 95 °C i 10 min. Nedsænk waferen i fotoresistudvikleren i 10 minutter og skylles med isopropylalkohol. På dette stadium skal mønsteret være synligt på waferen (figur 1B).
  2. Bland et 10:1-forhold mellem polydimethylsiloxanprepolymer og dets hærdningsmiddel (dvs. 20 g prepolymer og 2 g hærdningsmiddel) og hæld den uhærdede polydimethylsiloxanblanding (PDMS) over masterwaferen i en petriskål (figur 1C).
  3. Vakuum behandle den uhærdede PDMS blandingen, indtil ingen luftbobler er til stede over master wafer. Hærd ved 65 °C natten over.
  4. Brug en skalpel til at skære rundt i ydersiden af den mønstrede del af waferen, og fjern langsomt den hærdede PDMS plade. Anbring PDMS-pladen på et rent skærebræt med den mønstrede side opad (figur 1D).
  5. Punch ud individuelle frimærker fra PDMS plade med en 8 mm biopsi punch(Figur 1E). For et glas dias, vil der være behov for otte frimærker.
  6. Placer hvert stempel med forsiden nedad på klæbebåndet for at fjerne snavs.
  7. På forhånd skal der fremstilles en 1,6 mg/ml opløsning af CP i vand.
    1. Tilsæt den korrekte mængde CP-pulver til vand (f.eks. 0,8 g til 500 ml).
    2. Bland på en røreplade ved stuetemperatur natten over, eller indtil alt det faste stof er opløst i vandet. CP-opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur i 6 måneder.
    3. Hvis det ønskes, skal CP-opløsningen fluorescerende ved at tilsætte poly-L-lysin mærket med fluorescein isothiocyanat (PLL-FITC).
      1. Aliquot omkring 10 ml af CP-løsningen. Tilføj en lille mængde PLL-FITC (0,05 mg) til den aliciterede volumen. Mængden kan ændres for at justere lysstyrken af fluorescens som ønsket.
      2. Vortex CP-opløsningen mærket med FITC i 20 s, eller indtil opløsningen er en ensartet, lysegul farve. Beskyt mod lys og opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
  8. Med frimærkerne med forsiden af, prime hvert stempel med 100 μL af 1,6 mg/ml opløsning af CP, hvilket sikrer ingen luftbobler form mellem CP løsning og stempel (Figur 1F).
  9. Inverter stemplerne på et lag CP-opløsning (Figur 1G).
  10. Fjern stemplerne fra CP-opløsningen efter 1 time.
  11. Dup hvert vådt stempel med forsiden nedad på en ren glasrutsjebane 6-8x for at fjerne overskydende væske.
  12. Vakuum behandle frimærker ne i 1-2 min.
  13. Følg en otte brønd, 9 mm diameter imaging spacer på toppen af en ren glas dias som en guide til stempel placering. Med denne afstandsafstand kan hvert glasdias have otte mikroarrays.
  14. Placer et stempel med forsiden nedad på glasdiaset i midten af hver brønd af billedbilledet spacer (dvs. bruge otte frimærker i alt).
  15. Der anbringes en vægt på 5,6 ± 0,1 g oven på hvert stempel, og der kan være 10 min til stempling (figur 1H). En afbalanceret vægt er nødvendig for at sikre, at stemplet trykkes jævnt på glasslidet og fremme jævn overførsel af CP til glasdiaset.
  16. Vægten og stemplerne fjernes fra glassliden (figur 1I). Lad CP-laget tørre ved stuetemperatur i 24 timer, før biopartiklerne tilføjes, som beskrevet i trin 1.17. Hvis CP'en er mærket med FITC, kan stemplingens effektivitet kontrolleres på dette tidspunkt med et fluorescerende mikroskop ved 488 nm, før du fortsætter til trin 1.17 (Figur 1M).
  17. Skær en tom PDMS plade til størrelsen af billeddannelse afstandsafstand og bruge 8 mm biopsi punch til at skabe brønde i PDMS, der flugter med brøndene i en imaging afstandslinje. Klæbe PDMS-pladen til glassliden med billedafstandsenheden (Figur 1J).
  18. Tø en opløsning af biopartikler (f.eks.
    BEMÆRK: Biopartiklerne behøver ikke at blive opsoniseret. Neutrofile overfladereceptorer genkender molekyler direkte på disse biopartikler19,20,21.
  19. Der tilsættes 100 μL biopartikelopløsning til hver PDMS brønd på glasrutsjebanen (figur 1K).
  20. Rock glaset glide i 30 min.
  21. Skyl brøndene grundigt med vand. Biopartikelmikroarrayet kan opbevares i et støvfrit miljø ved 4 °C i op til 3 måneder. På dette tidspunkt skal mønsteret kontrolleres med et fluorescerende mikroskop ved 594 nm, før det fortsætter til trin 2.1 (figur 1N).

2. Prøveforberedelse

  1. Indsamle mindst 2 ml frisk blod i K2-EDTA rør fra den ønskede donor. Det forventede udbytte af neutrofiler er 1-2 x 106 celler/1 ml fuldblod. Den imaging assay kræver ca 1,5 x 105 neutrofiler, og analysen af supernatant kræver 1 x 106 neutrofiler. Brug blodet inden for 4 timer.
  2. Separate røde blodlegemer (RBC'er) ved at tilføje et erythrocytaggregeringionsmiddel i et 1:5-forhold til fuldblod. Vent 45 minutter for en gennemskinnelig lag (buffy pels) for at adskille fra lag af RBC'er.
  3. Fjern buffy pels og vaskes med fosfat buffered saltvand (PBS) ved hjælp af 1 ml buffy pels: 9 ml PBS.
  4. Centrifugeret i 5 min ved 190 x g og 20 °C.
  5. Aspirere supernatantog resuspenderpellet på 5 x 107 celler / ml.
  6. Brug et negativt immunmagnetisk markeringssæt til at isolere neutrofiler.
    1. Der tilsættes 50 μL antistofcocktail/1 ml celleaffjedring. Vent 10 min.
    2. Der tilsættes 100 μL magnetiske perler/1 ml celleaffjedring. Vent 10 min.
    3. Tilføj celle suspension til en rund-bund rør og sted i en cylindrisk magnet. Vent 10 min.
  7. Hæld supernatant i et centrifugerør. Tilføj op til 10 ml PBS. Centrifugeret i 5 min ved 190 x g og 20 °C.
  8. Aspirate supernatant. Resuspenderhvid pellet i IMDM med 0,4% humanserum albumin.
  9. Pletkerner med 20 μg/ml Hoechst 33342 i 10 min ved 37 °C.
  10. Tilføj 5 ml IMDM med 0,4% humanserum albumin for at skylle. Centrifugeret i 5 min ved 190 x g og 20 °C.
  11. Opslæmingsceller på 7,5 x 105 celler/ml i IMDM med 0,4% humanserum albumin.
  12. Der tilsættes 100 μL af celleaffjedringen til en PDMS-brønd, der indeholder et biopartikelmikroarray. Sørg for, at celleaffjedringen er konveks over toppen af PDMS godt og ikke indeholder bobler.
  13. Tætning med en dækseddel med en diameter på 12 mm. Dæk åbningen af PDMS godt med en 12 mm diameter dæksel. Tryk forsigtigt ned på dæksslip med enpincen, så den overskydende cellesuspension slipper ud på kanten af brønden. Brug et væv til at fjerne overskydende cellesuspension.

3. Kørsel af analyse af analysen og billedet

  1. Load mikropartikel array med celler på levende celle imaging station med et mikroskop udstyret med et bur inkubator indstillet til 37 °C, 5% CO2,og 90% relativ luftfugtighed.
  2. Brug tid-lapse fluorescerende og brightfield mikroskopi til at optage billeder på 10x forstørrelse hver 10 s på 405 nm, 594 nm, og brightfield. I et typisk eksperiment indsamles billeder op til 2 timer.
  3. Brug en automatiseret cellesporingssoftware til at spore de enkelte neutrofilers migration mod biopartikelklyngen.
    1. Brug autoregressionstilstanden for en cellesporingssoftware til registrering af spot. Indstil spotradius til 5 μm (den omtrentlige størrelse af en neutrofilkerne). Indstil minimumsporslængden til 120 s og en maksimal mellemrumsstørrelse på én ramme.
    2. Udtræk de filer, der indeholder neutrofilpositionen og -hastigheden, ud fra de data, der genereres af cellesporingssoftwaren. Disse filer kan bruges med en grafføring software til at generere neutrofile migration spor (Figur 2C) og en varme kort over hastighed vs tid(figur 2D),hhv.
  4. Brug de 405 nm fluorescerende billeder til at spore sværm størrelse over tid på et billede analyse software efter eget valg.
    1. Definer interesseregioner omkring hver biopartikelklynge, hvor neutrofiler vil sværme. Hold samme størrelse ROI at analysere hver biopartikel klynge.
    2. Analysér den gennemsnitlige fluorescerende intensitet af 405 nm billeder inden for hver INVESTERINGSAFI over tid.
    3. Generér en kalibreringskurve med gennemsnitlig fluorescerende intensitet til sværmstørrelse ved at tage manuelle målinger i forskellige sværmstørrelser fra 0 μm2 til den maksimale sværmsstørrelse. Brug denne kalibrering til at beregne sværmens størrelse over tid.

4. Supernatant indsamling og protein detektion

  1. Inkuber neutrofile i brøndene, der indeholder biopartikelmikroarrayet ved 37 °C og 5% CO2 for 3 timer. Udtag prøver på de ønskede tidspunkter. Typisk vil prøverne blive udtaget på 0, 0,5, 1 og 3 h. For at overvinde grænsen for påvisning af proteinarrayassayen blev hele mængden af supernatant af en enkelt brønd (200 μL) anvendt for hvert tidspunkt. Hvert tidspunkt blev analyseret i treeksemplarer.
  2. Ved hjælp af en brightfield mikroskop, kontrollere, at sværme er dannet på microarray.
  3. Aspirere supernatantet med en 200 μL pipette og belastning i et 0,45 μm centrifugefilterrør.
  4. Supernatantet centrifugeres ved 190 x g og 20 °C i 5 minutter, og det filterede volumen opsamles.
  5. Prøverne opbevares ved -80 °C indtil behandlingstiden.
  6. Brug et microarray-sæt, der registrerer en række humane proteiner til at behandle prøver.
    1. Der tilsættes 200 μL af hver prøve til et separat dialyserør, der følger med sættet.
    2. Dialyserørene anbringes i et bægerglas indeholdende mindst 500 ml PBS (pH = 8.0). Rør forsigtigt på en rørplade i mindst 3 timer ved 4 °C. Skift PBS i bægeret, og gentag dette trin.
    3. Hver prøve overføres til et rent centrifugerør og centrifuger ved 9.000 x g i 5 minutter for at fjerne eventuelle bundfald. Overfør hvert supernatant til et rent rør.
    4. Biotinylate hver prøve ved at tilsætte 36 μL 1x mærkningsreagens fra sættet pr. 1 mg samlet protein i den dialyzerede prøve til 180 μL dialyzed prøve. Inkuber ved 20 °C i 30 min. Bland forsigtigt hver 5 min.
    5. Der tilsættes 3 μL stopopløsning, der følger med sættet, i hvert prøverør. Overfør hver prøve til et frisk dialyserør, og gentag trin 4.6.2-4.6.3. På dette stadium kan prøven opbevares ved -20 °C eller -80 °C, indtil du er klar til at fortsætte.
    6. Glassliden med sættet opbevares ved -20 °C. Lad det komme til stuetemperatur. Placer det samlede glasskub i en laminarflowhætte i 1-2 timer ved stuetemperatur.
    7. Der tilsættes 400 μL af den blokerende buffer, der følger med sættet, i hver brønd af det samlede glasdias. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
    8. Centrifugerede prøver i 5 min ved 9.000 x g for at fjerne bundfald eller partikler. Fortyndes 5x med blokeringsbuffer.
    9. Fjern blokeringsbufferen fra hver brønd. Der tilsættes 400 μL af de fortyndede prøver i de relevante brønde. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur under vuggen.
    10. Dekanter prøverne fra hver brønd. Vask 3x med 800 μL af 1x vaske buffer jeg forsynet med sættet ved stuetemperatur i 5 min hver, mens vuggende.
    11. I en ren beholder, nedsænkes det samlede glasdias i 1x vaskebuffer I. Vask 2x ved stuetemperatur i 5 min hver, mens rokkende.
    12. Der tilsættes 400 μL 1x Cy3-konjugeret streptavidin til hvert undersystem. Dæk med plastklæbestrimler. Beskyt mod lys i resten af protokollen.
    13. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur under vuggen.
    14. Opløsningen kan afmonteres, og glassliden skilles fra prøvekamrene.
    15. I 30 ml centrifuge rør forsynet med sættet, omhyggeligt tilføje glas dias og nok 1x vask buffer jeg til at dække glas dias. Vask 3x i 10 minutter hver ved stuetemperatur under vuggen.
    16. I 30 ml centrifugerøret vaskes 2x med 1x vaskebuffer II i 5 minutter hver ved stuetemperatur under vuggen.
    17. Glassliden vaskes med 30 ml ddH2O i 5 min. Tag glassliden ud af centrifugerøret, og lad det tørre i 20 minutter i en laminarflowhætte. Det forberedte glasslid kan opbevares ved -20 °C, indtil den er klar til scanning.
    18. Scan glasrutsjebanen med en mikroarrayscanner ved en fluorescensemission på 555 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når neutrofiler føjes til biopartikelmikroarrayet, aktiveres neutrofiler, der kontakter biopartikelklyngerne, og indleder den sværmende respons. Biopartikelmikroarrayet blev valideret ved hjælp af fluorescerende mikromikroskopi for timelapse for at spore neutrofile migration mod biopartikelklyngerne (Video S1). Migrationen af individuelle neutrofile kerner spores, når de vandrer mod biopartikelklyngen. Når neutrofiler når biopartikelklyngen, overlapper deres kerner med andre kerner i klyngen. Det er således ikke muligt præcist at spore en neutrofil i klyngen ved hjælp af denne metode. Zymosan og E. coli biopartikel klynger begge resultere i dannelsen af neutrofile sværme. For vores resultater bruger figur 2B data fra neutrofile sværme genereret af E. coli partikler. Figur 3 og de andre paneler i figur 2 anvender neutrofile sværme genereret af zymosanpartikler. De opnåede resultater viser, at biopartikelklynger stimulerer neutrofilaktivering, da en neutrofil kontaktede klyngen, hvilket i sidste ende førte til dannelsen af stabile neutrofile sværme omkring hver klynge efter 30-60 min (figur 2A, top). I modsætning hertil viste neutrofiler ikke kollektiv migration i mangel af biopartikelklynger (figur 2A,bund og video S2). Ved hjælp af fluorescerende intensitet af farvede neutrofile kerner ved 405 nm blev den gennemsnitlige neutrofile sværmstørrelse omkring 30 μm diameter E. coli biopartikelklynger fundet at være 1.490 ± 680 μm2 (gennemsnitlig ± SD, figur 2B, top). Fluorescensintensiteten for en given interesseregion, hvor der ikke findes biopartikelklynger, var omtrent konstant over tid, hvilket bekræftede, at der ikke fandtes kollektiv migration i denne indstilling (figur 2B, nederst). Spor af neutrofil migration viser, at neutrofiler konvergerede på en biopartikel klynge, når man var til stede (Figur 2C, top). Omvendt blev der ikke konstateret konvergens i kontrolsystemet(figur 2C, nederst). Hastigheden (tilbagelagt distance/tidspunkt) for sværmer og ikke-aktiverede neutrofiler blev målt, og der blev fundet en statistisk signifikant forskel i hastighedsfordelingerne (ANOVA, p < 0,0001), som vist i figur 2D. Gennemsnitshastigheden for sværmer neutrofiler var 20,6 ± 13,0 μm/min (gennemsnitlig ± SD), og gennemsnitshastigheden for kontrolneutrofiler var 2,0 ± 2,2 μm/min.

Desuden blev koncentrationen af 16 proteiner, som neutrofiler, der blev frigivet under sværmer, analyseret (figur 3). Den normaliserede koncentration af hvert protein på forskellige tidspunkter i sværmende proces (t = 0, 0,5, 1 og 3 h) blev beregnet, hvor den normaliserede koncentration er (C - Cmin) / (Cmax - Cmin). 10 proteiner steg i koncentration under hele sværmer. Disse proteiner var adipsin, galectin-3, GROa, IL-6R, MIP-1a, MMP-8, MMP-9, Nidogen-1, TIMP-1 og TLR2. To proteiner (pentraxin 3 og RANK) faldt i koncentration under hele sværmer. De resterende fire proteiner (clusterin, PF4, RANTES og Trappin-2) steg i løbet af den første time af sværmer, men faldt derefter. Med andre ord, koncentrationerne af disse proteiner "spiked" under sværmer. Af de 16 identificerede proteiner blev 12 proteiner identificeret i vores tidligere publikation5. Adipsin, galectin-3, nidogen-1, pentraxin 3, TIMP-1, og TLR2 blev vist sig at være sværmer-specifikke, mens clusterin, IL-6R, MMP-8, og MMP-9, RANK, og trappin-2 var ikke5.

Figure 1
Figur 1: Produktion af mikroarray af biopartikel. En silicium wafer belagt med negative fotoresist er udsat for UV-lys gennem en krom fotomaske (A). Når siliciumwaferen er bagt og udviklet, forbliver der et fotoresistmønster på overfladen af siliciumwaferen. Dette er mesterwaferen (B). I en petriskål tilsættes en PDMS-blanding til toppen af mesterwaferen. PDMS hærdes natten over ved 65 °C for at danne PDMS-formen (C). PDMS formen er skåret fra master wafer og en biopsi punch bruges til at punch ud individuelle PDMS frimærker(D). Et PDMS-stempel (E) er belagt med CP-opløsning (F). Stemplet vendes ind på et tyndt lag CP-opløsning (G). Efter at have inkuberet cp-opløsningen i 1 time, svælges stemplet på et glasdias for at fjerne overskydende CP. Otte frimærker trykkes derefter på et rent glasdias med en vægt på 5,6 ± 0,1 g, justeret med en billeddannelsesafstand (H). Når stemplet fjernes, forbliver der et CP-mønster (I). En PDMS plade med forskårne brønde klæbes til glasdiaset (J). Derefter tilsættes en biopartikelopløsning over CP-mønsteret (K). De negativt ladede biopartikler binder sig til den positivt ladede polyelektrolyt via elektrostatisk interaktion. Den overskydende biopartikelopløsning vaskes væk, hvilket efterlader biopartikler, der er mønstret oven på CP-mønsteret (L). (M) Fluorescerende billede af CP-laget mærket med FITC (Skalastænger = 50 μm, stort billede; Skalastang = 25 μm, indsat). (N) Fluorescerende billede af mønstrede zymosan biopartikler konjugeret med Texas Red (Skala bar = 100 μm, stort billede; Skalabar = 50 μm, indsat). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Neutrofil sværmvækst omkring biopartikelklynger. I nærvær af biopartikelklynger gennemgår neutrofiler kollektiv migration mod biopartikelklyngerne (bund,kontrol neutrofiler). Når der ikke er biopartikler til stede, udfører neutrofile ikke kollektiv migration. (A) I nærvær af zymosan biopartikel klynger, neutrofiler danner sværme i 30 min. Uden biopartikelklynger dannes der ingen sværme (Skalastænger = 50 μm). B) Neutrofile sværme vokser til en gennemsnitlig størrelse på 1.490 ± 680 μm2 (gennemsnitlig ± SD) omkring 30 μm diameter E. coli biopartikelklynger. Kontrol neutrofiler udviser en konstant tæthed, der svarer til ingen sværm vækst (ANOVA, p < 0,0001, n = 32 neutrofile sværme, N = 1 donor, fejl barer = standard afvigelse). (C) Spor af sværmer neutrofiler konvergerer på zymosan biopartikel klynger, mens kontrol neutrofiler viser ingen konvergerende punkt (Skala barer = 50 μm). D) Neutrofile, der sværmer mod et zymosanmål, har en gennemsnitshastighed på 20,6 ± 13,0 μm/min (middelværdi ± SD), mens kontrolneutrofiler har en gennemsnitshastighed på 2,0 ± 2,2 μm/min. Hver regne med varmekortet repræsenterer en neutrofil med den givne øjeblikkelige hastighed på det givne tidspunkt. Disse varmekort er repræsentative for et eksperiment (n = 1 sværm; N = 1 donor ANOVA, 6.114 = sværmer neutrofiler, 32.116 = kontrol neutrofiler, p < 0,0001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Frie mæglere frigivet af sværmer neutrophils. Neutrofil sværmer påvirker produktionen af forskellige proteiner over tid. Proteinkoncentrationen blev målt til 0, 0,5, 1 og 3 timer. Datapunkterne var udstyret med udjævningsplines (λ = 0,05). Disse proteiner har tendens til at følge en af tre karakteristiske tendenser: faldende over tid, stigende over tid, eller spiking omkring 1 time og derefter faldende (Fejl barer = standard afvigelse; n = 3 replikater; N = 1 donor). Klik her for at se en større version af denne figur.

Video S1: Neutrofil sværmer mod zymosan biopartikel klynger. Neutrophil nuclei er vist med blåt. Zymosan mål er markeret med røde cirkler (Skala bar = 50 μm; oprindelige erhvervelse tid = 60 min). Klik her for at downloade denne video.

Video S2: Ikke-aktiveret neutrofil tilfældig migration. Neutrophil nuclei er vist med blåt (Skala bar = 50 μm; original erhvervelse tid = 60 min). Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi udviklede en mikrostamping platform til at generere ensartede arrays af biopartikler til at stimulere in vitro neutrophil sværmer. In vitro karakter af vores platform giver os mulighed for at omgå de komplikationer, der opstår med in vivo sværmer eksperimenter, nemlig den dårlige evne til at analysere mæglere frigivet af sværmer neutrophils5. Derudover udføres in vivo-modeller typisk i gnavere11,12,13,15,22,23eller zebrafisk11,12,15,23. Vores platform bruger menneskelige neutrofiler, som gør det muligt for os at mere direkte fortolke vores resultater i forbindelse med sygdomme hos mennesker, selv om visse ligheder mellem mus og menneskelige neutrofiler er blevet observeret5,11. Derudover opretholder vi et rumligt kontrolleret sværmet miljø, der adskiller vores platform fra in vivo modeller ved at give en høj grad af reproducerbarhed, der letter analysen af menneskelige neutrofile kollektiv migration samt indsamling og analyse af mæglere frigivet af sværmer neutrofiler.

Under udviklingen af vores mikrostamping protokol opstod der flere udfordringer, der krævede omhyggelig fejlfinding. For det første er den CP, der anvendes til mikrostamping, meget hydrofile, og PDMS frimærkerer er hydrofobiske. Fordi CP ikke har en høj affinitet for PDMS, vores procedure var omhyggeligt designet til at undgå dannelsen af bobler og fremme befugtning. Ved først at priming stemplet med CP, mens face-up (trin 1,8), minimerer vi dannelsen af bobler mellem CP og stempel. Stemplet omvendes derefter på et lag CP og inkuberes i 1 time. Denne lange inkubationstid sikrer, at alle dele af stemplet er våd. For det andet kan processen med at fjerne overskydende CP før stempling på en ren glasslide (trin 1.11) være inkonsekvent. Under udførelsen trin 1.11 skal stemplet undersøges nøje. Når mønsteret begynder at blive synligt, er stemplet klar til trin 1.12. Derudover kan den nødvendige vakuumtid til at tørre frimærkerne (trin 1.12) variere. Dette er primært afhængig af vejret. På en varm, fugtig dag kræves der 2 min vakuumtid. På en kølig, tør dag er 1 min vakuumtid tilstrækkelig.

Vi har vist, at neutrofiler fra raske donorer danner stabile sværme omkring biopartikelklynger. Med time-lapse fluorescerende mikroskopi, kan vi kvantificere sværm størrelse og spore neutrofile migration, som gør det muligt for os at analysere neutrofile kemotaxis kvantitativt5. Vi har f.eks. cosininen af vinklen mellem neutrofilhastighedsvektoren og positionsvektoren mellem neutrofil og den nærmeste biopartikelklynge), hastighed (afstand neutrofilrejserdivideret efter tid), radial hastighed (hastigheden ganget med CI) og den samlede tilbagelagte afstand (forskellen mellem indledende og endelige neutrofile position) af individuelle migrerende neutrofiler5. I modsætning til de fleste in vitro-studier24,25,26, har vores platform ikke en kunstig kemotaktisk gradient, så neutrophil intercellulær kommunikation er den eneste drivkraft for neutrofile migration. Derudover supernatant genereret af sværmer neutrophils er let tilgængelige. Vi kan indsamle og analysere supernatantfor intercellulære mæglere udgivet af neutrofiler uden indblanding fra andre celletyper, der er til stede in vivo. 16 proteiner blev observeret, hvis udtryk under sværmer kunne beskrives som en af tre tendenser: stigning (10 proteiner), fald (to proteiner) og spike (fire proteiner). Seks af disse proteiner bekræftede tidligere rapporterede tendenser under sværmer over tid5. Nogle af de identificerede proteiner blev tidligere vist sig at være sværmer-specifikke, mens andre blev udtrykt forskelligt ved aktiverede ikke-sværmer neutrofiler5. Proteiner, der stiger i koncentration over tid, er sandsynligvis forbundet med pro-inflammation respons. Nogle af de proteiner, der stiger i koncentration over tid, er allerede kendt for at være involveret i det proinflammatoriske respons (f.eks. galectin-3 og MMP-9)27,28. Forholdet mellem andre proteiner og betændelse er mindre godt forstået. De proteiner, spike eller falde under sværmer kan være involveret i reguleringen af inflammation. Men yderligere forskning er nødvendig for at forstå den rolle i inflammation af mange af de proteiner, der er differentieret udtrykt under sværmer. Analysere frigivet mæglere sammen med neutrofile migration kan hjælpe os med bedre at forstå det komplekse billede af betændelse, og hvordan neutrofiler påvirke det omgivende væv under sværmer.

I fremtidige undersøgelser kan vores platform bruges til grundigt at undersøge usunde neutrofilers evne til at generere stabile sværme omkring mønstrede biopartikelklynger. Forskellige medicinske tilstande har været relateret til neutrofiler, herunder sepsis3, traumer6, og kræft1,8,17,18, hvilket tyder neutrofiler hos disse patienter kan have ændret funktion. Denne platform kan bruges til at undersøge forskelle mellem de intercellulære mæglere frigivet af sunde og usunde neutrofiler. Derudover kan denne platform ændres til mønster levende mikrober og bruges til at analysere neutrofile reaktion på levende mikrober in vitro.

Afslutningsvis har vi udviklet en ny platform til analyse af neutrofil sværmer in vitro. Den stærkt kontrollerede karakter af vores platform giver os mulighed for at afbøde problemer, der opstår under in vivo neutrophil sværmer eksperimenter. Neutrofil sværmer på en biopartikel mikroarray er let kvantificerbar via time-lapse fluorescerende mikroskopi. Derudover kan vi indsamle mæglere frigivet af neutrofiler uden indblanding fra andre væv, der er til stede in vivo. Denne platform kan bruges i fremtidig forskning til at kvantificere forskelle mellem migration adfærd neutrofiler fra sunde og usunde donorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af finansiering fra William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering og Comprehensive Cancer Center på The Ohio State University. Data præsenteret i denne rapport kom fra billeder behandlet ved hjælp af Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) tilgængelige på Campus Mikroskopi og Imaging Facility, The Ohio State University. Denne facilitet støttes til dels ved tilskud P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18001 Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator Okolab 777057437 / 77057343 Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit STEMCELL Technologies 17957 Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2 Nikon Instruments MEA54010 / MEF55037 Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch Sigma Aldrich Z708925 To cut PDMS stamps
HetaSep STEMCELL Technologies 7906 Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array Raybiotech Inc. AAH-BLG-1000-4 High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA) Sigma Aldrich A5843 Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053 To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes Thermo Fisher Scientific 02-657-32 Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask Front Range Photomask N/A Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner Perkin Elmer ASCNGX00 Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris Bitplane 9.3.0 Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package Nikon Instruments MQS31100 Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) Sigma Aldrich P3069-10MG 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer Grace Bio-Labs 654008 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer University Wafer 590 Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater Laurell WS-650MZ-23NPPB Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025 MicroChem 2025 Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer MicroChem Y020100 Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) Dow 1673921 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System Kloé UV-KUB 2 Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water Thermo Fisher Scientific A1287303 High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185 BASF 8185 Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen Z2843 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
  2. Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
  3. Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
  4. Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
  5. Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
  6. Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
  7. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
  8. Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
  9. Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
  10. Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
  11. Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
  12. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  13. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  15. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  16. Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
  17. Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
  18. Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
  19. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
  20. Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
  21. Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
  22. Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
  23. Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
  24. Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
  25. Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
  26. Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
  27. Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
  28. Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).

Tags

Bioengineering microarray microstamping cellemigration neutrofil sværmer proteiner
Biopartikel mikroarrays til kemotaktisk og molekylær analyse af human neutrofil sværmer in vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walters, N., Reátegui, E.More

Walters, N., Reátegui, E. Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro. J. Vis. Exp. (156), e60544, doi:10.3791/60544 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter