Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri

Published: February 16, 2020 doi: 10.3791/60544

Summary

Bu protokol, mekansal olarak kontrol edilen nötrofil sürüsü sağlayan biyopartikül mikrodizileri üretir. Nötrofillerin göç sırasında serbest bırakıldığı arabuluculara kolay erişim sağlar ve nicel görüntüleme analizine olanak sağlar.

Abstract

Nötrofil sürüsü, nötrofillerin enfeksiyon bölgesini mühürlediği ve doku ların yeniden yapılandırıştırışını teşvik ettiği işbirliğine dayalı bir süreçtir. Swarming klasik hücre göç karakteristik desenleri gösteren hayvan modellerinde in vivo incelenmiştir. Ancak, in vivo modelleri erişim ve analiz zor hücreler arası arabulucuları da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar var, yanı sıra doğrudan insan nötrofiller analiz etmek için yetersizlik. Bu sınırlamalar nedeniyle, insan nötrofilleri ile dolu çalışmalar ve swarming sırasında üretilen moleküler sinyallere kolay erişim sağlayan bir in vitro platform için bir ihtiyaç vardır. Burada, çok aşamalı bir mikrodamgalama işlemi in vivo enfeksiyon taklit ederek sürü uyarır bir biyopartikül mikrodizi oluşturmak için kullanılır. Biyopartikül mikrodizi nötrofillerin kontrollü ve istikrarlı bir şekilde akın etmesini sağlar. Mikrodizide nötrofiller hızlarını arttırır ve biyopartikül kümelerinin etrafında kararlı sürüler oluştururlar. Ayrıca nötrofiller tarafından üretilen süpernatant analiz edildi ve 16 proteinin sürü boyunca farklı olarak ifade edildiği keşfedildi. Bu in vitro swarming platformu tekrarlanabilir, mekansal kontrollü bir şekilde nötrofil göçü ve protein salınımı doğrudan analizini kolaylaştırır.

Introduction

Nötrofiller, kan dolaşımında en bol beyaz kan hücresi1, potansiyel tanı ve tedavi hedefleri olarak dikkat kazanıyor2,3 gut dahil olmak üzere tıbbi koşulların çeşitli dahil olabilir çünkü4, sepsis3, travma5,6, kanser1,7,8, ve çeşitli otoimmün hastalıklar5,9. Nötrofil sürüsü çok aşamalı, sıkı bir süreç çalışma5,10,11özellikle ilginç bir odak yapan bir karmaşıklık ile düzenlenmiştir. Swarming sırasında, nötrofiller çevreleyen sağlıklı doku5,10,11inflamasyon bir site izole . Nötrofil swarming uygun düzenleme yara iyileşmesi ve sonuçta inflamasyon çözünürlükteşviketmek esastır5 ,12. Nötrofil sürüsü öncelikle kemirgen12, 13,14,15 ve zebra balığı10,11,12,15 modellerinde in vivo incelenmiştir. Ancak, bu in vivo hayvan modellerinin doğası sınırlamalar doğuracak5. Örneğin, swarming sırasında nötrofiller tarafından yayımlanan arabulucuları analiz5için kolayca erişilebilir değildir. Ayrıca, vivo belirli bir arabulucu için birçok potansiyel kaynaklar vardır, bu nedenle bir in vivo deney belirli bir süreç içinde bu arabulucu rolünü araştırmak için hücresel üretim ve / veya etkileşimi inhibe etmek için genetik bir eksiklik tanıtmak gerekir13. Bir in vitro deney ek hücreler bağlamı olmadan nötrofil gözlem sağlayarak bu komplikasyonu atlatır. Ayrıca, insan nötrofil koordine göç açıklayan araştırma sınırlıdır16. Bir in vitro swarming platformunda, insan nötrofiller doğrudan analiz edilebilir. In vitro swarming platformu in vivo çalışmaların sınırlamaları tarafından bırakılan boşlukları doldurmak için fırsatlar sağlayarak in vivo çalışmalardan elde edilen bilgi üzerine genişletebilir.

In vivo nötrofil sürüsünün imi olan bir in vitro platformihtiyacını gidermek için, nötrofil insidansını mekansal olarak kontrol edilen bir şekilde uyaran biyopartikül mikrodizimlerini desenlememizi sağlayan bir mikrodamgalama platformu geliştirdik. İki aşamalı bir süreçte cam slaytlarda biyopartikül mikrodizileri üretiyoruz. İlk olarak, katyonik polielektrolit (CP) noktalar bir mikrodizi oluşturmak için mikrodamgalama kullanın. İkinci olarak, elektrostatik etkileşim yoluyla CP noktalarına yapışan biyopartiküllerin bir çözeltisi ekliyoruz. Cp tabakasını ilk desenlendirerek, negatif yüklü biyopartikülleri istenilen nötrofil swarming deseni oluşturmak için seçici olarak desenleyebiliriz. Pozitif yüklü tabaka CP yok cam slayt alanlarından biyopartikülleri kaldırır güçlü yıkama adımı ile negatif yüklü biyopartiküller tutar. Ayrıca, CP burada kullanılan, akrilamid ve kuaternif katyonik monomer bir kopolimer, biyouyumlu, bu yüzden nötrofiller bir yanıt neden olmaz. Mikron büyüklüğündeki biyopartikülleri cam kaydırağa immobilize eden çok yüksek bir yüzey yüküne sahiptir, böylece nötrofillerin cam kaydıraktan parçacıkları çıkarmalarını engeller. Bu da mikrodizi halinde düzenlenmiş biyopartikül kümeleri ile sonuçlanır. Nötrofilleri mikrodiziye eklediğimizde, biyopartikül kümelerinin etrafında kararlı sürüler oluşturdular. Nötrofil göçlerini takip ederek, kalabalık nötrofillerin aktif olarak biyopartikül kümelerine doğru göç ettiğini bulduk. Ayrıca, bu platformu nötrofillerin sürü sırasında serbest bırakan bazı aracıları analiz etmek için kullandık. Swarming sırasında farklı bir şekilde ifade edilen 16 arabulucu bulduk. Konsantrasyonları zaman içinde üç genel eğilimleri takip: artış, azalma veya başak. İn vitro nötrofil swarming platformumuz, nötrofil swarming tarafından salınan arabulucuların toplanması ve analizinin yanı sıra mekansal olarak kontrol edilen insan nötrofil sürülerinin analizini de kolaylaştırır. Bir önceki yayında, belirli tıbbi durumları olan hastaların (travma, otoimmün hastalık ve sepsis) sağlıklı donörlerden farklı işlev gören nötrofiller olduğunu gösterdik5. Gelecekteki araştırmalarda, platformumuz çeşitli hasta popülasyonları arasında nötrofil fonksiyonunu analiz etmek için kullanılabilir. Bu platform nötrofil sürüsünde yer alan karmaşık koordinasyonu nicel olarak analiz edebilir. Ek çalışmalar belirli bir hasta popülasyonunun nötrofil fonksiyonu veya ilgi bir patojen nötrofil yanıt hakkında fikir sağlamak için yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Yazarlar, kanlarını bağışlayan sağlıklı gönüllüleri kabul ediyorlar. Kan örnekleri, Ohio State Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Komitesi tarafından incelenen kurumsal inceleme kurulu (IRB) protokolü #2018H0268ne göre gönüllü onayı alındıktan sonra elde edildi.

1. Biyopartikül mikrodizisinin mikroimalatı

  1. Standart fotolitografi prosedürleri kullanarak, ana silikon gofret oluşturmak.
    1. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak istediğiniz tasarımın bir kanıtı oluşturun, ardından krom fotomaske üretmek için bir fotomaske üreticisine gönderin. Burada kullanılan tasarım, 150 μm merkezden merkeze aralıklı daireler halinde doldurulmuş 30 μm çapındaki 4 mm x 4 mm dikdörtgen dizidir. Bu tasarım farklı uygulamalar için ististendiği şekilde değiştirilebilir.
    2. Spincoat bir silikon gofret üzerine negatif photoresist 40 μm kalınlığında tabaka. 65 °C'de 5 dk ve 95 °C'de 10 dk pişirin.
    3. 150-160 mJ/cm2 (Şekil 1A)ile krom fotokopi ile UV ışığına gofret maruz.
    4. 65 °C'de 5 dk ve 95 °C'de 10 dakika pişirin. Bu aşamada desen gofret üzerinde görünür olmalıdır (Şekil 1B).
  2. Iyice polidimethylsiloxane prepolimer ve kür ajan (yani, prepolimer 20 g ve kür ajanı 2 g) bir 10:1 oranı karıştırın ve bir Petri kabında ana gofret üzerinde unred polidimetilsiloksen (PDMS) karışımı dökün(Şekil 1C).
  3. Vakum ana gofret üzerinde hiçbir hava kabarcıkları mevcut olana kadar unred PDMS karışımı tedavi. Bir gecede 65 °C'de kür.
  4. Gofret desenli bölümünün dış çevresinde kesmek için bir neşter kullanın ve yavaş yavaş tedavi PDMS levha kaldırın. PDMS levhasını, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir kesme tahtasıüzerine yerleştirin (Şekil 1D).
  5. 8 mm biyopsi zımba(Şekil 1E)ile PDMS levha bireysel pulları dışarı Punch . Bir cam slayt için sekiz pul gerekecektir.
  6. Herhangi bir enkaz kaldırmak için yapıştırıcı bant üzerinde her damga yüz aşağı yerleştirin.
  7. Önceden suda CP'nin 1,6 mg/mL çözeltisini hazırlayın.
    1. Cp tozunun uygun miktarını suya ekleyin (örn. 0,8 g ila 500 mL).
    2. Bir gece oda sıcaklığında bir karıştırma tabağı üzerinde karıştırın, ya da tüm katı suya çözülene kadar. CP çözeltisi oda sıcaklığında 6 ay saklanabilir.
    3. İstenirse, floresan izotiyosiyanat (PLL-FITC) ile etiketlenmiş poli-L-lizin ekleyerek CP çözeltisini floresan yapın.
      1. Cp çözeltisinin yaklaşık 10 mL'si Aliquot. Az miktarda PLL-FITC (0.05 mg) ekleyin. Miktar, floresan parlaklığını istediğiniz gibi ayarlamak için değiştirilebilir.
      2. Girdap 20 s için FITC ile etiketlenmiş CP çözüm, ya da çözüm düzgün, soluk sarı renk olana kadar. Işıktan koruyun ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
  8. Pullar yüz yüze yken, cp çözeltisinin 100 μL'lik 1.6 mg/mL çözeltisi ile her pulu asal, CP çözeltisi ile pul arasında hava kabarcıkları oluşmamasını sağlar(Şekil 1F).
  9. Pulları CP çözeltisinin bir katmanına ters çevirin (Şekil 1G).
  10. 1 saat sonra CP çözeltisinden pulları çıkarın.
  11. Dab her ıslak damga temiz bir cam slayt üzerine yüz aşağı 6-8x aşırı sıvı kaldırmak için.
  12. Vakum 1-2 dakika için pulları tedavi.
  13. Damga yerleştirme için bir kılavuz olarak temiz bir cam slayt üstüne sekiz kuyu, 9 mm çapında görüntüleme spacer yapıştırın. Bu boşlukta, her cam slayt sekiz mikrodizi olabilir.
  14. Görüntüleme boşluk larının her kuyunun ortasına bir pul yüz aşağı yerleştirin (yani, toplam sekiz pul kullanın).
  15. Her damganın üzerine 5,6 ± 0,1 g dengeli ağırlık yerleştirin ve damgalama için 10 dk bekleyin (Şekil 1H). Damganın cam kaydırağa eşit olarak basıldığından emin olmak ve CP'nin cam kaydırağa eşit şekilde aktarılmasını teşvik etmek için dengeli bir ağırlık gereklidir.
  16. Ağırlıkları ve pulları cam kaydıraktan çıkarın (Şekil 1I). Cp tabakasının 1.17 adımda açıklandığı gibi biyopartikülleri eklemeden önce 24 saat oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. CP FITC ile etiketlenirse, 1.17(Şekil 1M)adıma geçmeden önce damgalamanın etkinliği 488 nm'de floresan mikroskopla bu noktada kontrol edilebilir .
  17. Boş bir PDMS levhasını görüntüleme uzaylayıcısı boyutuna kesin ve 8 mm'lik biyopsi yumruğu kullanarak bir görüntüleme uzaylayıcısının kuyularıyla hizalanmış PDMS'lerde kuyular oluşturun. PDMS levhasını görüntüleme boşluklayıcısı ile cam slayta yapıştırın (Şekil 1J).
  18. Biyopartiküllerin çözeltisini (örn. E. coli veya zymosan) eritin ve enjeksiyon için suda 500 μg/mL'ye (WFI) seyreltin.
    NOT: Biyopartiküllerin opsonize edilmesine gerek yoktur. Nötrofil yüzey reseptörleri doğrudan bu biyopartiküller19,20,21molekülleri tanımak .
  19. Cam kaydıraiyi iyi her PDMS için biyopartikül çözeltisi 100 μL ekleyin (Şekil 1K).
  20. 30 dakika boyunca cam slayt rock.
  21. Kuyuları suyla iyice durulayın. Biyopartikül mikrodizi, 4 °C'de tozsuz bir ortamda 3 aya kadar saklanabilir. Bu noktada desen, adım 2.1'e geçmeden önce 594 nm'de floresan mikroskopla kontrol edilmelidir(Şekil 1N).

2. Örnek Hazırlama

  1. İstenilen donörden K2-EDTA tüplerinde en az 2 mL taze kan alın. Nötrofillerin beklenen verimi 1-2 x 106 hücre/1 mL tam kandır. Görüntüleme tahlil yaklaşık 1.5 x 105 nötrofil gerektirir ve supernatant analizi 1 x 106 nötrofil gerektirir. Kanı 4 saat içinde kullan.
  2. Ayrı kırmızı kan hücreleri (RBC) tüm kan için 1:5 oranında bir eritrosit agregasyon ajan ekleyerek. Yarı saydam bir tabaka (buffy coat) için 45 dk bekleyin RBC'lerin katmanından ayrı.
  3. 1 mL buffy kat: 9 mL PBS kullanarak buffy kat çıkarın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  4. 190 x g ve 20 °C'de 5 dk santrifüj.
  5. Supernatant aspire ve 5 x 107 hücreleri / mL pelet resuspend.
  6. Nötrofilleri izole etmek için negatif immünomanyetik seçim kiti kullanın.
    1. 50 μL antikor kokteyli/1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. 10 dk bekleyin.
    2. 100 μL manyetik boncuk/1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. 10 dk bekleyin.
    3. Yuvarlak bir alt tüp ve silindirik mıknatıs yer hücre süspansiyon ekleyin. 10 dk bekleyin.
  7. Bir santrifüj tüp içine supernatant dökün. 10 mL'ye kadar PBS ekleyin. 190 x g ve 20 °C'de 5 dk santrifüj.
  8. Aspire süpernatant. IMDM'de %0.4 insan serum albumini ile beyaz peleti yeniden askıya alın.
  9. 37 °C'de 10 dakika boyunca 20 g/mL Hoechst 33342 ile leke çekirdekleri.
  10. Durulama için % 0.4 insan serum albumini ile 5 mL IMDM ekleyin. 190 x g ve 20 °C'de 5 dk santrifüj.
  11. IMDM'de 7.5 x 105 hücre/mL'deki hücreleri %0.4 insan serum albumini ile yeniden askıya alın.
  12. Bir biyopartikül mikrodizi içeren bir PDMS kuyuya hücre süspansiyon100 μL ekleyin. Hücre süspansiyonunun PDMS'nin üst kısmında ki konveks olduğundan ve herhangi bir kabarcık içermediğinden emin olun.
  13. 12 mm çapında kapaklı sızdırmazlık. PDMS'nin açılmasını 12 mm çapında kapak kaymaile iyice kapatın. Aşırı hücre süspansiyonkuyu kenarına kaçar böylece cımbız ile coverslip üzerine yavaşça bastırın. Aşırı hücre süspansiyon kaldırmak için bir doku kullanın.

3. Tahlil ve görüntü analizinin çalıştırıl

  1. Mikropartikül dizisini canlı hücre görüntüleme istasyonundaki hücrelerle 37 °C, %5 CO2ve %90 bağıl neme ayarlanmış bir kafes kuluçka makinesi ile donatılmış bir mikroskopla yükleyin.
  2. 405 nm, 594 nm ve brightfield'da her 10 s'de 10'luk büyütmede görüntüleri kaydetmek için hızlandırılmış floresan ve parlak alan mikroskobu kullanın. Tipik bir deneyde, görüntüler en fazla 2 saat toplanır.
  3. Tek tek nötrofillerin biyopartikül kümesine geçişini izlemek için otomatik bir hücre izleme yazılımı kullanın.
    1. Nokta algılama hücresi izleme yazılımının otomatik regresyon modunu kullanın. Nokta yarıçapını 5 μm'ye (nötrofil çekirdeğinin yaklaşık boyutu) ayarlayın. Minimum parça uzunluğunu 120 s'ye ve bir karenin maksimum boşluk boyutunu ayarlayın.
    2. Hücre izleme yazılımı tarafından oluşturulan verilerden nötrofil konumu ve hızını içeren dosyaları ayıklayın. Bu dosyalar nötrofil geçiş parçaları(Şekil 2C)ve hız ve zaman(Şekil 2D)bir ısı haritası oluşturmak için bir grafik yazılımı ile kullanılabilir.
  4. Seçtiğiniz bir görüntü analizi yazılımı nda sürü boyutunu zaman içinde izlemek için 405 nm floresan görüntüleri kullanın.
    1. Nötrofillerin akın edeceği her biyopartikül kümesinin etrafındaki ilgi bölgelerini (ROI) tanımlayın. Her biyopartikül kümesini analiz etmek için aynı boyutta yatırım getirisi tutun.
    2. Zaman içinde her yatırım getirisi içindeki 405 nm görüntülerin ortalama floresan yoğunluğunu analiz edin.
    3. 0 μm2'den maksimum sürü boyutuna kadar çeşitli sürü boyutlarında manuel ölçümler yaparak ortalama floresan şiddetinin sürü boyutuna doğru bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Zaman içinde sürü boyutunu hesaplamak için bu kalibrasyonu kullanın.

4. Supernatant toplama ve protein algılama

  1. Biyopartikül mikrodizisini içeren kuyularda nötrofilleri 37 °C ve %5 CO2'de 3 saat kuluçkaya yatırın. İstenilen zaman noktalarından numune alın. Tipik olarak, numuneler 0, 0,5, 1 ve 3 saat olarak alınır. Protein dizisi tsay algılama sınırını aşmak için, tek bir kuyunun (200 μL) süpernatant ının tüm hacmi her zaman noktası için kullanılmıştır. Her zaman noktası triplicate olarak analiz edildi.
  2. Parlak alan mikroskobu kullanarak, sürülerin mikrodizi üzerinde oluştuğunu doğrulayın.
  3. Supernatant'ı 200 μL pipetle aspire edin ve 0,45 m'lik santrifüj filtre tüpüne yükleyin.
  4. Supernatant'ı 190 x g ve 20 °C'de 5 dk'lık santrifüj edin ve filtrasyon hacmini toplayın.
  5. Numuneleri işleme süresine kadar -80 °C'de saklayın.
  6. Örnekleri işlemek için çeşitli insan proteinlerini algılayan bir mikrodizi kiti kullanın.
    1. Kit ile birlikte verilen ayrı bir diyaliz tüpüne her numuneden 200 μL ekleyin.
    2. Diyaliz tüplerini en az 500 mL PBS içeren bir kabın içine yerleştirin (pH = 8.0). 4 °C'de en az 3 saat karıştırın. Kabın içinde PBS'yi değiştirin ve bu adımı tekrarlayın.
    3. Herhangi bir çökelti kaldırmak için 5 dakika için 9.000 x g temiz bir santrifüj tüp ve santrifüj her örnek aktarın. Her supernatant'ı temiz bir tüpe aktarın.
    4. Her numuneyi, diyaliz numunesindeki toplam proteinin 1 mg'ı başına 36 μL 1x etiketleme reaktifi ekleyerek 180 μL'lik diyaliz numunesine biyotinylate edin. 20 °C'de 30 dk. Her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
    5. Her numune tüpüne kit ile birlikte sağlanan 3 μL stop çözeltisi ekleyin. Her numuneyi taze bir diyaliz tüpüne aktarın ve 4.6.2-4.6.3 adımlarını tekrarlayın. Bu aşamada, numune siz devam etmeye hazır olana kadar -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir.
    6. Kit ile sağlanan cam kaydırak -20 °C'de saklanır. Oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Monte edilmiş cam kaydırağı oda sıcaklığında 1-2 saat laminar akış kaputuna yerleştirin.
    7. Kit ile birlikte sağlanan engelleme tamponunun 400 μL'sini monte edilmiş cam kaydıraktan her bir kuyuya ekleyin. 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    8. Presipitatları veya partikülleri temizlemek için hazırlanan numuneleri 9.000 x g'de 5 dk santrifüj edin. Engelleme tamponu ile 5x seyreltin.
    9. Engelleme arabelleği her kuyudan kaldırın. Seyreltilmiş numunelerin 400 μL'sini uygun kuyulara ekleyin. Sallarken oda sıcaklığında 2 saat kuluçka.
    10. Her kuyudan alınan örnekleri decant. 3x'i 800 μL'lik 1x yıkama tamponu ile yıkayın oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her biri sallarken kit ile birlikte sağladım.
    11. Temiz bir kapta, 1x yıkama tampon I. Yıkama 2x oda sıcaklığında 5 dakika her sallanan sırasında 2x yıkama monte cam slayt batırın.
    12. Her alt diziye 400 μL 1x Cy3 konjuge streptavidin ekleyin. Plastik yapışkan şeritler ile kaplayın. Protokolün geri kalanı için ışıktan koruyun.
    13. Sallarken oda sıcaklığında 2 saat kuluçka.
    14. Çözeltiyi decant ve cam slaytı numune odalarından sökün.
    15. Kiti ile sağlanan 30 mL santrifüj tüp, dikkatle cam slayt ve yeterli 1x yıkama tampon i cam slayt kapsayacak şekilde ekleyin. Sallarken oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3x yıkayın.
    16. 30 mL santrifüj tüpte, sallarken oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca 1x yıkama tamponi II ile 2x yıkayın.
    17. Cam kaydırağı 5 dk ddH2O 30 mL ile yıkayın. Hazırlanan cam kaydırak titreyene kadar -20 °C'de saklanabilir.
    18. 555 nm'lik floresan emisyonda cam kaydırağı mikrodizi tarayıcısıyla tarayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nötrofiller biyopartikül mikrodizilerine eklendiğinde, biyopartikül kümelerine temas eden nötrofiller aktive olur ve sürü tepkisini başlatır. Biyopartikül mikrodizi, nötrofil infüzyonu izlemek için zaman atlamalı floresan mikroskobik kullanılarak doğrulandı (Video S1). Nötrofil çekirdeklerinin göçü, biyopartikül kümesine doğru göç ederken izlenir. Nötrofiller biyopartikül kümesine ulaştıklarında çekirdekleri kümedeki diğer çekirdeklerle örtüşmektedir. Bu nedenle, bu yöntemi kullanarak küme içinde bir nötrofilin doğru bir şekilde izlenmesi mümkün değildir. Zymosan ve E. coli biyopartikül kümeleri nötrofil sürülerinin oluşumuna neden olur. Sonuçlarımız için Şekil 2B, E. coli parçacıkları tarafından üretilen nötrofil sürülerinden elde edilen verileri kullanır. Şekil 3 ve Şekil 2'nin diğer panellerinde zimozan parçacıkları tarafından üretilen nötrofil sürüleri kullanılmaktadır. Elde edilen sonuçlar, bir nötrofil kümeyle temasa geçtiğinde biyopartikül kümelerinin nötrofil aktivasyonunu uyardığını ve bunun sonucunda 30-60 dakika sonra her kümenin etrafında kararlı nötrofil sürülerinin oluşmasına yol açtığını göstermektedir(Şekil 2A, üst). Buna karşılık nötrofiller biyopartikül kümelerinin yokluğunda kolektif göç göstermediler (Şekil 2A, alt ve Video S2). 405 nm'de lekeli nötrofil çekirdeklerinin floresan yoğunluğu kullanılarak, 30 μm çapındaki ortalama nötrofil sürüsü boyutu 1.490 ± 680 μm2 (ortalama ± SD, Şekil 2B, üst) olarak bulunmuştur. Biyopartikül kümelerinin bulunmadığı belirli bir ilgi alanının floresan yoğunluğu zaman içinde yaklaşık olarak sabitti ve bu da bu ortamda kolektif göçün yokluğunu doğruladı(Şekil 2B, alt). Nötrofil göçünün izleri nötrofillerin bir biyopartikül kümesi üzerinde birleştiğini gösterir(Şekil 2C, üst). Tersine, kontrol sisteminde yakınsama gözlenmedi(Şekil 2C, alt). Sürü ve aktive olmayan nötrofillerin hızı (mesafe kat edilen/zaman) ölçüldü ve Şekil 2D'degösterildiği gibi hız dağılımlarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark (ANOVA, p < 0.0001) bulundu. Sürühalindeki nötrofiller için ortalama hız 20.6 ± 13.0 m/dk (ortalama ± SD) ve kontrol nötrofilleriçin ortalama hız 2.0 ± 2.2 m/dk idi.

Ayrıca, swarming sırasında nötrofillerin salınan 16 proteinin konsantrasyonu analiz edilmiştir(Şekil 3). Her proteinin swarming işleminde farklı zaman noktalarında normalleştirilmiş konsantrasyonu (t = 0, 0,5, 1 ve 3 saat) hesaplanırken, normalleştirilmiş konsantrasyon (C – Cdk)/ (Cmax – Cdk). 10 protein swarming boyunca konsantrasyonu arttı. Bu proteinler adipsin, galektin-3, GROa, IL-6R, MIP-1a, MMP-8, MMP-9, Nidogen-1, TIMP-1 ve TLR2 idi. İki protein (pentraxin 3 ve RANK) swarming boyunca konsantrasyonu azaldı. Geri kalan dört protein (clusterin, PF4, RANTES ve Trappin-2) swarming ilk saat boyunca artmış ancak daha sonra azalmıştır. Başka bir deyişle, bu proteinlerin konsantrasyonları swarming sırasında "sivri" . Tanımlanan 16 proteinden 12'si bir önceki yayınımızda5. Adipsin, galektin-3, nidogen-1, pentraxin 3, TIMP-1 ve TLR2 sürüye özgü olarak gösterilirken clusterin, IL-6R, MMP-8 ve MMP-9, RANK ve trappin-25değildi.

Figure 1
Şekil 1: Biyopartikül mikrodiziüretimi. Negatif fotodirenç ile kaplanmış bir silikon gofret krom fotomaske(A)ile UV ışığına maruz kalır. Silikon gofret pişirilir ve geliştirildikten sonra, silikon gofret yüzeyinde bir fotodirenç deseni kalır. Bu ana gofret (B). Petri kabında, ana gofretin üst kısmına PDMS karışımı eklenir. PDMS bir gecede 65 °C'de tedavi edilmiştir ve PDMS kalıbını oluşturur (C). PDMS kalıp ana gofret kesilir ve bir biyopsi yumruk tek tek PDMS pulları(D)dışarı yumruk kullanılır. PDMS damgası (E) CP çözeltisi (F)ile kaplanır. Damga CP çözeltisi(G)ince bir tabaka üzerine ters. CP çözeltisinde 1 saat kuluçkaya yattıktan sonra, pul fazla CP'yi kaldırmak için cam bir slaytüzerine lekelenir. Sekiz pul daha sonra 5,6 ± 0,1 g ağırlıkla temiz bir cam kaydırağa basılır ve bir görüntüleme boşluk layıcısı(H)ile hizalanır. Damga kaldırıldığında, cp deseni kalır (I). Önceden kesilmiş kuyulara sahip bir PDMS levhası cam kaydırağa yapıştırılır (J). Daha sonra CP deseni üzerine bir biyopartikül çözeltisi eklenir (K). Negatif yüklü biyopartiküller elektrostatik etkileşim yoluyla pozitif yüklü polielektrolite bağlanır. Aşırı biyopartikül çözeltisi yıkanır ve biyopartiküller CP deseninin üzerine desenlenir (L). (M) FITC ile etiketlenmiş CP tabakasının floresan görüntüsü (Ölçek çubukları = 50 μm, büyük görüntü; Ölçek çubuğu = 25 μm, inset). (N) Texas Red (Ölçek çubuğu = 100 μm, büyük görüntü ile konjuge desenli zikoz biyopartiküllerinin floresan görüntüsü; Ölçek çubuğu = 50 μm, inset). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Nötrofil, biyopartikül kümeleri etrafında büyüme. Biyopartikül kümelerinin varlığında nötrofiller biyopartikül kümelerine (alt,kontrol nötrofiller) doğru kolektif göçe uğrarlar. Biyopartikül ler olmadığında nötrofiller kolektif göç yapmazlar. (A) Zimozan biyopartikül kümelerinin varlığında nötrofiller 30 dk içinde sürüler oluştururlar. Biyopartikül kümeleri olmadan sürü ler oluşmaz (Ölçek çubukları = 50 μm). (B) Nötrofil sürüleri ortalama 30 μm çapında E. coli biyopartikül kümeleri 1.490 ± 680 μm2 (ortalama ± SD) boyutuna kadar büyür. Kontrol nötrofiller hiçbir sürü büyüme (ANOVA, p < 0.0001, n = 32 nötrofil sürüleri, N = 1 donör, hata çubukları = standart sapma) karşılık gelen sabit bir yoğunluk sergilerler. (C) Swarming nötrofillerin izleri zimoza biyopartikül kümeleri üzerinde birleşirken, kontrol nötrofillerin yakınsama noktası göstermezler (Ölçek çubukları = 50 μm). (D) Bir zimozan hedefine doğru akın edilen nötrofillerin ortalama hızı 20.6 ± 13.0 m/dk (ortalama ± SD), kontrol nötrofillerise ortalama hızı 2.0 ± 2.2m/dk'dır. Isı haritasındaki her sayım, verilen zaman noktasında verilen anlık hıza sahip bir nötrofili temsil eder. Bu ısı haritaları bir deneyin temsilcisidir (n = 1 sürüsü; N = 1 donör; ANOVA, 6,114 = sürühalinde nötrofiller, 32,116 = kontrol nötrofiller, p < 0,0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Nötrofiller inswarming tarafından yayımlanan ücretsiz arabulucular. Nötrofil sürüsünün zaman içinde çeşitli proteinlerin üretimini etkilemesi. Protein konsantrasyonu 0, 0.5, 1 ve 3 saat olarak ölçüldü. Veri noktaları yumuşatma splines (λ = 0.05) ile donatılmıştır. Bu proteinler üç karakteristik eğilimden birini takip etme eğilimindedirler: zaman içinde azalan, zaman içinde artan veya 1 saat civarında spiking ve sonra azalan (Hata çubukları = standart sapma; n = 3 çoğalır; N = 1 donör). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video S1: Nötrofil, zymosan biyopartikül kümelerine doğru swarming. Nötrofil çekirdekleri mavi renkte gösterilir. Zymosan hedefleri kırmızı dairelerle işaretlenir (Ölçek çubuğu = 50 μm; orijinal edinme süresi = 60 dk). Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video S2: Aktive olmayan nötrofil rastgele göç. Nötrofil çekirdekleri mavi renkte gösterilir (Ölçek çubuğu = 50 μm; orijinal edinme süresi = 60 dk). Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İn vitro nötrofil sürüsünün uyarması için tek tip biyopartikül dizileri oluşturmak için bir mikro damgalama platformu geliştirdik. Platformumuzun in vitro doğası bize in vivo swarming deneyler, yani swarming nötrofiller tarafından yayımlanan arabulucuları analiz etmek için kötü yeteneği ile ortaya çıkan komplikasyonlar atlatmak için izin verir5. Ayrıca, in vivo modelleri genellikle kemirgenler11,12,13,15,22,23, veya zebra balığı11,12,15,23yapılır . Platformumuz insan nötrofilleri kullanır, bu da sonuçlarımızı insan hastalığı bağlamında daha doğrudan yorumlamamızı sağlar, ancak fare ve insan nötrofilleri arasındaki bazı benzerlikler gözlenmiştir5,11. Buna ek olarak, insan nötrofil kolektif göçünün yanı sıra, swarming nötrofiller tarafından yayımlanan arabulucuların toplanması ve analizini kolaylaştıran yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik sağlayarak platformumuzu in vivo modellerinden ayıran mekansal kontrollü bir sürü ortamını sürdürüyoruz.

Mikro damgalama protokolümüzün geliştirilmesi sırasında, dikkatli bir sorun giderme gerektiren çeşitli zorluklar ortaya çıktı. İlk olarak, CP mikrodamgalama için kullanılan son derece hidrofilik, ve PDMS pulları hidrofobik vardır. CP PDMS için yüksek bir yakınlık olmadığından, bizim prosedür dikkatle kabarcıklar oluşumunu önlemek ve ıslatma teşvik etmek için tasarlanmıştır. Önce yüz-up (adım 1.8) sırasında CP ile damga priming, CP ve damga arasında kabarcıklar oluşumunu en aza indirir. Damga daha sonra CP bir tabaka üzerine ters ve 1 saat için inküp. Bu uzun kuluçka süresi, damganın her bölümünün ıslak olmasını sağlar. İkinci olarak, temiz bir cam slayt (adım 1.11) damgalama önce fazla CP kaldırma işlemi tutarsız olabilir. Adım 1.11 gerçekleştirirken, damga dikkatle incelenmelidir. Desen görünür olmaya başladığında, damga adım 1.12 için hazırdır. Ayrıca, pulları kurutmak için gerekli vakum süresi (adım 1.12) değişebilir. Bu öncelikle hava bağlıdır. Sıcak ve nemli bir günde 2 dk vakum süresi gereklidir. Serin ve kurak bir günde 1 dk vakum süresi yeterlidir.

Sağlıklı donörlerden gelen nötrofillerin biyopartikül kümelerinin etrafında istikrarlı sürüler oluşturduğunu gösterdik. Zaman atlamalı floresan mikroskopi ile, biz sürü boyutunu ölçmek ve nötrofil göç izlemek, bize nötrofil kemotaksis kantitatif5analiz sağlar. Örneğin, daha önce bu platformun kemotaktik indeksini hesaplamak için kullanılabileceğini gösterdik (CI, nötrofil hız vektörü ile nötrofil ile en yakın biyopartikül kümesi arasındaki konum vektörü arasındaki açının kosinüsü), hız (zamana göre bölünmüş nötrofil yolculukları mesafesi), radyal hız (CI ile çarpılır) ve bireysel göç eden nötrofillerin toplam uzaklığı (ilk ve son nötrofil pozisyonu arasındaki fark)5. En in vitro çalışmalar aksine24,25,26, bizim platform yapay kemotaktik gradyan yok, bu yüzden nötrofil intersellüler iletişim nötrofil göç tek itici güçtür. Ayrıca, swarming nötrofiller tarafından oluşturulan supernatant kolayca erişilebilir. Nötrofiller tarafından salınan hücreler arası aracıların süpernatantını, in vivo mevcut olan diğer hücre tiplerinden etkilenmeden toplayabilir ve analiz edebiliriz. 16 protein gözlendi ve swarming sırasındaki ekspresyonu üç eğilimden biri olarak tanımlanabilir: artış (10 protein), azalma (iki protein) ve başak (dört protein). Bu proteinlerin altı zaman içinde swarming sırasında daha önce bildirilen eğilimleri doğruladı5. Tanımlanan proteinlerin bazıları daha önce sürüye özgü olarak gösterilmiştir, diğerleri ise aktif olmayan swarming nötrofiller 5 ile farklı olarak ifadeedilmiştir. Zamanla konsantrasyonu artan proteinler muhtemelen pro-inflamasyon yanıtı ile ilişkilidir. Zamanla konsantrasyonu artan proteinlerin bazıları zaten pro-inflamatuar yanıt (örneğin, galectin-3 ve MMP-9)27,28dahil olduğu bilinmektedir. Diğer proteinler ve inflamasyon arasındaki ilişki daha az iyi anlaşılmaktadır. Sürü ler sırasında fırlayan veya azalan proteinler iltihabın düzenlenmesinde rol alabilir. Ancak, daha fazla araştırma farklı swarming sırasında ifade proteinlerin çoğu iltihabı rolünü anlamak için gereklidir. Nötrofil göçü ile birlikte yayımlanan arabulucuların analizi, inflamasyonun karmaşık resmini ve nötrofillerin sürü sırasında çevre dokuları nasıl etkilediğini daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir.

Gelecekteki çalışmalarda, platformumuz sağlıksız nötrofillerin desenli biyopartikül kümeleri etrafında kararlı sürüler oluşturma yeteneğini iyice incelemek için kullanılabilir. Çeşitli tıbbi koşullar nötrofiller ile ilgili olmuştur, sepsis dahil3, travma6, ve kanser1,8,17,18, Bu hastalarda nötrofiller düşündüren fonksiyon değişmiş olabilir. Bu platform, sağlıklı ve sağlıksız nötrofiller tarafından yayımlanan hücreler arası aracılar arasındaki farkları incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu platform canlı mikroplar desen değiştirilebilir ve in vitro canlı mikroplara nötrofil yanıtı analiz etmek için kullanılır.

Sonuç olarak, in vitro nötrofil swarming analiz etmek için yeni bir platform geliştirdik. Platformumuzun yüksek kontrollü doğası, in vivo nötrofil swarming deneyleri sırasında ortaya çıkan sorunları azaltmamızı sağlar. Biyopartikül mikrodiziüzerinde nötrofil sürüse, zaman atlamalı floresan mikroskopi ile kolayca ölçülebilen bir biyopartikül mikroskopisi vardır. Ayrıca, biz in vivo mevcut diğer dokuların müdahalesi olmadan nötrofiller tarafından yayımlanan arabulucuları toplayabilir. Bu platform, nötrofillerin sağlıklı ve sağlıksız bağışçılardan gelen göç davranışları arasındaki farklılıkları ölçmek için gelecekteki araştırmalarda kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgments

Bu çalışma William G. Lowrie Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü ve Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nin finansmanı ile desteklenmiştir. Bu raporda sunulan veriler, Ohio State Üniversitesi Kampüs Mikroskobu ve Görüntüleme Tesisi'nde bulunan Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) kullanılarak işlenen görüntülerden elde edilmiştir. Bu tesis kısmen P30 CA016058, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18001 Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator Okolab 777057437 / 77057343 Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit STEMCELL Technologies 17957 Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2 Nikon Instruments MEA54010 / MEF55037 Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch Sigma Aldrich Z708925 To cut PDMS stamps
HetaSep STEMCELL Technologies 7906 Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array Raybiotech Inc. AAH-BLG-1000-4 High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA) Sigma Aldrich A5843 Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053 To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes Thermo Fisher Scientific 02-657-32 Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask Front Range Photomask N/A Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner Perkin Elmer ASCNGX00 Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris Bitplane 9.3.0 Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package Nikon Instruments MQS31100 Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) Sigma Aldrich P3069-10MG 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer Grace Bio-Labs 654008 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer University Wafer 590 Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater Laurell WS-650MZ-23NPPB Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025 MicroChem 2025 Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer MicroChem Y020100 Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) Dow 1673921 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System Kloé UV-KUB 2 Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water Thermo Fisher Scientific A1287303 High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185 BASF 8185 Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen Z2843 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
  2. Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
  3. Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
  4. Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
  5. Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
  6. Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
  7. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
  8. Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
  9. Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
  10. Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
  11. Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
  12. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  13. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  15. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  16. Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
  17. Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
  18. Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
  19. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
  20. Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
  21. Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
  22. Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
  23. Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
  24. Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
  25. Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
  26. Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
  27. Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
  28. Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).

Tags

Biyomühendislik Sayı 156 mikrodizi mikrodamgalama hücre göçü nötrofil sürü protein
İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walters, N., Reátegui, E.More

Walters, N., Reátegui, E. Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro. J. Vis. Exp. (156), e60544, doi:10.3791/60544 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter