Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

Published: December 21, 2019 doi: 10.3791/60545
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Fluid Power and Mechatronic Systems, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, 2Key Laboratory of 3D Printing Process and Equipment of Zhejiang Province, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, 3School of Mechanics and Safety Engineering, Zhengzhou University

Summary

המוצג כאן הוא שיטה עבור ביופסיה 3D של ג'לטין מתיאקריל.

Abstract

מתיונין ג'לטין (GelMA) הפך להיות ברמה פופולרית בתחום הביוגלוטינג. הנגזרת של חומר זה הוא ג'לטין, אשר הידרוליזה מ יונק הקולגן. ולכן, מוטיבים של ארגיטין-גליצין-אספפטיק (RGD) והמוטיבים המטרה של מטריקס מטאלופרוטאז (MMP) נשארים על הרשתות המולקולריות, המסייעות להשיג את הקבצים המצורפים והשפלה. יתר על כן, תכונות היווצרות של GelMA הם צדדי. קבוצות התיאקרילאמיד מאפשרות לחומר להיות מחובר במהירות באמצעות הקרנה קלה בנוכחות פוטויזם. לכן, זה הגיוני מאוד להקים שיטות מתאימות לסינתזה תלת מימדי (3D) מבנים עם החומר הזה מבטיח. עם זאת, צמיגות נמוכה מגבילה את ההדפסה של GelMA. המוצגים כאן הם שיטות לביצוע הביוביטינג 3D של GelMA הידרוג, כלומר הייצור של מיקרוספירות GelMA, סיבי GelMA, מבנים מורכבים GelMA, ו-GelMA מבוססי שבבי מיקרופלואידיג. המבנים המתקבלים והביותאימות של החומרים, כמו גם שיטות ההדפסה נדונים. הוא האמין כי פרוטוקול זה עשוי לשמש גשר בין הסמנים שהוחלו קודם לכן GelMA, כמו גם לתרום הקמתה של מבוססי GelMA ארכיטקטורות תלת-ממד עבור יישומים ביו.

Introduction

הידרולים נחשבים לחומר מתאים בתחום הביואבריאציה1,2,3,4. ביניהם, הג מתיונין (GelMA) הפך לאחד הסמנים המגוונים ביותר, הציע בתחילה ב 2000 על ידי ואן דן בולק ואח '5. GelMA מסונתז על ידי תגובה ישירה של ג'לטין עם מתיונין אנהידריד (MA). הג, שהוא ידרוליזה על ידי הקולגן יונק, מורכב מוטיבים היעד של מטריקס מטפרוטאינאז (mmp). כך, באופן מתורבת תלת מימדי (3D) רקמה מודלים שהוקמה על ידי GelMA יכול בצורה אידיאלית לחקות את האינטראקציות בין תאים מטריצה מגלונת (ECM) ב vivo. יתר על כן, arginine-גליצין-aspartic חומצה (RGD) רצפים, אשר נעדרים כמה הידרולים אחרים כגון alginates, להישאר על השרשראות המולקולריות של GelMA. זה מאפשר להגשים את ההחזקה של התאים המכוומים בתוך הרשתות ההידרוג'ל6. בנוסף, יכולת היווצרות של GelMA מבטיח. הקבוצות של מתיאקרילאמיד על הרשתות המולקולריות של GelMA מגיבים עם מאתחל התמונה בתנאי תגובה מתונים ויוצרים קשרים בעלי קשר עם חשיפה להקרנה קלה. לכן, המבנים המודפסים יכולים להיות מקושרים במהירות כדי לשמור על הצורות המתוכננות באופן פשוט.

בהתבסס על מאפיינים אלה, סדרה של שדות לנצל GelMA לבצע יישומים שונים, כגון הנדסת רקמות, ניתוח ציטולוגיה בסיסי, הקרנת תרופות, ביוחישה. בהתאם, אסטרטגיות ייצור שונות הוכחו גם7,8,9,10,11,12,13,14. עם זאת, הוא עדיין מאתגר לבצע ביוריטינג תלת-ממדי מבוסס על GelMA, אשר בשל תכונותיו הבסיסיות. GelMA הוא חומר רגיש לטמפרטורה. במהלך תהליך ההדפסה, הטמפרטורה של אווירת ההדפסה צריכה להיות נשלטת בקפדנות על מנת לשמור על המצב הפיזי של הביודיו. חוץ מזה, צמיגות של gelma הוא בדרך כלל נמוך יותר הידרוג'לים נפוצים אחרים (כלומר, alginate, chitosan, חומצה יאלורונית, וכו '). עם זאת, מכשולים אחרים מתמודדים כאשר בונים ארכיטקטורות תלת-ממד עם חומר זה15.

מאמר זה מסכם מספר גישות עבור ביופסיה תלת-ממדית של GelMA המוצעים על ידי המעבדה שלנו ומתארת את הדגימות המודפסות (כלומר, סינתזה של מיקרוספירות GelMA, סיבי GelMA, מבנים מורכבים GelMA, ושבבי מיקרופלואידיג מבוססי GelMA). כל שיטה יש פונקציות מיוחדות ניתן לאמץ במצבים שונים עם דרישות שונות. המיקרוספירות של GelMA נוצרות על ידי מודול חשמלי, היוצר כוח חשמל חיצוני נוסף כדי לכווץ את גודל ה-droplet. במונחים של סיבים GelMA, הם הבלטת ידי ביופסיה קואקסיאליים בעזרת זרבובית הנתרן הצמיגה. בנוסף, הקמתה של מבנים תלת ממדיים מורכבים מושגת עם עיבוד אור דיגיטלי (DLP) ביוריקטר. בסופו של דבר, האסטרטגיה פעמיים מקשרת מוצעת לבניית שבבי מיקרופלואידיג מבוססי GelMA, שילוב של GelMA הידרוג'ל ושבבי מיקרופלואידיג מסורתיים. הוא האמין כי פרוטוקול זה הוא סיכום משמעותי של האסטרטגיות GelMA הביוריטינג המשמשים במעבדה שלנו יכול לעורר חוקרים אחרים בתחומים יחסיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא מקולף

  1. הכינו את מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), שיושלם עם 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, המשמש תרבות סרטן השד האנושי תא (מד א-MB-231) קווים וריד הטבור האדם תא אנדותל (HUVEC) קווים.
  2. הכנת DMEM עם L-גלוטמין (DMEM/F-12), שיושלם עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, משמש במח העצם של העצמות mesenchymal תא גזע (BMSC) קווים.
  3. הגדר את הסביבה culturing כמו 37 ° צ' ו 5% CO2. התרבות מד א-MB-231, HUVEC, ו-BMSC, ומעבר את התאים ביחס 1:2 כאשר 90% המפגש הגיע.

2. הייצור של מיקרוספירות גלמה

  1. הדפס את התקן כאיור 1A עם חומצה POLYLACTIC (PLA) על מדפסת מידול בתצהיר התמזגו (fdm). הציבו שני אלקטרודות מתכת. בגוף הקבוע
  2. חבר את שתי האלקטרודות המתכתיים עם הקרקע והקטבים החיוביים, בהתאמה. מניחים את לוחית המתכת המחוברת עם מתח גבוה מתחת לאלקטרודות הטבעת ומניחים צלחת פטרי עם שמן סיליקון על צלחת המתכת כמקלט droplet.
  3. הקפאת הקפאה GelMA (5% w/v) ו ליתיום פניאיל-2, 4, 6-triמתילבנזופוספוליאט (LAP, 0.5% w/v) ב מלוחים באגירה של הפוספט מדולפי (DPBS) כמו bioink (10 מ"ל). לסנן את bioink באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר עבור עקרות ולחמם אותו באמבט 37 ° c מים עבור 15 דקות.
  4. לנתק מד א-MB-231 תאים עם 3 מ ל של 0.25% טריפסין-0.02% EDTA פתרון עבור 3 דקות ב 37 ° c. בתאי צנטריפוגה בצינור 15 mL צנטריפוגלי ב 100 x g עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה תא.
  5. . הסר את הסופרנטאנט מערבבים את הגלולה התא עם 1 מ ל של bioink מוכן על ידי ליטוף לאט כדי למנוע את הייצור של בועות.
  6. מניחים 1 מ ל bioink (מד א-מגה-בתים-231) לתוך מזרק סטרילי 3 מ ל. האכילו את הביודיו בכוח האוויר הדחוס (~ 0.5 kPa). . שים את המזרק על המתקן
    הערה: על סביבת ההדפסה להיות נשלטת באופן מדויק בטמפרטורה של 30 ° צ' ולחות של 50%.
  7. הפעל את עוצמת המתח הגבוה והגדר את המתח כ-0-4 kV. במקביל, הפעל את 405 האור באורך גל ננומטר כדי להצליב את טיפות GelMA ב 5 מ ל של שמן סיליקון.
  8. יוצקים את החלק הטוב ביותר של שמן הסיליקון משם על ידי היין את צלחת פטרי. העבירו את השמן סיליקון ואת המיקרוספירות GelMA לתוך שפופרת 15 מ"ל באמצעות כפית.
  9. הוסיפו 5 מ ל של DPBS ולוחצים את התערובת בצורה אחידה. צנטריפוגה את הצינור ב 100 x g עבור 5 דקות ולהסיר את נוזל סופרנטאנט.
  10. חזור על השלב 2.9 3x.
  11. קחו את המיקרוספירות של גלמא בכפית והתרבות שלהם ב-DMEM בצלחת פטרי ב-37 ° c ו-5% CO2 למשך 3 ימים.
  12. להיפטר המדיום לשטוף את המיקרוספירות עם DPBS. תקן עם 2 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  13. התעלם מה "ושטוף את המיקרוספירות עם DPBS. חדירות עם 2 מ ל של 0.5% nonionic החומרים (כלומר, טריטון X-100) עבור 5 דקות ב RT.
  14. התעלם מחומרים המיקרופוניים ושטוף את המיקרו-כדורים עם DPBS. להכתים אותם עם 2 מ ל של טטרמתילרומדמין (TRITC) phalloidin 30 דקות בחשיכה ב RT.
  15. להיפטר TRITC ולשטוף את המיקרוספירות עם DPBS. להכתים אותם עם 2 מ ל של 4 –, 6-diamidino-2-פנייילידול (DAPI) עבור 10 דקות בחשיכה ב RT.
  16. מחק את ה-DAPI ושטוף את המיקרו-כדורים באמצעות DAPI. לכוד את המבנה עם. מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית

3. ייצור סיבי גלמה

  1. הכן זרבובית קואקסיאליים כפי שמוצג באיור 2א. תקן זרבובית פנימית (25 גרם, OD = 510 μm, ID = 250 μm) ואת הזרבובית החיצונית (18 G, OD = 1200 μm, ID = 900 μm) עם הלחמה. לחבר צינור זכוכית (אורך = 50 מ"מ, קוטר בתוך = 1.2 מ"מ) עד לסוף הזרבובית הקואקסיאליים.
  2. התמוססות נתרן קילוף פלסטיצידיות (Na-alg) אבקה כי הוא מעוקר תחת אולטרה סגול (UV) אור עבור 30 דקות במים מאוהים ב 2% (w/v).
  3. הכינו פתרון bioink סטרילי לאחר שלב 2.3. מחממים את התמיסה GelMA ו-Na-Alg באמבט מים ב37 ° c במשך 15 דקות.
  4. נתק תאים BMSCs עם 3 מ ל של 0.25% טריפסין-0.02% EDTA פתרון עבור 3 דקות ב 37 ° c. בתאי צנטריפוגה בצינור 15 mL צנטריפוגלי ב 100 x g עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה תא.
  5. . הסר את נוזל הסופרנטאנט מערבבים את הגלולה תא עם 2 מ ל של ביודיו GelMA מוכן על ידי ליטוף באיטיות כדי למנוע ייצור של בועות.
  6. מניחים 2 מ ל bioink (BMSCs) לתוך מזרק 10 מ ל. מניחים 2 מ ל של פתרון Na-Alg לתוך מזרק אחר (10 מ"ל). להאכיל אותם עם שני משאבות מזרק, בהתאמה (כאן, bioink ב 50 μm/min ו-Na-Alg פתרון ב 350 μm/min).
    הערה: על סביבת ההדפסה להיות נשלטת באופן מדויק בטמפרטורה של 30 ° צ' ולחות של 50%.
  7. הפעל את האור 405 ננומטר באורך הגל כדי להאיר את הצינורית השקופה כדי להצליב את סיבי GelMA. השתמש בצלחת פטרי עם DPBS כדי לקבל את הסיבים.
  8. להוציא את סיבי GelMA עם כפית של DPBS ותרבות אותם 3 ימים ב-DPBS המוכן/F-12 ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  9. בצע את השלבים 2.12-2.16 כדי להכין את סיבי GelMA עבור תצפית מורפולוגית עם מיקרוסקופ מגמה פלואורסצנטית.

4. הייצור של מבנים 3D GelMA מורכבים

הערה: איור 3A מציג את הסקיצה הייצור של מבנה Gelma מורכבים 3d.

  1. לנגב את ביוריקטר DLP (איור 3E) עם 75% אלכוהול ולחשוף אותו הקרנה UV עבור 30 דקות עבור עקרות.
  2. לפזר את ההקפאה מיובשים GelMA (10% w/v) ו LAP (0.5% w/v) ב DPBS. הוסיפו פיגמנט אכיל מגנטה לתוך הפתרון (3% v/v) כדי לשפר את דיוק ההדפסה.
  3. לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר עבור עקרות ולחמם אותו באמבטיה 37 ° c מים עבור 15 דקות.
  4. בניית דגמי תלת-ממד עם תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD). יבא את מסמכי המודל לתוכנה העליונה (EFL) של הביוקטר שהוחל על-ידי טכנולוגיית DLP.
  5. הוסיפו 10 מ ל של הביודיו המוכן לתוך האבוס של ביוריטר DLP.
  6. הגדר את פרמטרי ההדפסה בתוכנה העליונה כדלקמן: עוצמת אור = 12 mW/cm2, משך הקרנה = 30 s, וגובה פרוסה = 100 μm. התחל בהדפסה.
  7. הסר את המבנה המודפס מהביו-ביוקטר והישאב אותו ב-DPBS בצלחת פטרי.
  8. ניתוק תאים מד א-MB-231s עם 3 מ ל של 0.25% טריפסין-0.02% EDTA פתרון עבור 3 דקות ב 37 ° c. בתאי צנטריפוגה ב 100 x g עבור 5 דקות בצינור 15 מ"ל כדי להשיג גלולה תא.
  9. הסר את נוזל supernatant ולערבב את הגלולה תא עם 2 מ ל DMEM.
  10. הוסף 100 μL של השעיית תא במבנים המודפסים. התרבות שלהם 3 ימים ב-DMEM מוכן ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  11. בצע את השלבים 2.12-2.16 כדי להכין את המבנים תלת-ממדיים מורכבים עבור תצפית מורפולוגית עם מיקרוסקופ ה.

5. ייצור שבבי מיקרופלואידיג מבוססי גלמא

הערה: איור 4מראה את הסקיצה הייצור של שבב מיקרופלואידיג מבוססי gelma.

  1. לפזר את ההקפאה יבש GelMA 10% (w/v) ו LAP (0.5% w/v) ב DPBS. לסנן את הפתרון gelma באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר עבור עקרות.
  2. לחטא את אבקת ג'לטין תחת אור UV עבור 30 דקות ולהוסיף אותו לפתרון GelMA-LAP מוכן בשלב 5.1 לריכוז הסופי של ג'לטין של 5% (w/v). מחממים את התערובת באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 15 דקות.
  3. עיצוב קבוצה של תבניות (איור 4ב, ג) עם תוכנת CAD ולייצר אותם עם שרף photopolymer במדפסת DLP.
  4. מלא את התבניות באופן מלא עם הביודיו המוכן.
  5. לשים את התבניות לתוך מקרר 4 ° c כדי להצליב את הג עבור 30 דקות.
  6. הסירו את התבניות והעצמות בלהב, באופן חלקי (פיזית), מקושרות את יריעות ההידרוג'ל מתוך התבניות.
  7. לשלב את שני גיליונות הידרוג'ל מאוד וקשר אותם בעזרת GelMA על ידי אי הקרנת ב 405 nm עבור 1 דקות.
  8. נתק את תאי HUVECs עם 3 מ ל של 0.25% טריפסין-0.02% EDTA פתרון עבור 3 דקות ב 37 ° c. התאים צנטריפוגה בצינור 15 מ"ל צנטריפוגלי כדי לקבל גלולה תא ב 100 x g עבור 5 דקות.
  9. הסר את נוזל supernatant ולערבב את הגלולה תא עם 2 מ ל DMEM.
  10. מלא את המיקרוערוץ באופן מלא על ידי הזרקת הבולם התא עם זרבובית ומזרק.
  11. הפוך את השבב למטה כל 15 דקות במהלך הבא 3 h כדי להשיג אחיד ולהשלים התאים זריעה. התרבות השבבים בצלחת פטרי במשך 3 ימים ב-DMEM הוכנו ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  12. בצע את השלבים 2.12-2.16 כדי להכין את השבבים המיקרופלואידים להשגחה מורפולוגית עם מיקרוסקופ של מיקרו-פלואורסצנטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במהלך הייצור של מיקרוספירות גלמה, טיפות GelMA הופרדו מכוח השדה החשמלי החיצוני. כאשר טיפות ירד לתוך שמן סיליקון מקבל, הם נשארו צורת ספרואיד סטנדרטי ללא זנבות. הסיבה לכך היא טיפות GelMA בשלב מימית, בעוד שמן הסיליקון היה בשלב הנפט. מתח פני השטח שנוצר בין שני השלבים גרם לטיפות GelMA לשמור על צורה סטנדרטית של ספרואיד. במונחים של מיקרוספירות תא-לאדן, התאים חוו את כוח השדה החשמלי של מתח גבוה בתהליך זה. מתוך המבנה של מד א ויטראז '-MB-231s (איור 1B – E), התגלה כי מד א-mb-231s שמרו על יכולת ההתפשטות שלה, ומאמת את התאימות הביולית של שיטת הייצור אלקטרונמית זו.

במונחים של סיבי GelMA, הפתרון של GelMA ונתרן מוזרם בתוך החרירים הפנימיים והחיצוניים של הזרבובית הקואקסיאליים, בהתאמה. כמו נתרן קילוף פלסטיצידיות היה צמיגות גבוהה יותר gelma, gelma היה מוגבל בפתרון קילוף פלסטיצידיות נתרן ושמרה על צורת קו. ההקרנה על ידי אור (405-גל ננומטר) גרם להגלמא הפנימי להיות מקושר, ויוצרים את סיבי גלמא (איור 2ב'). בנוסף, BMSCs בסיבי גלמה (איור 2C, D). כפי שמוצג, BMSCs שעברו אנקפסולציה המשיכה להפיץ יכולת ברשתות ההידרוג'ל לאחר תהליך הייצור (איור 2E).

ביורינטר של DLP® נבחר להמציא מבני GelMA עם צורות מורכבות יותר. כפי שמוצג באיור 3ב-D, הוקמו המבנים של "האף", "האוזן" ו-"multichamber". על פני השטח של מבנים GelMA מקושרים, הכפולת הנזרע המצורפת חומרים GelMA ולהתפשט (איור 3F). זה הוכיח את האפשרות כי הקמתה של GelMA קומפלקס מבנים תלת-ממד בעזרת ביובריטר DLP® מחזיקה פוטנציאל גדול ביישומים בתחום הנדסת רקמות.

שלא כמו שבב מיקרופלואידיג המסורתי המבוסס על חומרים ללא מאפיינים ביולוגיים16,17,18,20 (כלומר, שרף, זכוכית, polydiמתיל siloxane [pdms], ו פולימתיל מתיונין [pmma]), שבב מיקרופלואידיג מבוססי gelma היה מפוברק כאן באמצעות כפול הקישור באמצעות שני מרכיבים בביודיו היו מקושרים ברציפות. שבבים עם מיקרוערוצים שונים נבנו על ידי עיצוב תבניות שונות על פי דרישה (איור 4ב, ג). חוץ מזה, זה אומת כי HUVECs היו שנזרע בערוצים ומחובר לקיר הערוץ, להרכיב את הצורה כלי מאקרוסקופי (איור 4ד, E).

Figure 1
איור 1: מיקרוספירות GelMA. (א) משרטט סקיצה של מיקרוספירות gelma. (ב) תמונת מיקרוסקופ אופטי של מיקרוספירות gelma. (C) מיקרוסקופ אופטי של התמונה של מד א-231s ב gelma. (ד) השקפה דו-ממדית של ה-F-actin והגרעין של מד א-231s שעברו כימוע-MB. (ה) השקפה תלת ממדית של F-actin והגרעין של מד א באנקפסולציה-MB-231s. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סיבי גלמא. (א) שרטוט של סיבי הגלמה. (ב) תמונת מיקרוסקופ אופטי של סיבי gelma (עם דיו כחול). (ג) מיקרוסקופ ממוקד הדימוי של סיבי gelma (עם חלקיקי זריחה ירוקה). (ד) מיקרוסקופ אופטי התמונה של BMSCs בסיבי gelma. (ה) F-actin והגרעין של BMSCs שעברו אנקפסולציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: GelMA מבנה תלת-ממדי מורכב. (א) משרטט סקיצה של המבנים המורכבים של gelma תלת-ממדי. (ב) מיקרוסקופ אופטי התמונה של האף "gelma". (ג) תמונת מיקרוסקופ אופטי של "gelma" האוזן. (ד) מיקרוסקופ אופטי התמונה של "gelma" מרובה. (ה) הביורימטר המוחל של ה-DLP. (ו) ה-F-actin והגרעין של הקומד-מגה-בתים-231s. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שבב מיקרופלואידיג מבוסס גלמא. (א) שרטוט של שבב מיקרופלואידיג המבוסס על גלמא. (ב,ג) תמונות מיקרוסקופ אופטי של שבב מיקרופלואידיג מבוססי GelMA. (ד) מיקרוסקופ אופטי הדימוי של HUVECs הנזרע על קיר הערוץ. (ה) ה-F-actin והגרעין של ה-HUVECs הנזרע על קיר הערוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר מספר אסטרטגיות להרכיבו מבנים תלת-ממדיים של GelMA, כלומר מיקרוספירות GelMA, סיבי GelMA, מבנים מורכבים של GelMA ושבבי מיקרופלואידיג מבוססי-GelMA. GelMA מבטיחה את יכולת ההתאמה הביויולית והיווצרות ומשמשת רבות בתחום הביו-המבנה. מבנים microsphere מתאימים שחרור התרופה מבוקרת, רקמה culturing, והזרקה לתוך אורגניזמים עבור טיפול נוסף21,22,23,24,25. מכיוון שהצמיגות של התמיסה GelMA נמוכה, המבנה שלו מאתגר. כך, במהלך הייצור של מיקרוספירות GelMA, העיקרון האלקטרוהידרודינמי (EHD) נבחר לפתור בעיה זו. המתח שהוחל היה נמוך יחסית, והמיקרוטיפות הופקו אחת-אחת. כדי להמציא מיקרוספירות בגודל קטן יותר, ניתן להגדיל את המתח המוחל והנוזל יהיה במצב אחר עם הקונוס של טיילור26.

בגלל תופעת הפיצוץ הקולון, הטיפות המופרדות הופרדו עוד יותר מצפיפות החשמל העודפת שלהם, והתוצאה היא מיקרוספירות קטנות יותר של GelMA. יתר על כן, סיבי gelma מונומרכיב הפוברק בעזרת זרבובית קואקסיאליים ופתרון קילוף פלסטיצידיות נתרן. . זרבובית קואקסיאליים הוחלה כאן כפי שהוזכר לעיל, בגלל צמיגות נמוכה של gelma, נתרן קילוף פלסטיצידיות סיפק עמידות לעזור לשמור על הצורה של סיבים. מבנים סיבי הידרוג'ל מתאימים לחיקוי רקמות בצורת סיבים ב vivo (כלומר, השרירים, כלי, וכו '27,28,29,30,31,32). לסיבי גלמא עם רכיבים מסובכים יותר, ניתן לשנות את החרירים הביוגלוטינג שהוחלו. לדוגמה, ניתן להרכיב זרבובית קואקסיאלי בת שלוש שכבות כדי ליצור סיבי GelMA מרובי שכבות.

בהקמת מבנים GelMA מורכבים תלת-ממדיים, התגלה כי ביובריטר DLP® מתפרק דרך מכשול ההדפסה הנגרם על ידי צמיגות נמוכה של GelMA. בעזרת תוכנת CAD, מבנים 3D GelMA הפוברק על פי דרישה. בסופו של דבר, שיטת ייצור GelMA חדשה, האסטרטגיה פעמיים המקשר, הוכח והחל על שילוב של GelMA ו שבב מיקרופלואידיג מסורתי. ההידרוג יש תאימות גבוהה יותר, וחוקרים יכולים לכמס תאים בתוך גוף השבב. שבב מיקרופלואידיג המוצע של GelMA יכול להיות משופר עוד יותר על ידי encapsulating תאים באסימונים כדי לשמש מודלים מתאים בחוץ לסינון סמים, לימודי אינטראקציה סלולרית, וכו '. אנו מאמינים כי שיטות הייצור של GelMA שתוארו כאן יגדיל את שיעור הפיתוח בתחום זה וניתן ליישם במחקר רפואי נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו הייתה בחסות תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2018YFA0703000), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. U1609207, 81827804), קרן המדע עבור קבוצות מחקר יצירתי של המדע הטבעי הלאומי קרן סין (מס ' 51821093).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter membrane Millipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinter SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength light SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzle SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscope OLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinter SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printer SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12) Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL Software SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS) Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatin Sigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA) SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage power SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehyde Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycin Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg) Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidin Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100 Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmed, E. M. Hydrogel: Preparation, characterization, and applications: A review. Journal of Advanced Research. 6 (2), 105-121 (2015).
  2. Ashton, R. S., Banerjee, A., Punyani, S., Schaffer, D. V., Kane, R. S. Scaffolds based on degradable alginate hydrogels and poly(lactide-co-glycolide) microspheres for stem cell culture. Biomaterials. 28 (36), 5518-5525 (2007).
  3. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  4. Saroia, J., et al. A review on biocompatibility nature of hydrogels with 3D printing techniques, tissue engineering application and its future prospective. Bio-Design and Manufacturing. 1 (4), 265-279 (2018).
  5. Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and Rheological Properties of Methacrylamide Modified Gelatin Hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
  6. Sun, M., et al. Synthesis and Properties of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels and Their Recent Applications in Load-Bearing Tissue. Polymers. 10 (11), 1290 (2018).
  7. Gao, Q., et al. 3D printing of complex GelMA-based scaffolds with nanoclay. Biofabrication. 11 (3), 035006 (2019).
  8. Hassanzadeh, P., et al. Ultrastrong and flexible hybrid hydrogels based on solution self-assembly of chitin nanofibers in gelatin methacryloyl (GelMA). Journal of Materials Chemistry B. 4 (15), 2539-2543 (2016).
  9. McBeth, C., et al. 3D bioprinting of GelMA scaffolds triggers mineral deposition by primary human osteoblasts. Biofabrication. 9 (1), 015009 (2017).
  10. Nie, J., et al. Vessel-on-a-chip with Hydrogel-based Microfluidics. Small. 14 (45), 1802368 (2018).
  11. Shao, L., et al. Bioprinting of Cell-Laden Microfiber: Can It Become a Standard Product. Advanced Healthcare Materials. 8 (9), 1900014 (2019).
  12. Shao, L., et al. Fiber-Based Mini Tissue with Morphology-Controllable GelMA Microfibers. Small. 14 (44), 1802187 (2018).
  13. Xie, M., et al. Electro-Assisted Bioprinting of Low-Concentration GelMA Microdroplets. Small. 15 (4), 1804216 (2019).
  14. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  15. Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
  16. Barbot, A., Decanini, D., Hwang, G. On-chip Microfluidic Multimodal Swimmer toward 3D Navigation. Scientific Reports. 6, 19041 (2016).
  17. Esmaeilsabzali, H., et al. An integrated microfluidic chip for immunomagnetic detection and isolation of rare prostate cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 18 (1), 22 (2016).
  18. Lee, J. M., Zhang, M., Yeong, W. Y. Characterization and evaluation of 3D printed microfluidic chip for cell processing. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), 5 (2016).
  19. Picot, J., et al. A biomimetic microfluidic chip to study the circulation and mechanical retention of red blood cells in the spleen. American Journal of Hematology. 90 (4), 339-345 (2015).
  20. Ren, K., Zhou, J., Wu, H. Materials for Microfluidic Chip Fabrication. Accounts of Chemical Research. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  21. Chen, H., et al. Covalently antibacterial alginate-chitosan hydrogel dressing integrated gelatin microspheres containing tetracycline hydrochloride for wound healing. Materials Science and Engineering: C. 70, 287-295 (2017).
  22. Fan, M., et al. Covalent and injectable chitosan-chondroitin sulfate hydrogels embedded with chitosan microspheres for drug delivery and tissue engineering. Materials Science and Engineering: C. 71, 67-74 (2017).
  23. Feng, J., et al. Preparation of black-pearl reduced graphene oxide-sodium alginate hydrogel microspheres for adsorbing organic pollutants. Journal of Colloid and Interface Science. 508, 387-395 (2017).
  24. Park, K. S., Kim, C., Nam, J. O., Kang, S. M., Lee, C. S. Synthesis and characterization of thermosensitive gelatin hydrogel microspheres in a microfluidic system. Macromolecular Research. 24 (6), 529-536 (2016).
  25. Zheng, Y., et al. Injectable Hydrogel-Microsphere Construct with Sequential Degradation for Locally Synergistic Chemotherapy. ACS Applied Materials, Interfaces. 9 (4), 3487-3496 (2017).
  26. Fernández de la Mora, J. The Fluid Dynamics of Taylor Cones. Annual Review of Fluid Mechanics. 39 (1), 217-243 (2006).
  27. Hsiao, A. Y., et al. Smooth muscle-like tissue constructs with circumferentially oriented cells formed by the cell fiber technology. PLoS ONE. 10, 0119010 (2015).
  28. Meng, Z. J., et al. Microfluidic generation of hollow Ca-alginate microfibers. Lab on a Chip. 16 (14), 2673-2681 (2016).
  29. Peng, L., Liu, Y., Gong, J., Zhang, K., Ma, J. Continuous fabrication of multi-stimuli responsive graphene oxide composite hydrogel fibres by microfluidics. RSC Advances. 7 (31), 19243-19249 (2017).
  30. Sugimoto, M., et al. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  31. Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking. Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).
  32. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 154 ביובריטינג לג מיקרו-מיקרואקריל גלמא מיקרופייבר עיבוד אור דיגיטלי DLP שבב מיקרופלואידיג
פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, M., Yu, K., Sun, Y., Shao, L.,… More

Xie, M., Yu, K., Sun, Y., Shao, L., Nie, J., Gao, Q., Qiu, J., Fu, J., Chen, Z., He, Y. Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks. J. Vis. Exp. (154), e60545, doi:10.3791/60545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter