Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

doi: 10.3791/60546 Published: March 26, 2020
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מתארים טכניקה כדי לכמת את שלמות המכשול של אורגנואידים מעיים קטנים. העובדה כי השיטה מבוססת על אורגנואידים חיים מאפשר חקירה רציפה של שלמות מכשול שונים חומרים מודולים או שילובים אותם באופן שנפתר בזמן.

Abstract

אורגנואידים ותרביות תאים תלת ממדיות (3D) מאפשרות חקירה של מנגנונים ביולוגיים מורכבים ותקנות בעלי מבחנה, שבעבר לא הייתה אפשרית ב תרבות התא הקלאסית monolayers. יתר על כן, תרביות תאים מונאולייר טובים במערכות מודל חוץ גופית, אך אינן מייצגות את תהליכי הבידול הסלולריים המורכבים והפונקציות המסתמכות על מבנה תלת-ממדי. זה היה כל כך רחוק אפשרי רק ניסויים בבעלי חיים, אשר הם מפרך, זמן רב, קשה להעריך על ידי טכניקות אופטיות. כאן אנו מתארים את התשובה לכמת לקבוע את שלמות המכשול לאורך זמן בארגון המעי הקטן החיים. כדי לאמת את המודל שלנו, החלת אינטרפרון גמא (IFN-γ) כפקד חיובי עבור הרס המכשול ואורגנואידים נגזר מ IFN-γ קולטן 2 להפיל עכברים כפקד שלילי. הקביעה אפשרה לנו לקבוע את ההשפעה של IFN-γ על שלמות מחסום המעי ואת השפלה IFN-γ המושרה של חלבונים הצומת הדוקה-2,-7, ו-15. ניתן להשתמש ביכולת זו גם כדי לחקור את ההשפעה של תרכובות כימיות, חלבונים, רעלים, חיידקים, או בדיקה הנובעת מהמטופל על שלמות מחסום המעי.

Introduction

השלמות של המכשול האפיתל מתוחזק על ידי הקומפלקס פסגה junctional (ajc), אשר מורכב הצומת הדוק (TJ) ו לדבקות צומת (AJ) חלבונים1. מבנה מקוטב של AJC הוא חיוני עבור תפקידה בvivo. דיסרגולציה של AJC קיים במחלות שונות, והוא חשוד להיות הגורם המניע החשוב של פתוגנזה דלקתיות המעי. אובדן תפקוד מחסום המעיים מייצג את האירוע היוזם של המחלה. הטרנסלוקציה הבאה של חיידקים הקומנדציית ותגובות דלקתיות הם ההשלכות הכואבת2.

שונים בתוך מבחנה ומודלים vivo פותחו כדי לחקור את הרגולציה של AJC. השיטת Transwell מבוססת על דו מימדי (2D) תא מונאולאיירס שנגזר קווי הגידול בתאים. מערכות אלו טובות להעריך על ידי שיטות אופטיות וביוכימיות ולאפשר ניתוח של דגימות רבות באותו זמן, אך חוסר תכונות רבות של תאים ראשוניים ותהליכי בידול נוכח vivo. חקירת שלמות המכשול אפשרית גם במודלים לבעלי חיים. בניסויי מסופים, ניתן לכמת את ההשפעות של טיפולים ספציפיים בvivo על החדירות של המעי המלא. עם זאת, מודלים אלה דורשים מספר רב של בעלי חיים, והם אינם מאפשרים הדמיה מפורטת של התהליכים המולקולריים הבסיסיים. כיום שיפור תלת-ממד במודלים חוץ גופית זמינים כי הדוק באופן מידי מבנה תא בידול התאים, הקיטוב התא, ולייצג את המבנה קריפטה-villus של המעי3. היישום של אורגנואידים מעיים תלת-ממדיים עבור ניתוחים פונקציונליים דורש הסתגלות של שיטות זמינות מדגמי 2D. כאן אנו מתארים מודל לחקור שלמות מכשול העיכול בחיים מעיים קטנים בתוך המעי. המנה הוקמה כדי לחקור את ההשפעה של IFN-γ על שלמות המכשול ההתאמה הצמודה חלבונים8.

בניגוד לטכניקה להחיל על ידי לזלי4, זיגtek5, או פירס6, אשר מודד את הקרינה הפלואורסצנטית לאחר הסרת לוציפר צהוב (LY) מן המדיום, הגישה שלנו מאפשר כימות של ספיגת הלומיאל של fluorophore לאורך זמן. לפיכך, התוצאה מייצגת את האפשרות לספיגת הקינטי ושיטת הפעולה שלנו מאפשרת יישום של גירויים או מעכבי נוספים במהלך הניסוי. העובדה כי שניהם בחני למדוד את ספיגת מהצד החיצוני בזלת הצלעות אל פני השטח הפנימי פסגה הוא בניגוד ברור למצב vivo. במודל המתואר על ידי היל et al.7, נושא זה חקר. הקרינה הפלואורסצנטית. הייתה כמותית כיוון הדיפוזיה מייצג את הכיוון הקיים בvivo. המאמץ הטכני של מיקרוהזרקה מפחית בבירור את התפוקה של שיטה זו. בניגוד למודל המתואר כאן, שיטת המיקרו-הזרקה מאפשרת את מדידת ההשפעות הדורשות הפעלה ביולוגית על פני השטח האפיתל האפיפיורי.

מודל שלמות המכשול האורגואיד המוצג כאן מבוסס על מיקרוסקופ תאים חי ומאפשר ניתוח של שינויים דינמיים בתוך רגולציה AJC לאורך זמן. ניתן להחיל את ההתקנה על מנת לבחון את ההשפעה הפרמקולוגית של חומרים הגורמים לפגיעה בשלמות מחסום המעי. יתרה מזאת, דגמים מבוססי אורגנואיד מסייעים בהפחתת מספר בעלי החיים המשמשים למחקרים פרמקולוגיים.

Protocol

כל השלבים הושלמו בהתאם ובציות לכל ההנחיות הרלוונטיות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים.

1. ציפוי אורגנואידים

  1. לבודד אורגנואידים כמתואר בעבר3. ההליך מתואר בקצרה להלן.
    1. לאסוף את המעי הקטן מעכברים.
    2. פתח את המעי הקטן longitudinally ולהסיר טיפים villi ידי גירוד את רקמת המעי הפנימי עם שמיכות.
    3. חותכים את רקמת המעי בחתיכות קטנות באמצעות מספריים.
    4. רוחצים את החתיכות 5x בתמיסת מלח באגירה קרה (PBS) על ידי ליטוף החלקים 10x למעלה ולמטה עם פיפטה 25 מ ל.
    5. מודטת את חתיכות הרקמה בתמיסה 2 mM EDTA בקרח במשך 30 דקות על פלטפורמת טלטול אופקי. לאפשר את חתיכות הרקמה למשקעים.
    6. החלף את פתרון ה-EDTA עם מאגר PBS ברגע שחתיכות הרקמה מתפשרים בתחתית. השמט את הסופרנטאנט והוסף 20 מ ל של PBS.
    7. שחררו את קריפפי המעי מהרקמה על-ידי פיליטוף במרץ 10x למעלה ולמטה באמצעות מפית של 10 מ ל.
    8. לאסוף את supernatant ב צנטריפוגה צינורות ולבדוק את זה על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. כדי לעשות זאת, להוסיף טיפה של supernatant ללוח 96 היטב של תרבות התא. . שמרו על צנטריפוגה צינורות בקרח
    9. חזור על שלבים 1.1.6 – ה1.1.8 עד למספר הקריפטטים של המעי-שננט שנאסף.
    10. להעביר את השברים המכילים את הקריפטטים ביותר באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר.
    11. צנטריפוגה את ההשעיה קריפטה ב 300 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות.
    12. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-PBS הקרה כדי לשטוף את הקריפטטים. לאחר מכן חזור על השלב הצנטריפוגה כפי שמתואר ב1.1.11.
    13. להשעות את הגלולה בסכום כולל של 25 μL לכל טוב של 1:1 תערובת של פתרון מטריצה התא ובינוניות התרבות מוראיד בינונית ולוחית של האורגנואידים בלוחות התרבות התאים 48.
    14. מודטה את האורגנואידים ב 37 ° c, 5% CO2, עבור 20 דקות כדי לאפשר פתרון מטריקס התא כדי לגבש.
    15. לכסות את האורגנואידים עם 300 μL של מדיום אורגנואיד מוראיד לכל טוב.
    16. תרבות האורגנואידים ב-37 ° c, 5% CO2, שינוי המדיום כל 2 – 3 ימים.
    17. השתמש באורגנואידים לניסויים לאחר 7 ימי תרבות.
  2. הכן את האורגנואידים. למדידת שלמות המכשול
    1. Precoat עיל כל צינורות צנטריפוגה שישמשו לאחסון האורגנואידים במהלך תהליך הציפוי עם אלבומין סרום השור (BSA) על ידי הוספת מספיק של 0.1% BSA הפתרון ב-PBS לכסות את כל משטחי הפלסטיק. ואז להסיר את הפתרון BSA שוב ולאחסן את הצינורות צנטריפוגה על הקרח.
    2. הפשרת הפתרון של מטריצת התאים ובינוניות של תרבות ארגונית על הקרח.
  3. כדי להפריד את האורגנואידים, להסיר בזהירות את בינונית התרבות ולהשעות מחדש את האורגנואידים מבאר אחת של 48 צלחת הבאר ב-1 מ ל של הקרה PBS. מתמוסס את מטריצת התא על ידי ליטוף נמרץ. תמיד לשמור על ההשעיה אורגאיד ב צנטריפוגה צינורות מראש עם BSA ותמיד לשמור על קרח.
    הערה: צפיפות, גודל, ומיקום של האורגנואידים בתוך שקופית שמיכות השינה מושפעים יחס מפוצל, ריכוז פתרון מטריצה התא, וטיפול של השעיית מטריצה התא האורגאידית. מומלץ לתרגל את הטיפול בפתרון מטריצת התא מראש. בדרך כלל שמונה שמיכות זכוכית היטב מתאימים את הצורך. אורגנואידים נגזר מבאר אחת של confluent 48 צלחת הבאר ניתן לפצל לשתי בארות של שמונה שמיכות היטב שחור (40 μL של מטריצה תא מטריקס-cell לכל טוב).
  4. צנטריפוגה את ההשעיה אורגאיד ב 300 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות.
  5. והשהה מחדש את הגלולה. עם 1 מ ג של הצטננות
  6. צנטריפוגה את ההשעיה אורגאיד ב 300 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  7. להיפטר supernatant לחלוטין ולהשעות מחדש את האורגנואידים נגזר מבאר אחת מ 48 צלחת הבאר ב 40 μL של בינוני קר. קטע של מבנים אורגנואיד גדולים על ידי ליטוף ההשעיה ארגונית 5x דרך 10 μl לדקה עצה כדי לאסוף מבנים עם גודל של 40 – 60 יקרומטר עבור זריעה.
    הערה: השתמש בטיפ 10 μL בעצת פיפטה 100 μL עבור הפיצול של המבנים האורגאידים, והתרגול שלב 1.7 מראש כדי להבטיח תוצאות עקביות. שלוט בגודל האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בתוך צינור הצנטריפוגה. ודא כי אין יותר אורגנואידים מרובים בהווה וכי שברי האורגנואיד הם בערך 40 – 60 יקרומטר ארוך.
  8. לאחר האורגנואידים השיגו את הגודל הרצוי, לערבב אותם עם 40 μL של פתרון מטריצה התא (בינוני: פתרון מטריצה התא = 1:1).
    הערה: יש לשמור על יחס הפתרון הבינוני לתאי המטריצה באופן קבוע כדי להשיג תוצאות עקביות. דילול הפתרון של מטריצת התא מפחית את הנוקשות של כתם אורגאיד ומשפיע על תכונות הדיפוזיה שלה. השתמשו בטיפים מצוננים לחיות מחמד (-20 ° c) לכל השעיות המכילות פתרון מטריצת תאים.
  9. מקום 40 μL של פתרון מטריצת התא של אורגנואיד-תא הבולם במרכז של כל באר של 8 שמיכות היטב.
  10. שמור את השקופית על חבילת קרח עבור 5 דקות. הדבר משמר את הנוזל הבולם הפנימי של מטריצת התאים ומגביר את הריכוז האורגאיד במשטח הכיסויים על ידי כוח הכבידה.
  11. מודטה עבור 20 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 כדי לאפשר פולימור של בועה מטריצה התא ארגונית.
  12. הוסף 150 μL של בינוני תרבות אורגנואיד לטוב ומארג עבור 24 שעות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 לפני שתמשיך בטיפול ניסיוני.
    1. השתמש בתקופה זו כדי לטפל באורגנואידים ולווסת את שלמות המכשול בהתאם להשערה המדעית המתאימה. עבור שליטה חיובית, לטפל באורגנואידים עבור 48 h עם IFN-γ על מנת לחקור את IFN-γ הקשורות השפלה הצומת הדוק וחדירות להגדיל. לעורר את השליטה החיובית עם 10 U/mL (10 ng/mL) רקומביננטי murine IFN-γ. השאר את האורגנואידים. של אחד שלא מטופל
  13. מארגני תרבות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עד 48 h.

2. שיטת הפראואיפרביליות

  1. הביאו את חדר הדגירה של המיקרוסקופ ל-37 ° c לפחות 2 שעות לפני תחילת הניסוי כדי להפחית את הסחף התרמי תוך הדמיה של האורגנואידים.
  2. הכינו פתרון 100 מ"מ של LY ב-PBS. . החנות על הקרח מוגנת מהאור
  3. הכינו פתרון 200 מ"מ של EGTA ב-PBS. . לאחסן אותו על הקרח
  4. להעביר את שמיכות קאמרית כולל אורגנואידים לתוך החדר דגירה של מיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך ולהפעיל את CO2 דגירה (5%). ודאו שהוא נעול היטב. בתוך הבמה של המיקרוסקופ
  5. שימוש באורגנואידים באחד היטב כהפניה, להתאים את הגדרות ההדמיה של המיקרוסקופ. הוסף LY (3 μL של 100 mM LY ב 150 μL של בינוני) כדי לקבל את הנפח הסופי של 1 mM LY ב 300 μL של בינוני. מודטה על המיקרוסקופ עבור 1 h ולהתאים את המוקד להדמיה של אורגנואידים לומן. הגדר את אנרגיית הלייזר הנדרשת עבור עירור LY (488 nm) ואת הרגישות לזיהוי בהתאמה של המכשיר ולנסות לצלם את הזריחה לולי ב 30-40% מהטווח הדינמי הזמין של המכשיר בשימוש.
    הערה: כוונן את האנרגיה עירור לייזר ויעילות זיהוי על אורגנואידים מטופל 70 דקות לאחר התוספת של LY. ודא כי האנרגיה עירור גבוהה מספיק כדי לקבל תמונה חשופה היטב. כדי למנוע רוויה של הקרינה הפלואורסצנטית בתוך התמונות המיקרוסקופית, מומלץ לכוונן הגדרות אלה לאחר שדיפוזיה LY מגיעה למצב קבוע.
  6. הגדר את מיקום האורגנואידים על-ידי הדמיה חיה של ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC). לנסות אורגנואידים התמונה עם קטרים דומים (80 ± 30 μm) ולהתמקד בפרוסה המרכזית של האורגנואידים לדמות לומן שלהם. להגדיר בערך 10 אורגנואידים בסדר ולנסות תמונה ארגונית בלבד קרוב משטח coverslip עם מבנה כדורי.
    הערה: מספר האורגנואידים הניתנים לדימות לכל הפעלה תלוי במהירות המיקרוסקופ. מומלץ לדמות את האורגנואידים בתוך מרווח של 5 דקות. על מיקרוסקופ רגיל סריקת לייזר, 40 מיקומים בסך הכל הם נקודת התחלה סבירה.
  7. הקלט את הזריחה הDIC ואת הקרינה הרגילה של כל תנוחה כדי לתעד את הצורה והקרינה האוטומטית של האורגנואיד לפני הוספת ה-LY לבארות, המשמשות לצורך שלמות המכשול.
  8. אין להציג את התמונות המוצגות באמצעות מיון אוטומטי גבוה. זה בשל הצטברות של תאים מתים בתוך לומן של אורגאיד, ואת התוצאות של מארגני פלורסנט אוטונואידים קשה לנתח לאחר מכן.
  9. לדלל 3 μL של הפתרון LY מוכן (100 mM LY ב 150 μL של בינוני) ולהוסיף את זה בזהירות לכל טוב מבלי לגעת הcoverslip שמיכות. הריכוז המומלץ של LY לטובה הוא 1 מ"מ. אמצעי האחסון הסופי צריך להיות 300 μL.
  10. בדוק במהירות את המיקוד של המיקומים המוגדרים ותקן במידת הצורך.
    הערה: מפזר במהירות דרך מטריצת התאים. לכן, הדמיה קונפוקלית וקד חייב להיות מופעל בתוך 3 דקות לאחר התוספת של fluorophore.
  11. התחל הדמיה של הזמן במיקרוסקופ. קח תמונה פלואורסצנטית של כל תנוחה כל 5 דקות עבור סך של 70 דקות.
    הערה: האורגנואידים היו מתמונות במרווחי זמן של 5 דקות כדי להמחיש את הספיגה של LY לאורך זמן. כדי למדוד את התמוטטות מחסום המעי, זה מספיק כדי להקליט את הזריחה לפני ו 60 דקות אחרי בתוספת LY ושוב 10 דקות לאחר התוספת של EGTA.
  12. הוסף 3 μL של הפתרון EGTA מוכן גם בלי לגעת הcoverslip שמיכות. הריכוז המומלץ בתוך שמיכות השינה של EGTA הוא 2 מ"מ. אמצעי האחסון הכולל בטוב צריך להיות 300 μL.
  13. . תתחיל לשגות בפעם השנייה הקלט את הזריחה של האורגנואידים המוגדרים שוב עם מרווח של 5 דקות עבור סך של 30 דקות.
  14. התעלם מהכל לפי תקנות הבטיחות המקומיות.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.

3. ניתוח נתונים

  1. רק לנתח את התוצאות של האורגנואידים כי לקח LY לאחר התוספת EGTA.
  2. ניתן לכמת את התוצאות. עם הצילום של פיג'י
  3. קבוצת נתונים פתוחה ב-ImageJ על-ידי לחיצה על קובץ | פתיחה ובחירה של נתוני תמונה. בתיבת הדו הבאה של אפשרויות ייבוא-תבניות, בחר באפשרות הצגת מחסנית עם: Hyperstack.
  4. פתח את האזור של מנהל הריבית (ROI) על-ידי לחיצה על נתח | כלים | רועי מנהל.
  5. ציירו ROI אליפטי על ידי לחיצה על לחצן הבחירה האליפטית בשורת התפריטים imagej. ציירו בחירה המכילה את הלוומן הפנימית של האורגנואיד. לאחר מכן, לחץ על הוסף ב-ROI Manager.
  6. חזור על השלבים עבור שלושה אזורים מייצגים מחוץ לאורגנואיד.
  7. לחצו על ' נתח ' בשורת התפריטים ובחרו ' קבע מדידות'. הפעל ערך אפור ממוצע בלבד והשבת כל מדידה אחרת. לאחר מכן לחץ על אישור.
  8. ודא שכל ROIs נבחרו במנהל הROI. במנהל הROI, לחץ על עוד | ריבוי מידות. בתיבת הדו של האפשרות בחר מדידה של כל הפרוסות [...] ושורה אחת לכל פרוסה. לאחר מכן לחץ על אישור.
  9. בחר את כל הערכים בחלון התוצאות והעתק אותם ליישום גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
    הערה: אם מיקומו של האורגנואיד הוזז במהלך הדימות בזמן ההדמיה, יש לכוונן את ההחזר בהתאם. לשם כך, בחר את ההחזר הנכון במנהל הROI והעבר אותו למיקום החדש. לאחר מכן לחץ על עדכן במנהל הROI. בצע את המדידה עבור כל נקודת זמן בנפרד על-ידי לחיצה על מדידה במנהל הROI, ולאחר מכן עבור לנקודת הזמן הבאה בחלון התמונה באמצעות הסרגל בתחתית. אסוף את כל המדידות בגיליון אלקטרוני. הצורה הבודדת ותנועת האורגנואידים במהלך תקופת ההדמיה מחייבת ניתוח של הנתונים באופן ידני.
  10. לחשב את ערך העוצמה הממוצע של שלושת ROIs מחוץ לאורגנואיד עבור כל נקודת זמן.
  11. לחלק את עוצמת ההחזר של התשואה בתוך לומן של אורגאיד על ידי העוצמה הממוצע של הROI בחוץ ואת העוצמה ממוצע בתוך אורגאיד.
  12. כדי לחשב את העלייה היחסית של הקרינה הפלואורסצנטית אורגנואיד, לחלק את הזריחה היחסית (ראה שלב 3.11) בכל נקודת זמן התמונה על ידי הזריחה היחסית מינימלית.
    הערה: השתמש בזריחה היחסית המינימלית, כי לפעמים הדיפוזיה של הפלואורוורידים יכולה להיות איטית בתחילת הניסוי.

Representative Results

כדי לאמת את היישום של 3D מחלות עכבר מעיים קטנות כמודל לכמת את ההשפעה של תרכובות ויסות שלמות מחסום המעי, החלת IFN-γ. כדי לעשות זאת, אנו מבודדים ומתורבתים אורגנואידים נגזר IFN-γ תגובה פראי ו-IFN-γ-קולטן -2 עכברים, אשר אינם מגיבים ל-IFN-γ8. לאחר הטיפול עבור 48 h עם IFN-γ או PBS (שליטה), כל האורגנואידים נחשפו ל-LY ולאחר מכן על ידי הדיסק המסתובב באופן חי מיקרוסקופית תא לחיות בתוך 5 דקות מרווחי זמן עבור תקופה של 70 דקות. היושרה התפקודית של מחסום המעי במודל זה הביא להדרה של LY מתוך לומן של אורגנואיד בעוד הצטברות intraluminal של הרס LY מסומן של ה-TJ. הנציגה הפלואורסצנטית מיקרוסקופיים תמונות לאחר 70 דקות של דגירה עם LY בבירור להדגים כי הזריחה intraluminal להיות גלוי רק באורגנואידים מן חיות טיפוס פראי שטופלו עם IFN-γ. ב-לא מגורה (PBS) שולטת ולא באורגנואידים נגזר מתוך להפיל בעלי חיים (IFN-γR2ΔIEC, איור 1), לא ניתן למצואהשקפה לאחר 70 דקות.

התוספת של EGTA גורם לפירוק מסוים של שלמות מחסום המעי על ידי ודדתי TJ קופשחקנים. שליטה זו תמיד היה מנוצל בסוף הניסוי כדי להדגים את היכולת של אורגנואיד בהתאמה לקחת את LY (איור 1). אם אין זריחה intraluminal באופן LY זוהה על טיפול EGTA, האורגאיד לא נכלל בניסוי.

להערכה כמותית של התוצאות המיקרוסקופית, הקרינה הפלואורסצנטית נמדדה בתוך לומן האורגנואיד ומחוץ לאורגנואיד. ערכי האינטנסיביות היחסיים חושבו (בתוך הזריחה/זריחה מחוץ לפנים) ומוצגים עבור כל תמונה של נקודת זמן. מומלץ להימנע מדימות של אורגנואידים בגדלים שונים. בחרנו להתמקד באורגנואידים עם קוטר של 80 ± 30 יקרומטר (איור 2). תרשים שרטוט של הפרוטוקול עם תמונות מייצגות מוצג באיור 3. חלק מהבעיות המרכזיות וטכניקות פתרון בעיות מוצגות ונידונות באיור 4.

Figure 1
איור 1: שלמות מחסום המעי ניתן לנתח בתוך מארגני העכבר. אורגנואידים מעיים IFN-γR2WT ו Ifn-γR2ΔIEC היו מתורבתים בנוכחות של ifn-γ עבור 48 h או שאינו מטופל. כדי לחקור את היושרה של מחסום המעי, LY (457 Da) נוספה ותמונות פלורסנט ממוקד נתפסו ב 5 מרווחי זמן עבור סך של 70 min. תמונות הנציג בנקודה זמן 0 דקות, 70 דקות, ולאחר הוספת EGTA מוצגים (ירוק = לוציפר צהוב; סרגל קנה מידה = 20 μm). דמות זו שונתה מברדנבאכר ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מודל שלמות המעיים של מעיים קטנים מספק תוצאות כמותיים. (א) הייתה הזריחה היחידה שנקבעה בתוך ומחוץ לאורגנואיד. ערכי האינטנסיביות היחסיים חושבו (בפנים/בתוך הזריחה מחוץ לפנים) ביחס לחוזק היחסי ההתחלתי + SEM ומוצגים עבור כל נקודת זמן. (ב) התפלגות גודל של אורגנואידים מנותח. כדי להפחית את סטיית התקן ושגיאות עקב שינויים ביחס משטח לנפח, אנחנו רק ניתחו אורגנואידים עם קוטר של 80 ± 30 μm. ערכים ממוצע של קטרים אורגנואיד בהתאמה מוצגים + SD (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). ערכי הקוטר הממוצע לא שונים באופן משמעותי בין הקבוצות השונות (ANOVA בכיוון אחד). (ג) החדירות של האורגנואידים נקבע 70 דקות לאחר התוספת של LY. הוא הוגדר על ידי חלוקת עוצמות הקרינה הפלואורסצנטית לאחר 70 דקות על ידי העוצמות המינימליות היחסיות היחסיים שנמדדו במהלך תקופת התצפית. כל בר מייצג ערכים ממוצע + SD, נמדד 10 אורגנואידים נגזר שני ניסויים עצמאיים (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). IFN-γ הגדיל באופן משמעותי את ספיגת LY רק ב-IFN-γR2WT אורגנואידים. פי-ערך < 0.001 במבחן ה-t של הסטודנט. דמות זו שונתה מברדנבאכר ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרוטוקול סכמטי עם תמונות מייצגות. (א) תיאור סכמטי של השלבים העיקריים של הפרוטוקול. (ב) תמונות מייצגות של השלבים העיקריים של הפרוטוקול. (B1) דימוי מיקרוסקופ DIC של פרוסה מרכזית באמצעות אורגאיד מתאים שנבחר לניתוח חדירות. קו מנוקד מייצג רוחב של 89 μm. (B2) תמונה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של אותו אורגנואיד (B1) לפני הוספת באופן מידי. התמונה מראה את הזריחה האוטומטית של האורגנואיד. (B3) אורגנואיד 70 דקות לאחר הוספת LY. האורגאיד המתואר לא מראה קליטה של LY ולכן תפקוד מכשול שלם. קווים מנוקדים מציגים את ROIs לניתוח נוסף. הומן הפנימי של האורגנואיד ושלושה אזורים מייצגים סביב האורגנואיד מסומנים. ((B4) אורגנואיד לאחר הוספת EGTA. האורגנואיד שמיש לניתוח נוסף משום שהוא מראה ספיגה של LY לאחר הטיפול EGTA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פתרון בעיות בבעיות נפוצות. (א) שולחןעם פתרונות ובעיות נפוצות. (ב) תמונות למופת. (B1) התמונה הDIC של אורגאיד רב-ממדי גדול שאינו מתאים לצורך בטיפול זה. (B2). דמות קונטוידית של אורגאיד המציגה באופן אוטומטי גבוה לפני הוספת LY למדיום. . האורגנואיד לא נכלל בקוונפיקציה (B3) תמונה של מוקד של אורגנואיד המציגה באופן אוטומטי נמוך לפני הוספת LY למדיום. . הקרינה הפלואורסצנטית במקרה הזה ((B4) אורגנואיד מראה לא ספיגה באופן מיני בינונית 30 דקות לאחר הוספת EGTA ולכן נשלל מן הקוונפיקציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מבחן זה מציע טכניקה לחקר שלמות מחסום המעי בתוך אורגנואידים חיים. העניין כולו מבוסס על מיקרונואידים קטנים בעכבר המעי ומיקרוסקופ תא קונפוקלית חי. לכן, חובה לתרגל את הטיפול הנכון באורגנואידים מראש. בבידוד, ניתן לפצל את הארגון באופן שגרתי ולאחסנו על-ידי הקפאת הריפיזציה3,9. עבור הצורך הזה אנו ממליצים לפצל את האורגנואידים 48 h לפני הטיפול מתחיל. תקופה זו מעניקה לאורגנואידים את ההזדמנות לסגור לחלוטין וליצור מבנים כדוריים. הזריעה של האורגנואידים לניסוי הוא צעד קריטי בתוך הסדר. כדי להפחית וריאציות של טיפול פרטני, אנו ממליצים על הליך שגרתי לתהליך הזריעה. שלב זה הוא קריטי, ופרוטוקול טיפול שגרתי מפחית בבירור את הווריאציות הנסיוניות.

במהלך הליך הזריעה (שלב 1.7) האורגנואידים לקבל מפוצל על ידי העברת העובר חוזר באמצעות מתקן 10 μL סטנדרטי. גודל הנקבוביות של מוצר זה משתנה מחברה לחברה. הליך זה צריך להיות מראש, והתוצאה צריכה תמיד להיבדק על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. ברגע שאורגנואידים השיגו להגיע לגודל הרצוי, לא לשנות את ההליך.

הזריעה של האורגנואידים חייבת להיות ממוטבת ומותאמת לכיוונון המיקרוסקופי הזמין. כדי להיות מסוגל התרבות והתמונה אורגנואידים לפחות 48 h, תא מיקרוסקופ מודנטי הוא נדרש לחלוטין. בחרו שמיכות. שתואמות לדרישות שלכם בזמן זריעת האורגנואידים, הקפידו לרכז את האורגנואידים על משטח הכיסויים. זה אפשרי על ידי שמירה על שמיכות השינה על חבילת קרח עבור 5 דקות לאחר הצבת תא מטריקס-אורגאיד ההשעיה. שלב זה חשוב להגדיל את האיכות של הדמיה של תא קונפוקלית וקד חי. הרזולוציה הצירית ומרחק העבודה של עדשות מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי הוא מוגבל במיוחד. ככל שאתה מביא את הדגימה לעדשה, יותר טוב שאתה יכול לצלם את זה ואת האנרגיה לייזר פחות נדרש כדי להלהיב את הזריחה LY.

פוטומוניות היא סוגיה חשובה כשמדובר במיקרוסקופיה של תאים חיים. בתוך הסדר הזה אנו לא מוציאים אפשרות זו. AJC פונקציונלי נראה על ידי הדרה של LY מתוך לומן של אורגנואיד (איור 1, PBS). התוספת של EGTA בסוף הניסוי גורמת לודדתי של יונים דו-, שהם קופנים עבור חלבונים AJC. LY הוא נשלל מלואיד של אורגנואיד רק באורגנואידים חיוניים עם קומפלקס מורכב AJC פונקציונלי. באופן כללי, ניתן להשתמש במולקולות פלורסנט כדי למדוד את השלמות של מחסום המעי. בחרנו LY במקום fluorophores אחרים בשימוש נפוץ כגון fluorescein בשם תוספי כי אלה מועברים transcellularly בתאי המעיים מן הבסיס אל תא פסגה9. אנחנו גם בחרנו LY בגלל גודלו הקטן. LY יש משקל מולקולרי של 457 Da ולכן מקלה על החקירה של חדירות המכשול עבור מולקולות קטנות. מולקולת פלורסנט יש להיבחר בהתאם השאלה המדעית נחקר. מכיוון שפגמים מצולמים ב-AJC הינם נוכחים, יש לצמצם את האנרגיה עירור הלייזר או להאריך את מרווח ההדמיה. טכניקת הדימות הקונמיקוד המיטבית לצורך שיטה זו מסתובבת במיקרוסקופ דיסקים. מכשירים בהתאמה לאפשר הדמיה קונפוקלית וקד עם זמן חשיפה קצר בכוח לייזר נמוך.

דגמים שונים כבר פותחו כדי ללמוד שלמות מחסום המעי בתוך מבחנה. בעוד השימוש בחני בהתבסס על קו התאים monolayers או ניסויים ב vivo הם מתדרדר, שיטות מבוססות אורגאיד גוברת. בניגוד לשיטות שתוארו בעבר4,5,6,7, השיטה שלנו מאפשרת כימות של תפקוד המכשול לאורך זמן. הדבר מאפשר חשיפה של האורגנואידים לגירויים נוספים במהלך הניסוי. כאן אנו להחיל EGTA כגירוי השני בסוף הניסוי כפקד חיובי.

בניגוד למצב בvivo, בתוך הסדר שלנו מתווסף בתוך המדיום וחודר את האורגאיד מן הצד החיצוני האפיתל בזלת צלעות לכיוון הפנים פסגה לומן. ה-LY קטן ומשמש רק כדי להמחיש את האטימות של מחסום המעי. מולקולות וגירויים כי לווסת את שכבת האפיתל על פני השטח פסגה צריך להיות מוזרק לתוך לומן של אורגנואיד7. כדי להקטין את המאמץ הניסיוני ולהיות מסוגל למדוד את שלמות המכשול של אורגנואידים רבים באותו זמן, בחרנו להחיל את צבע הפלורסנט מבחוץ.

השתמשנו באותו הסדר כדי לחקור את הפונקציה של IFN-γ על הצומת הצפוף של המעי הקטן אורגנואידים מעיים. העובדה שהצלחנו לנתח את שלמות המכשול באורגנואידים החיים מציעה אפשרויות עתידיות ליישם את הטכניקה הזאת כדי לתאר מעכבי לפירוק הדלקת הנגרמת של מחסום המעי. חומרים לנטרל את התפקוד המכשול לקוי הנגרם על ידי IFN-γ יכולים להיות מועמדים לטיפול במחלות מעיים דלקתיות, שבו ליקויי תפקוד המכשול הוא אחד הגורמים הפתוגניים10.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מקרן המחקר הגרמני (DFG) [KFO257, פרוייקט 4 לטרשת נפוצה ופרוייקט 1 עד רדיו אזרחי; FOR2438, פרוייקט 2 לטרשת נפוצה וE.N. ופרוייקט 5 לרדיו אזרחי; SFB1181 פרוייקט C05 to רדיו אזרחי; TRR241, פרוייקט A06 לN.B.L. וטרשת נפוצה, project A03 לרדיו אזרחי, BR5196/2-1 עד N.B.L. ו-BE3686/2 ל-רדיו אזרחי]; המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) של המרכז הקליני ארלנגן (ל טרשת נפוצה, E.N. ו-מ ב), ה-W. לוץ Stiftung (ל טרשת נפוצה) ו-Forschtok Medizin של המרכז הקליני ארלנגן (ל טרשת נפוצה). העבודה הנוכחית בוצעה (חלקית) הגשמת הדרישות להשגת תואר ד ר. מד של מרקו ברדנשואכר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well culture plate Thermo Fisher Scientific #150687
8-well chamber slides Ibidi #80826
96-well culture plate Greiner Bio-One #655101
Axio Observer.Z1 - spinning disc Zeiss excitation laser 488 nm / emission filter 525/25
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell strainer Falcon 352350
Centrifugation tube 15 mL Thermo Fisher Scientific 11507411
Centrifugation tube 50 mL Thermo Fisher Scientific 10788561
EDTA Sigma-Aldrich 431788-25g
EGTA Sigma-Aldrich 431788
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich L0259
Matrigel, growth factor reduced, phenol red free Corning 356231 Cell matrix solution
Mice The Jackson Laboratory M. musculus C57/Bl6
Microscope coverslip 24 mm x 60 mm
Organoid Growth Medium mouse Stemcell Technologies #06005
Phosphate buffered saline Biochrom L182-05
Recombinant murine IFN-γ Biolegend Cat#575304

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).
  2. Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20, (1), 91-99 (2014).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  4. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83, (1), 138-145 (2015).
  5. Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5, (1), 16831 (2015).
  6. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16, (1), 19 (2018).
  7. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
  8. Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
  9. Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22, (3), 330-331 (1999).
  10. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews: Immunology. 9, (11), 799-809 (2009).
חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardenbacher, M., Ruder, B., Britzen-Laurent, N., Naschberger, E., Becker, C., Palmisano, R., Stürzl, M., Tripal, P. Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids. J. Vis. Exp. (157), e60546, doi:10.3791/60546 (2020).More

Bardenbacher, M., Ruder, B., Britzen-Laurent, N., Naschberger, E., Becker, C., Palmisano, R., Stürzl, M., Tripal, P. Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids. J. Vis. Exp. (157), e60546, doi:10.3791/60546 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter