Summary
Her beskriver vi en teknikk for å kvantifisere barriereintegriteten til små tarmorganoider. Det faktum at metoden er basert på levende organoider muliggjør sekvensiell undersøkelse av ulike barriere integritet modulerende stoffer eller kombinasjoner derav på en tidsbestemt måte.
Abstract
Organoider og tredimensjonale (3D) cellekulturer tillater undersøkelse av komplekse biologiske mekanismer og forskrifter in vitro, som tidligere ikke var mulig i klassisk cellekultur monolayers. Videre er monolayer cellekulturer gode in vitro-modellsystemer, men representerer ikke de komplekse cellulære differensieringsprosessene og funksjonene som er avhengige av 3D-struktur. Dette har så langt bare vært mulig i dyreforsøk, som er arbeidskrevende, tidkrevende og vanskelig å vurdere ved optiske teknikker. Her beskriver vi en analyse for å kvantitativt bestemme barriereintegriteten over tid i å leve små tarmmusorganoider. For å validere vår modell, brukte vi interferon gamma (IFN-γ) som en positiv kontroll for barriereødeleggelse og organoider avledet fra IFN-γ reseptor 2 slå ut mus som en negativ kontroll. Analysen tillot oss å bestemme virkningen av IFN-γ på tarmbarrierenintegritet og IFN-γ indusert nedbrytning av de stramme koblingsproteinene claudin-2, -7 og -15. Denne analysen kan også brukes til å undersøke virkningen av kjemiske forbindelser, proteiner, toksiner, bakterier eller pasientavledede sonder på tarmbarrierens integritet.
Introduction
Integriteten til epitelbarrieren opprettholdes av det apikale junctional-komplekset (AJC), som består av tett veikryss (TJ) og festekrysset (AJ) proteiner1. Den polariserte strukturen til AJC er avgjørende for sin funksjon in vivo. Dysregulering av AJC er tilstede i ulike sykdommer og mistenkes for å være en viktig utløser av inflammatorisk tarmpatogenese. Tap av tarmbarrierefunksjon representerer den initierende hendelsen av sykdommen. Følgende translokasjon av kommensale bakterier og inflammatoriske reaksjoner er de smertefulle konsekvensene2.
Ulike in vitro- og in vivo-modeller er utviklet for å undersøke forskriften av AJC. Transwell-analysen er basert på todimensjonale (2D) cellemonolag som ble avledet fra tumorcellelinjer. Disse systemene er gode å vurdere ved optiske og biokjemiske metoder og muliggjøre analyse av mange prøver samtidig, men mangler mange funksjoner i primære celler og differensieringsprosessene som finnes i vivo. Å undersøke barriereintegriteten er også mulig i dyremodeller. I terminaleksperimenter kan effekten av spesifikke behandlinger in vivo på permeabiliteten til hele tarmen kvantifiseres. Disse modellene krever imidlertid et stort antall dyr, og de tillater ikke detaljert visualisering av de underliggende molekylære prosessene. I dag forbedret 3D in vitro modeller er tilgjengelige som nøye rekapitulere celle differensiering prosesser, celle polarisering, og representerer krypt-villus strukturen i tarmen3. Anvendelsen av 3D intestinalorganoider for funksjonelle analyser krever tilpasning av tilgjengelige metoder fra 2D-modeller. Her beskriver vi en modell for å undersøke tarmbarriereintegritet i levende små tarmmusorganoider. Analysen ble etablert for å undersøke effekten av IFN-γ på barriereintegriteten og respektive stramme koblingsproteiner8.
I motsetning til teknikken som brukes av Leslie4, Zietek5, eller Pearce6, som måler fluorescens etter å ha fjernet lucifer gul (LY) fra mediet, tillater vår tilnærming kvantifisering av luminal opptaket av fluorofanforen over tid. Derfor representerer resultatet et dynamisk opptak kinetisk og vår analyse gjør det mulig å bruke flere stimuli eller hemmere i løpet av eksperimentet. Det faktum at begge analysene måler opptaket fra utsiden basolateral side til innsiden apical overflaten er i klar kontrast til situasjonen in vivo. I en modell beskrevet av Hill et al.7, ble dette emnet utforsket. Ved mikroinjeksjon av fluoroforforen i organoidlumen ble fluorescensen kvantifisert. Retningen av diffusjon representerer retningen som finnes i vivo. Den tekniske innsatsen for mikroinjeksjon reduserer tydelig gjennomstrømningen av denne metoden. I motsetning til modellen som er beskrevet her, gjør mikroinjeksjonsmetoden det mulig å måle effekter som krever biologisk aktivering på den apikale epiteloverflaten.
Organoid barriere integritet modellen presentert her er basert på live celle mikroskopi og muliggjør analyse av dynamiske endringer i AJC-forskriften over tid. Oppsettet kan brukes til å teste den farmakologiske virkningen av stoffer som induserer og hemmer integriteten til tarmbarrieren. Videre bidrar organoidbaserte modeller til å redusere antall dyr som brukes til farmakologiske studier.
Protocol
Alle tiltak ble fullført i samsvar med alle relevante retningslinjer for forskrifter og institusjonell dyrepleie.
1. Plating av organoider
- Isolere organoider som beskrevet tidligere3. Prosedyren er kort beskrevet nedenfor.
- Samle tynntarmen fra mus.
- Åpne tynntarmen langsgående og fjern villi tips ved å skrape det indre tarmvevet med en coverslip.
- Skjær tarmvevet i små biter ved hjelp av saks.
- Vask stykker 5x i kald fosfatbufret saltvann (PBS) ved å pipe bitene 10x opp og ned med en 25 ml pipette.
- Inkuber vevsbitene i kald 2 mM EDTA-løsning på is i 30 min på en horisontal ristingsplattform. La vevsbitene sediment.
- Skift ut EDTA-løsningen med PBS-bufferen når vevsbitene legger seg nederst. Kast supernatanten og tilsett 20 ml PBS.
- Slipp tarmkryptene fra vevet ved kraftig pipettering 10x opp og ned med en 10 ml pipette.
- Samle supernatanti sentrifugeringsrør og inspiser det etter fasekontrastmikroskopi. For å gjøre dette, legg til en dråpe av supernatanten til en 96 brønncellekulturplate. Hold sentrifugeringsrør på is.
- Gjenta trinn 1.1.6–1.1.8 til antall tarmkrypter i den oppsamlede supernatanten minker.
- Pass fraksjonene som inneholder de fleste kryptene gjennom en 70 μm cellesil.
- Sentrifuge krypten suspensjon på 300 x g, 4 °C i 5 min.
- Kast supernatanten og resuspend pellet en kald PBS for å vaske kryptene. Gjenta deretter sentrifugeringstrinnet som beskrevet i 1.1.11.
- Resuspendpellet i totalt 25 μL per brønn av en 1:1 blanding av cellematriseløsning og murine organoid kulturmedium og plate organoids i en 48 brønncellekulturplater.
- Inkuber organoidene ved 37 °C, 5 % CO2, i 20 minutter for å la cellematriseløsningen stivne.
- Dekk organoidene med 300 μL murine organoidmedium per brønn.
- Kultur organoider ved 37 °C, 5% CO2,endre mediet hver 2-3 dager.
- Bruk organoider for eksperimenter etter 7 dager med kultur.
- Forbered organoidene for barriereintegritetsmålingen.
- Precoat alle sentrifugering rør som vil bli brukt til lagring av organoider under plating prosessen med storfe serum albumin (BSA) ved å legge nok av en 0,1% BSA løsning i PBS å dekke alle plastoverflater. Fjern deretter BSA-løsningen igjen og oppbevar sentrifugeringsrørene på is.
- Tin cellematriseløsningen og organoidkulturmedium på is.
- For å skille organoider, fjern nøye kulturmediet og resuspendorganoider fra en brønn av en 48 brønnplate i 1 ml kald PBS. Oppløs cellematrisen ved kraftig pipettering. Hold alltid organoidsuspensjonen i sentrifugeringsrør som er forhåndsbelagt med BSA og alltid holdes på is.
MERK: Tettheten, størrelsen og posisjonen til organoidene i det kamret coverslip-lysbildet påvirkes av det delte forholdet, cellematriseløsningskonsentrasjonen og håndteringen av organoidcellematrisesuspensjonen. Det anbefales å praktisere håndteringen av cellematriseløsningen på forhånd. Vanligvis er åtte godt kamret glass coverslips egnet for analysen. Organoider avledet fra en brønn av en confluent 48 brønnplate kan deles inn i to brønner av en åtte godt kamret coverslip (40 μL av organoid-celle matrise pellet per brønn). - Sentrifuge organoid suspensjon ved 300 x g ved 4 °C i 5 min.
- Kast forsiktig supernatanten og resuspend pellet en 1 ml kald PBS.
- Sentrifuge organoid suspensjon ved 300 x g, 4 °C i 5 min.
- Kast supernatanten helt og resuspend organoider avledet fra en brønn fra en 48 brønnplate i 40 μL kaldt medium. Fragmenter store organoidstrukturer ved å pipetting organoid suspensjon 5x gjennom en 10 μL pipette tips for å samle strukturer med en størrelse på 40-60 μm for seeding.
MERK: Bruk 10 μL-spissen på en 100 μL pipettespiss for fragmentering av organoidstrukturene, og øv trinn 1.7 på forhånd for å sikre konsistente resultater. Kontroller størrelsen på organoidene ved fasekontrastmikroskopi i sentrifugeringsrøret. Sørg for at det ikke finnes flere flerforgrenede organoider og at organoidfragmentene er omtrent 40–60 μm lange. - Når organoidene har fått ønsket størrelse, bland dem med 40 μL av cellematriseløsningen (medium:cellematriseløsning = 1:1).
MERK: Forholdet mellom middels til celle matrise må holdes konstant for å oppnå konsistente resultater. Fortynning av cellematriseløsningen reduserer stivheten i organoidbloben og påvirker dens diffusjonsegenskaper. Bruk forhåndskjølte rørtips (-20 °C) for alle suspensjoner som inneholder cellematriseoppløsning. - Plasser 40 μL av organoid-celle matrise oppløsning suspensjon i midten av hver brønn av en 8 godt kamret coverslip.
- Hold skysen på en ispakke i 5 min. Dette bevarer cellematriseorganoid suspensjon væske og øker organoid konsentrasjon på coverslip overflaten av tyngdekraften.
- Inkuber i 20 min ved 37 °C og 5 % CO2 for å muliggjøre polymerisering av organoidcellematrisebloben.
- Tilsett 150 μL organoid kulturmedium per brønn og inkuber i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2 før du fortsetter med eksperimentell behandling.
- Bruk denne perioden til å behandle organoider og modulere deres barriereintegritet i henhold til den tilsvarende vitenskapelige hypotesen. For positiv kontroll, behandle organoider for 48 h med IFN-γ for å undersøke IFN-γ assosiert tett kryssnedbrytning og permeabilitet søkning. Stimulere den positive kontrollen med 10 U/ml (10 ng/ml) rekombinant murine IFN-γ. La organoidene til en godt ubehandlet.
- Kultur organoider ved 37 °C og 5% CO2 for opptil 48 timer.
2. OrganoidPermeability analyse
- Ta inkubasjonskammeret til mikroskopet til 37 °C minst 2 timer før du starter forsøket for å redusere termisk drift mens du avbildning av organoidene.
- Forbered en 100 mM løsning av LY i PBS. Oppbevares på is beskyttet mot lys.
- Forbered en 200 mM-løsning av EGTA i PBS. Oppbevar den på is.
- Overfør den kamret dekkslip inkludert organoider inn i inkubasjonskammeret i et invertert konfokalmikroskop og slå på CO2 inkubasjon (5%). Kontroller at den kamret dekselslip er tett låst i scenen av mikroskopet.
- Ved hjelp av organoider i en brønn som en referanse, juster bildeinnstillingene til mikroskopet. Tilsett LY (3 μL 100 mM LY i 150 μL medium) for å oppnå et endelig volum på 1 mM LY i 300 μL medium. Inkuber på mikroskopet i 1 h og juster fokuset for avbildning av organoidenes lumen. Definer den nødvendige laserenergien for LY-eksitasjon (488 nm) og den respektive deteksjonsfølsomheten til instrumentet, og prøv å bilde LY-fluorescensen ved 30–40 % av det tilgjengelige dynamiske området til instrumentet som brukes.
MERK: Juster lasereksitasjonsenergien og deteksjonseffektiviteten på ubehandlede organoider 70 min etter tilsetning av LY. Sørg for at eksitasjonsenergien er høy nok til å få et godt eksponert bilde. For å unngå metning av LY fluorescens i de mikroskopiske bildene, anbefales det å justere disse innstillingene etter at LY-spredningen når en jevn tilstand. - Definer posisjonen til organoidene ved differensialinterferenskontrast (DIC) levende bildebehandling. Prøv å bilde organoider med sammenlignbare diametre (80 ± 30 μm) og fokus på den sentrale delen av organoider for å bilde deres lumen. Definer omtrent 10 organoider per brønn og prøv å bilde bare organoider nær dekkslipoverflaten med en sfærisk struktur.
MERK: Antall organoider som kan avbildes per kjøring avhenger av mikroskopets hastighet. Det anbefales å bilde organoider innen 5 min intervall. På et vanlig laserskanningsmikroskop er 40 stillinger totalt et rimelig utgangspunkt. - Registrer DIC og LY fluorescens av hver posisjon for å dokumentere organoidform og autofluorescens før du legger LY til brønnene, som brukes til barriereintegritetsanalysen.
- Ikke bilde organoider som viser høy autofluorescens. Dette skyldes akkumulering av døde celler i organoidlumen, og resultatene av autofluorescerende organoider er vanskelige å analysere etterpå.
- Fortynn 3 μL av den tilberedte LY-oppløsningen (100 mM LY i 150 μL medium) og tilsett dette nøye til hver brønn uten å berøre den kamret dekkslip. Den anbefalte konsentrasjonen av LY per brønn er 1 mM. Det endelige volumet per brønn bør være 300 μL.
- Kontroller raskt fokuset på de definerte posisjonene og korriger om nødvendig.
MERK: LY sprer seg raskt gjennom cellematrisen. Derfor må konfokalavbildningen startes innen 3 min etter tilsetning av fluoroforen. - Start en tidsforløpsavbildning på mikroskopet. Ta et fluorescensbilde av hver posisjon hver 5.
MERK: Organoidene ble avbildet i 5 min intervaller for å visualisere LY-opptaket over tid. For å måle tarmbarrierenedbrytningen er det tilstrekkelig å registrere fluorescensen før og 60 minutter etter LY-tillegg og igjen 10 min etter tilsetning av EGTA. - Tilsett 3 μL av den tilberedte EGTA-oppløsningen per brønn uten å berøre den kamret dekselslip. Den anbefalte konsentrasjonen i den kamret dekkslip av EGTA er 2 mM. Det totale volumet per brønn bør være 300 μL.
- Start en ny time-lapse. Registrer fluorescensen til de definerte organoidene igjen med et intervall på 5 min i totalt 30 min.
- Kast alt i henhold til lokale sikkerhetsforskrifter.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
3. Dataanalyse
- Bare analysere resultatene av organoider som tok opp LY etter EGTA tillegg.
- Resultatene kan kvantifiseres med Fiji ImageJ.
- Åpne datasett i ImageJ ved å klikke fil | Åpne og velg bildedata. I dialogboksen Følgende alternativer for import av BIO-formater velger du Vis stakk med: Hyperstack.
- Åpne region av interesse (ROI) manager ved å klikke Analyser | Verktøy | avkastning manager.
- Tegn en oval avkastning ved å klikke på Oval valg-knappen på ImageJ-menylinjen. Tegn et utvalg som inneholder den indre lumen i organoiden. Trykk deretter på Legg til i AVKASTNINGsbehandling.
- Gjenta trinnene for tre representative områder utenfor organoid.
- Klikk på Analyser på menylinjen, og velg Angi mål. Aktiver bare Mean Gray Value og deaktiver andre målinger. Klikk deretter OK.
- Kontroller at alle ROIer er valgt i ROI Manager. I ROI Manager klikker du mer | Multi mål. I alternativdialogboksen velger du Mål alle [...] skiver og En rad per skive. Klikk deretter OK.
- Velg alle verdiene i Resultater-vinduet, og kopier dem til et regnearkprogram for videre analyse.
MERK: Hvis organoidens posisjon beveget seg under bildebehandlingen, må avkastningen justeres tilsvarende. Hvis du vil gjøre dette, velger du riktig avkastning i roi-lederen og flytter den til den nye posisjonen. Klikk deretter Oppdater i ROI-behandling. Utfør målingen for hvert tidspunkt individuelt ved å klikke Mål i roi-lederen, og bytt deretter til neste tidspunkt i bildevinduet ved hjelp av linjen nederst. Samle alle målinger i et regneark. Den individuelle formen og bevegelsen av organoider i bildeperioden krever analyse av dataene på en manuell måte. - Beregn gjennomsnittlig intensitetsverdi for de tre ROIene utenfor organoiden for hvert tidspunkt.
- Del intensiteten av avkastningen inne i organoidlumen med gjennomsnittlig intensitet av avkastningen utenfor og gjennomsnittlig intensitet inne i organoiden.
- For å beregne den relative økningen av luminal organoid fluorescens, dele den relative fluorescens (se trinn 3.11) ved hvert tidspunkt avbildet av minimal relativ fluorescens.
MERK: Bruk den minimale relative fluorescensen, fordi noen ganger kan spredningen av fluoroforen være treg i begynnelsen av eksperimentet.
Representative Results
For å validere anvendelsen av 3D små tarmmusorganoider som modell for å kvantifisere effekten av forbindelser som regulerer tarmbarrierens integritet, brukte vi IFN-γ. For å gjøre dette isolerte vi og kultiverte organoider avledet fra IFN-γ responsive villtype og IFN-γ-receptor-2 knockout mus, som ikke reagerer på IFN-γ8. Ved behandling i 48 timer med IFN-γ eller PBS (kontroll) ble alle organoider utsatt for LY og avbildet av konfokal spinning plate levende cellemikroskopi i 5 min intervaller i en periode på 70 min. Den funksjonelle integriteten til tarmbarrieren i denne modellen resulterte i utelukkelse av LY fra organoidlumen mens intraluminal akkumulering av LY betegnet ødeleggelse av TJ. Den representative fluorescensmikroskopiske bilder etter 70 min inkubasjon med LY viser tydelig at intraluminal LY fluorescens var bare synlig i organoider fra villtype dyr behandlet med IFN-γ. I ustimulerte (PBS) kontroller eller i organoider avledet fra knock out dyr (IFN-γR2ΔIEC, Figur 1),var det ingen intraluminal LY fluorescens til etter 70 min.
Tillegg av EGTA forårsaker en uspesifikk nedbrytning av tarmbarriereintegriteten ved å sequestering TJ-kofaktorer. Denne kontrollen ble alltid benyttet på slutten av forsøket for å demonstrere evnen til de respektive organoid å ta opp LY (Figur 1). Hvis ingen intraluminal LY fluorescens ble oppdaget ved Behandling med EGTA, ble organoiden ekskludert fra forsøket.
For den kvantitative evalueringen av de mikroskopiske resultatene ble LY fluorescens målt i organoidlumen og utsiden av organoiden. Relative intensitetsverdier ble beregnet (fluorescens inne/ fluorescens utenfor + innsiden) og vises for hvert tidspunkt avbildet. Det anbefales å unngå avbildning av organoider av varierende størrelse. Vi valgte å fokusere på organoider med en diameter på 80 ± 30 μm (figur 2). En skjematisk protokoll med representative bilder vises i figur 3. Noen store problemer og feilsøkingsteknikker vises og diskuteres i figur 4.
Figur 1: Tarmbarriereintegritet kan analyseres i museorganoider. Intestinalorganoider fra IFN-γR2WT og IFN-γR2ΔIEC ble dyrket i nærvær av IFN-γ i 48 timer eller ubehandlet. For å undersøke integriteten til tarmbarrieren ble LY (457 Da) lagt til og konfokale fluorescerende bilder ble tatt i 5 min intervaller i totalt 70 min. Representative bilder på tidspunktet 0 min, 70 min, og etter tillegg av EGTA er vist (grønn = Lucifer gul; Skalabar = 20 μm). Dette tallet er endret fra Bardenbacher et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Liten intestinal organoid barriere integritet modell gir kvantitative resultater. (A) LY fluorescens ble bestemt i og utenfor organoid. Relative intensitetsverdier ble beregnet (innvendig/fluorescens utenfor + innsiden) i forhold til den opprinnelige relative intensiteten + SEM og vises for hvert tidspunkt. (B) Størrelsefordeling av analyserte organoider. For å redusere standardavviket og feilene på grunn av endringer i overflate-til-volum-forholdet, analyserte vi bare organoider med en diameter på 80 ± 30 μm. Gjennomsnittlige verdier for de respektive organoiddiametere vises + SD (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). Gjennomsnittlig diameter verdier ikke varierer betydelig mellom de ulike gruppene (enveis ANOVA). (C) Permeabiliteten til organoidene ble bestemt 70 min etter tilsetning av LY. Det ble definert ved å dele intraluminal fluorescens intensitet etter 70 minutter av minimal relativ fluorescens intensitet målt i observasjonsperioden. Hver stolpe representerer gjennomsnittlige verdier + SD, målt i 10 organoider avledet fra to uavhengige eksperimenter (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). IFN-γ økte kun LY-opptaket i IFN-γR2 WT-organoider.WT p-verdi <0.001 i studentens t-test. Dette tallet er endret fra Bardenbacher et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk protokoll med representative bilder. (A) Skjematisk beskrivelse av de viktigste trinnene i protokollen. (B) Representative bilder av de viktigste trinnene i protokollen. Jeg har ikke noe å si tildeg. DIC mikroskopi bilde av en sentral skive gjennom en passende organoid som ble valgt for permeabilitet analyse. Den stiplede linjen representerer en bredde på 89 μm. (B2) Fluorescensmikroskopibilde av samme organoid i (B1) før du legger til LY. Bildet viser autofluorescensen til organoiden. Jeg har ikke noe å si tildeg. En organoid 70 min etter tilsetning av LY. Den avbildet organoid viser ingen opptak av LY og derfor en intakt barrierefunksjon. Stiplede linjer viser AVKASTNINGEN for videre analyse. Den indre lumen i organoid og tre representative områder rundt organoid er merket. Jeg har ikke noe å si tildeg. En organoid etter tilsetning av EGTA. Organoid en brukerbar for videre analyse fordi det viser LY-opptak etter EGTA-behandlingen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Feilsøking av vanlige problemer. (A) Tabell med vanlige problemer og løsninger. (B) Eksemplariske bilder. Jeg har ikke noe å si tildeg. DIC bilde av en stor multibranched organoid som ikke er egnet for denne analysen. (B2). Konfokal bilde av en organoid som viser høy autofluorescens før LY ble lagt til mediet. Organoiden ble utelukket fra kvantifisering. Jeg har ikke noe å si tildeg. Konfokal bilde av en organoid som viser lav autofluorescens før LY ble lagt til mediet. Fluorescensen ble kvantifisert i dette tilfellet. Jeg har ikke noe å si tildeg. Organoid viser ingen LY-opptak fra mediet 30 min etter tilsetning av EGTA og derfor utelukket fra kvantifisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne analysen tilbyr en teknikk for å studere tarmbarriereintegriteten i levende organoider. Hele analysen er basert på små tarmmusorganoider og konfokal levende cellemikroskopi. Derfor er det obligatorisk å praktisere riktig håndtering av organoider på forhånd. Ved isolasjon kan organoider rutinemessig deles og lagres ved kryofrysing3,9. For denne analysen anbefaler vi å dele organoidene 48 timer før behandlingen startes. Denne perioden gir organoidene muligheten til å helt lukke og danne sfæriske strukturer. Seeding av organoider for eksperimentet er et kritisk skritt i analysen. For å redusere individuelle håndteringsvariasjoner anbefaler vi en rutinemessig prosedyre for seeding-prosessen. Dette trinnet er avgjørende, og en rutinemessig håndteringsprotokoll reduserer helt klart eksperimentelle variasjoner.
Under seeding prosedyren (trinn 1.7) organoider bli fragmentert av repeterende passering gjennom en standard 10 μL pipette tips. Porestørrelsen på dette produktet varierer fra selskap til selskap. Denne prosedyren bør praktiseres på forhånd, og resultatet bør alltid kontrolleres av fasekontrastmikroskopi. Når organoidene oppnådd når ønsket størrelse, må du ikke endre prosedyren.
Seeding av organoider må optimaliseres og tilpasses for tilgjengelig mikroskopisk oppsett. For å kunne kultur og bilde organoider i minst 48 timer, er et inkubert mikroskopkammer helt nødvendig. Velg en kamret coverslip som passer dine behov. Når du ser organoidene, sørg for å konsentrere organoidene på dekkslipoverflaten. Dette er mulig ved å holde kamret coverslip på en ispakke i 5 min etter å ha plassert cellematrise-organoid suspensjon. Dette trinnet er viktig å øke kvaliteten på confocal live celle imaging. Den aksiale oppløsningen og arbeidsavstanden til konfokale mikroskoplinser er spesielt begrenset. Jo nærmere du bringer prøven til linsen, jo bedre kan du se det og jo mindre laserenergi er nødvendig for å opphisse LY fluorescens.
Fototaxier er et viktig problem når det gjelder levende cellemikroskopi. Innenfor denne analysen utelukker vi dette alternativet. En funksjonell AJC er synlig ved utelukkelse av LY fra organoidlumen (Figur 1, PBS). Tillegg av EGTA på slutten av eksperimentet forårsaker sequestering av bivalente ioner, som er kofaktorer for AJC proteiner. LY er utelukket fra organoidlumen bare i vitale organoider med et funksjonelt AJC-kompleks. Generelt kan fluorescerende molekyler brukes til å måle integriteten til tarmbarrieren. Vi valgte LY i stedet for andre vanlige fluoroforer som fluorescein merket dextran fordi de transporteres transcellulært i tarmceller fra basal til det apikale rommet9. Vi valgte også LY på grunn av sin lille størrelse. LY har en molekylvekt på 457 Da og letter derfor utredningen av barrierepermeabiliteten for små molekyler. Det fluorescerende molekylet må velges avhengig av det vitenskapelige spørsmålet som undersøkes. Fordi fototoksiske AJC defekter er til stede, laser eksitasjon energi må reduseres eller bildebehandlingsintervallet forlenges. Den optimale konfokale bildeteknikken for denne analysen er roterende platemikroskopi. Respektive instrumenter muliggjør konfokal avbildning med kort eksponeringstid ved lav lasereffekt.
Ulike modeller er allerede utviklet for å studere tarmbarriereintegritet in vitro. Mens bruken av analyser basert på cellelinje monolayers eller eksperimenter in vivo er fallende, organoid-baserte metoder øker. I motsetning til metoder som tidligere er beskrevet4,5,6,7, tillater vår metode kvantifisering av barrierefunksjon over tid. Dette gjør det mulig å eksponering av organoider til ekstra stimuli i løpet av eksperimentet. Her bruker vi EGTA som en andre stimulans på slutten av eksperimentet som en positiv kontroll.
I motsetning til situasjonen in vivo, i vår analyse LY legges inn i mediet og trenger inn i organoid fra utsiden basolateral epitelside mot innsiden apikal lumen. LY er liten og brukes bare til å visualisere tettheten av tarmbarrieren. Molekyler og stimuli som modulerer epitellaget på den apiske overflaten må injiseres i organoidlumen7. For å redusere eksperimentell innsats og for å kunne måle barriereintegriteten til mange organoider samtidig, valgte vi å bruke fluorescerende farge fra utsiden.
Vi brukte analysen til å undersøke funksjonen til IFN-γ på det stramme krysset mellom små tarmmusorganoider. Det faktum at vi var i stand til å analysere barriereintegriteten i levende organoider gir fremtidige muligheter til å bruke denne teknikken for å beskrive hemmere for betennelsesindusert nedbrytning av tarmbarrieren. Stoffer som motvirker den nedsatte barrierefunksjonen forårsaket av IFN-γ kan være kandidater til behandling av inflammatoriske tarmsykdommer, der nedsatt barrierefunksjon er en av de patogene faktorene10.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra German Research Foundation (DFG) [KFO257, prosjekt 4 til M.S. og prosjekt 1 til C.B.; FOR2438, prosjekt 2 til M.S. og E.N. og prosjekt 5 til C.B.; SFB1181 prosjekt C05 til C.B.; TRR241, prosjekt A06 til N.B.L. og M.S., prosjekt A03 til C.B., BR5196/2-1 til N.B.L. og BE3686/2 til C.B.]; Det tverrfaglige senter for klinisk forskning (IZKF) i Det kliniske senteret Erlangen (til M.S., E.N., og M.B.), W. Lutz Stiftung (til M.S.) og Forschungsstiftung Medizin fra Clinical Center Erlangen (til M.S.). Det nåværende arbeidet ble utført i (delvis) oppfyllelse av kravene for å oppnå graden Dr. Med. av Marco Bardenbacher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
| 96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
| Axio Observer.Z1 - spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Centrifugation tube 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
| Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
| Microscope coverslip | 24 mm x 60 mm | ||
| Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
| Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |
References
- López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 16831 (2015).
- Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
