Summary
Hier beschrijven we een techniek om de barrière-integriteit van kleine darmorganoïden te kwantificeren. Het feit dat de methode is gebaseerd op levende organoïden maakt het sequentiële onderzoek van verschillende barrière-integriteit modulerende stoffen of combinaties daarvan op een tijdopgeloste manier mogelijk.
Abstract
Organoïden en driedimensionale (3D) celculturen maken het mogelijk om complexe biologische mechanismen en voorschriften in vitro te onderzoeken, wat voorheen niet mogelijk was in de monolagen van de klassieke celkweek. Bovendien zijn monolayer celculturen goede in vitro modelsystemen, maar vertegenwoordigen ze niet de. complexe cellulaire differentiatieprocessen en -functies die afhankelijk zijn van 3D-structuur. Dit is tot nu toe alleen mogelijk geweest in dierproeven, die moeizaam, tijdrovend en moeilijk te beoordelen zijn door optische technieken. Hier beschrijven we een test om kwantitatief de barrière-integriteit in de loop van de tijd in levende kleine darmmuis organoïden te bepalen. Om ons model te valideren, hebben we interferon gamma (IFN-γ) toegepast als een positieve controle voor barrièrevernietiging en organoïden afgeleid van IFN-γ receptor 2 knock out muizen als een negatieve controle. De test stelde ons in staat om de impact van IFN-γ op de darmbarrière integriteit en de IFN-γ geïnduceerde afbraak van de strakke junction eiwitten claudin-2, -7 en -15 te bepalen. Deze test kan ook worden gebruikt om de impact van chemische verbindingen, eiwitten, toxines, bacteriën, of patiënt-afgeleide sondes op de darmbarrière integriteit te onderzoeken.
Introduction
Integriteit van de epitheliale barrière wordt gehandhaafd door het apicaljunctionalcomplex (AJC), dat bestaat uit strakke kruising (TJ) en hechtingskruising (AJ) eiwitten1. De gepolariseerde structuur van de AJC is cruciaal voor zijn functie in vivo. Dysregulatie van de AJC is aanwezig in verschillende ziekten en wordt vermoed dat een belangrijke trigger van inflammatoire darmpathogenese. Verlies van darmbarrièrefunctie vertegenwoordigt de initiërende gebeurtenis van de ziekte. De volgende translocatie van commensale bacteriën en ontstekingsreacties zijn de pijnlijke gevolgen2.
Er zijn verschillende in vitro en in vivo modellen ontwikkeld om de regulering van de AJC teonderzoeken. De Transwell-test is gebaseerd op tweedimensionale (2D) celmonolagen die zijn afgeleid van tumorcellijnen. Deze systemen zijn goed te beoordelen door middel van optische en biochemische methoden en maken de analyse van veel monsters op hetzelfde moment, maar missen vele kenmerken van primaire cellen en de differentiatie processen aanwezig in vivo. Het onderzoeken van de barrièreintegriteit is ook mogelijk in diermodellen. In terminale experimenten kunnen de effecten van specifieke behandelingen in vivo op de doorlaatbaarheid van de hele darm worden gekwantificeerd. Deze modellen vereisen echter een groot aantal dieren en ze staan geen gedetailleerde visualisatie van de onderliggende moleculaire processen toe. Tegenwoordig zijn verbeterde 3D in vitro modellen beschikbaar die nauw samenvatten celdifferentiatie processen, cel polarisatie, en vertegenwoordigen de crypt-villus structuur van de darm3. De toepassing van 3D-darmorganoïden voor functionele analyses vereist de aanpassing van de beschikbare methoden uit 2D-modellen. Hier beschrijven we een model om de integriteit van de darmbarrière in levende kleine darmmuizenorganoïden te onderzoeken. De test werd opgericht om het effect van IFN-γ op de barrièreintegriteit en de respectieve strakke verbindingseiwitten8te onderzoeken.
In tegenstelling tot de techniek toegepast door Leslie4, Zietek5, of Pearce6, die fluorescentie meet na het verwijderen van lucifer geel (LY) van het medium, onze aanpak maakt kwantificering van de luminale opname van de fluorophore na verloop van tijd. Daarom vertegenwoordigt het resultaat een dynamische opname kinetische en onze test maakt de toepassing van extra stimuli of remmers in de loop van het experiment. Het feit dat beide tests de opname van de buitenkant basolaterale kant naar het binnenapicale oppervlak meten, staat in schril contrast met de situatie in vivo. In een model beschreven door Hill et al.7, werd dit onderwerp onderzocht. Na micro-injectie van de fluoropforen in het lumen van de organoïde werd de fluorescentie gekwantificeerd. De richting van diffusie vertegenwoordigt de richting aanwezig in vivo. De technische inspanning van micro-injectie vermindert duidelijk de doorvoer van deze methode. In tegenstelling tot het hier beschreven model, maakt de micro-injectiemethode het mogelijk om effecten te meten die biologische activering op het apicale epitheeloppervlak vereisen.
Het hier gepresenteerde organoïde barrièreintegriteitsmodel is gebaseerd op live celmicroscopie en maakt de analyse van dynamische veranderingen binnen de AJC-verordening in de loop van de tijd mogelijk. De opstelling kan worden toegepast om de farmacologische impact van stoffen die de integriteit van de darmbarrière veroorzaken en remmen te testen. Bovendien helpen organoïde-gebaseerde modellen het aantal dieren dat wordt gebruikt voor farmacologische studies te verminderen.
Protocol
Alle stappen zijn voltooid in overeenstemming met en in overeenstemming met alle relevante richtlijnen voor regelgeving en institutionele dierverzorging.
1. Beplating van organoïden
- Isoleer organoïden zoals eerder beschreven3. De procedure wordt hieronder kort beschreven.
- Verzamel de dunne darmen van muizen.
- Open de dunne darmen in de lengterichting en verwijder villi tips door het schrapen van de binnenste darmweefsel met een coverslip.
- Snijd het darmweefsel in kleine stukjes met behulp van een schaar.
- Was stukken 5x in koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door de stukken 10x op en neer te pisen met een 25 mL pipet.
- Incubeer de weefselstukken in koude 2 mM EDTA oplossing op ijs gedurende 30 min op een horizontaal schudplatform. Laat de weefselstukken tot sediment.
- Vervang de EDTA-oplossing door PBS-buffer zodra de weefselstukken zich onderaan nestelen. Gooi de supernatant weg en voeg 20 mL PBS toe.
- Laat de darmcrypten uit het weefsel door krachtig pipetteren 10x op en neer met een 10 mL pipet.
- Verzamel de supernatant in centrifugeren buizen en inspecteer het door fase contrast microscopie. Om dit te doen, voeg een druppel van de supernatant aan een 96 goed cel cultuur plaat. Houd centrifugatiebuizen op ijs.
- Herhaal stap 1.1.6–1.1.8 totdat het aantal darmcrypten in de verzamelde supernatant afneemt.
- Geef de breuken met de meeste crypten door middel van een 70 μm cel zeef.
- Centrifugeer de cryptevering bij 300 x g, 4 °C gedurende 5 min.
- Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in koude PBS om de crypten te wassen. Herhaal vervolgens de centrifugatiestap zoals beschreven in 1.1.11.
- De pellet opnieuw opschorten in een totaal van 25 μL per put van een 1:1 mengsel van celmatrixoplossing en murine organoïde kweekmedium en plaat de organoïden in een 48 goed celkweekplaten.
- Incubeer de organoïden bij 37 °C, 5% CO2, gedurende 20 min om de celmatrixoplossing te laten stollen.
- Bedek de organoïden met 300 μL murine organoïde medium per put.
- Kweek de organoïden op 37 °C, 5% CO2,verander het medium elke 2-3 dagen.
- Gebruik de organoïden voor experimenten na 7 dagen cultuur.
- Bereid de organoïden voor op de barrière-integriteitsmeting.
- Precoat alle centrifugeren buizen die zullen worden gebruikt voor het opslaan van de organoïden tijdens het beplatingsproces met runderserum albumine (BSA) door het toevoegen van genoeg van een 0,1% BSA oplossing in PBS om alle plastic oppervlakken te dekken. Verwijder vervolgens de BSA-oplossing opnieuw en bewaar de centrifugatiebuizen op ijs.
- Ontdooi de celmatrixoplossing en organoïde kweekmedium op ijs.
- Om de organoïden te scheiden, verwijder u het kweekmedium zorgvuldig en schorst u de organoïden uit een put van een 48 putplaat in 1 mL koude PBS. Los de celmatrix op door krachtig te pipetteren. Houd de organoïde suspensie altijd in centrifugerende buizen voorgecoat met BSA en blijf altijd op ijs.
LET OP: De dichtheid, grootte en positie van de organoïden in de chambered coverslip slide worden beïnvloed door de split ratio, celmatrix oplossingconcentratie en behandeling van de organoïde-cel matrix suspensie. Het wordt aanbevolen om de behandeling van de celmatrixoplossing vooraf te oefenen. Meestal acht goed chambered glazen coverslips zijn geschikt voor de test. Organoïden afkomstig van een put van een confluent 48 putplaat kunnen worden opgesplitst in twee putten van een achtkamercoverslip (40 μL van de organoïde-celmatrixpellet per put). - Centrifugeer de organoïde suspensie bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
- Gooi de supernatant voorzichtig weg en stouw de pellet opnieuw met 1 mL koude PBS.
- Centrifugeer de organoïde suspensie bij 300 x g, 4 °C gedurende 5 min.
- Gooi de supernatant volledig weg en stonk de organoïden die zijn afgeleid van één put van een 48 putplaat in 40 μL koud medium. Fragmenteer grote organoïde structuren door de organoïde suspensie 5x door een 10 μL pipettip te geven om structuren te verzamelen met een grootte van 40-60 μm voor zaaien.
LET OP: Gebruik de 10 μL-tip op een pipettip van 100 μL voor de fragmentatie van de organoïde structuren en oefen stap 1.7 van tevoren om consistente resultaten te garanderen. Controleer de grootte van de organoïden door fasecontrastmicroscopie binnen de centrifugatiebuis. Zorg ervoor dat er geen multitaksen organoïden meer aanwezig zijn en dat de organoïde fragmenten ongeveer 40-60 μm lang zijn. - Zodra de organoïden de gewenste grootte hebben verkregen, meng ze dan met 40 μL van de celmatrixoplossing (medium:cell matrix oplossing = 1:1).
LET OP: De verhouding tussen de middellange en celmatrixoplossing moet constant worden gehouden om consistente resultaten te bereiken. De verdunning van de celmatrixoplossing vermindert de stijfheid van de organoïde blob en beïnvloedt de diffusie-eigenschappen. Gebruik voorgekoelde pipettips (-20 °C) voor alle suspensingen met celmatrixoplossing. - Plaats 40 μL van de organoïde-cel matrix oplossing suspensie in het midden van elke put van een 8 goed chambered coverslip.
- Houd de glijbaan 5 min op een ijslaag. Dit behoudt de celmatrix organoïde suspensievloeistof en verhoogt de organoïde concentratie op het coverslipoppervlak door de zwaartekracht.
- Incubeer gedurende 20 min bij 37 °C en 5% CO2 om polymerisatie van de organoïde-celmatrixblob mogelijk te maken.
- Voeg 150 μL organoïde kweekmedium per put toe en broed gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 voordat de experimentele behandeling wordt voortgezet.
- Gebruik deze periode om de organoïden te behandelen en hun barrière-integriteit te moduleren volgens de overeenkomstige wetenschappelijke hypothese. Behandel voor de positieve controle de organoïden gedurende 48 uur met IFN-γ om IFN-γ geassocieerde strakke splitsingsafbraak en doorlaatbaarheid te onderzoeken. Stimuleer de positieve controle met 10 U/mL (10 ng/mL) recombinant murine IFN-γ. Laat de organoïden van een goed onbehandeld.
- Kweekorganoïden bij 37 °C en 5% CO2 tot 48 uur.
2. OrganoidPermeability Assay
- Breng de incubatiekamer van de microscoop ten minste 2 uur voor aanvang van het experiment om de thermische drift te verminderen tijdens het imaging van de organoïden.
- Bereid een 100 mM oplossing van LY in PBS. Bewaar op ijs beschermd tegen licht.
- Bereid een 200 mM oplossing van EGTA voor in PBS. Bewaar het op ijs.
- Breng het chambered coverslip inclusief de organoïden over in de incubatiekamer2 van een omgekeerde confocale microscoop en schakel de CO 2-incubatie aan (5%). Zorg ervoor dat de chambered coverslip goed is vergrendeld in het stadium van de microscoop.
- Met behulp van de organoïden in een goed als een referentie, pas de beeldvorming instellingen van de microscoop. Voeg LY (3 μL van 100 mM LY in 150 μL medium) toe om een eindvolume van 1 mM LY in 300 μL medium te verkrijgen. Incubeer op de microscoop gedurende 1 uur en pas de focus aan voor de beeldvorming van het lumen van de organoïden. Definieer de vereiste laserenergie voor LY-excitatie (488 nm) en de respectievelijke detectiegevoeligheid van het instrument en probeer de LY-fluorescentie in beeld te brengen op 30-40% van het beschikbare dynamische bereik van het gebruikte instrument.
LET OP: Pas de laserexcitatie-energie en detectie-efficiëntie op onbehandelde organoïden 70 min na de toevoeging van LY. Zorg ervoor dat de excitatie-energie hoog genoeg is om een goed belicht beeld te krijgen. Om verzadiging van LY-fluorescentie binnen de microscopische beelden te voorkomen, wordt aanbevolen om deze instellingen aan te passen nadat de LY-diffusie een stabiele toestand heeft bereikt. - Definieer de positie van de organoïden door differentiële interferentie contrast (DIC) live beeldvorming. Probeer organoïden met vergelijkbare diameters (80 ± 30 μm) te schetsen en concentreer je op het centrale deel van de organoïden om hun lumen te beeldgeven. Definieer ongeveer 10 organoïden per put en probeer alleen organoïden in de buurt van het coverslipoppervlak met een bolvormige structuur te schetsen.
LET OP: Het aantal organoïden dat per run kan worden weergegeven, is afhankelijk van de snelheid van de microscoop. Het wordt aanbevolen om de organoïden binnen een interval van 5 min te schetsen. Op een gewone laserscanningmicroscoop zijn 40 posities in totaal een redelijk uitgangspunt. - Noteer de DIC en de LY fluorescentie van elke positie om de vorm en autofluorescentie van de organoïde te documenteren voordat u de LY aan de putten toevoegt, die worden gebruikt voor de test van de barrière-integriteit.
- Beeld geen organoïden die hoge autofluorescentie weergeven. Dit is te wijten aan de accumulatie van dode cellen in het lumen van de organoïde, en de resultaten van autofluorescerende organoïden zijn achteraf moeilijk te analyseren.
- Verdun 3 μL van de geprepareerde LY-oplossing (100 mM LY in 150 μL medium) en voeg deze zorgvuldig toe aan elke put zonder het chambered coverslip aan te raken. De aanbevolen concentratie van LY per put is 1 mM. Het uiteindelijke volume per put moet 300 μL zijn.
- Controleer snel de focus van de gedefinieerde posities en corrigeer indien nodig.
LET OP: LY verspreidt zich snel door de celmatrix. Daarom moet de confocale beeldvorming binnen 3 min na de toevoeging van de fluorophore worden gestart. - Start een time-lapse beeldvorming op de microscoop. Neem een fluorescentiebeeld van elke positie om de 5 min gedurende een totaal van 70 min.
LET OP: De organoïden werden afgebeeld in intervallen van 5 minuten om de LY-opname in de loop van de tijd te visualiseren. Om de darmbarrièreafbraak te meten, volstaat het om de fluorescentie vóór en 60 min na LY-toevoeging en opnieuw 10 min na de toevoeging van EGTA vast te leggen. - Voeg 3 μL van de voorbereide EGTA-oplossing per put toe zonder het chambered coverslip aan te raken. De aanbevolen concentratie in het chambered coverslip van EGTA is 2 mM. Het totale volume per put moet 300 μL zijn.
- Start een tweede time-lapse. Noteer de fluorescentie van de gedefinieerde organoïden opnieuw met een interval van 5 min gedurende een totaal van 30 min.
- Gooi alles weg volgens de lokale veiligheidsvoorschriften.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
3. Gegevensanalyse
- Analyseer alleen de resultaten van de organoïden die LY opnamen na EGTA-toevoeging.
- Resultaten kunnen worden gekwantificeerd met Fiji ImageJ.
- De gegevensset openen in ImageJ door op Bestand te klikken | Open en selecteer afbeeldingsgegevens. Selecteer in het volgende dialoogvenster Importopties voor BIO-indelingen de optie Stapel weergeven met: Hyperstack.
- Open de manager van de interesseregio (ROI) door op Analyseren te klikken | Instrumenten | ROI Manager.
- Teken een ovale ROI door te klikken op de knop Ovale selectie in de menubalk imagej. Teken een selectie met het binnenste lumen van de organoïde. Druk vervolgens op Toevoegen in de ROI-manager.
- Herhaal de stappen voor drie representatieve gebieden buiten de organoïde.
- Klik op Analyseren in de menubalk en selecteer Metingen instellen. Schakel alleen Gemiddelde grijswaarde in en schakel elke andere meting uit. Klik vervolgens op OK.
- Zorg ervoor dat alle ROI's zijn geselecteerd in de ROI Manager. Klik in DE LEIDER van de ROI op Meer | Multi maatregel. Selecteer in het optiedialoogvenster Alle [...] segmenten en Één rij per segment. Klik vervolgens op OK.
- Selecteer alle waarden in het venster Resultaten en kopieer ze naar een spreadsheettoepassing voor verdere analyse.
LET OP: Als de positie van de organoïde tijdens de time-lapse beeldvorming wordt bewogen, moet de ROI dienovereenkomstig worden aangepast. Selecteer hiervoor de juiste ROI in de ROI-manager en verplaats deze naar de nieuwe positie. Klik vervolgens op Bijwerken in de ROI-manager. Voer de meting voor elk tijdpunt afzonderlijk uit door op Meten in de ROI-manager te klikken en vervolgens over te schakelen naar het volgende tijdpunt in het afbeeldingsvenster met de balk onderaan. Verzamel alle metingen in een spreadsheet. De individuele vorm en de beweging van organoïden tijdens de beeldvormingsperiode vereisen de analyse van de gegevens op een handmatige manier. - Bereken de gemiddelde intensiteitswaarde van de drie ROI's buiten de organoïde voor elk tijdpunt.
- Verdeel de intensiteit van de ROI in het lumen van de organoïde door de gemiddelde intensiteit van de ROI buiten en de gemiddelde intensiteit in de organoïde.
- Als u de relatieve toename van de fluorescentie van luminale organoïde berekent, deelt u de relatieve fluorescentie (zie stap 3.11) op elk tijdpunt dat wordt afgebeeld door de minimale relatieve fluorescentie.
LET OP: Gebruik de minimale relatieve fluorescentie, omdat soms de diffusie van de fluoropforen aan het begin van het experiment traag kan zijn.
Representative Results
Om de toepassing van 3D kleine darmmuizenorganoïden te valideren als model om het effect van verbindingen die de darmbarrièreintegriteit reguleren te kwantificeren, hebben we IFN-γ toegepast. Om dit te doen, zijn we geïsoleerde en gekweekte organoïden afgeleid van IFN-γ responsieve wilde type en IFN-γ-receptor-2 knock-out muizen, die niet reageren op IFN-γ8. Na behandeling gedurende 48 uur met IFN-γ of PBS (controle), werden alle organoïden blootgesteld aan LY en afgebeeld door confocale spinnen schijf live celmicroscopie in intervallen van 5 minuten gedurende een periode van 70 min. De functionele integriteit van de darmbarrière in dit model resulteerde in uitsluiting van LY van het lumen van de organoïde, terwijl intraluminale accumulatie van LY betekende vernietiging van de TJ. De representatieve fluorescentie microscopische beelden na 70 min incubatie met LY tonen duidelijk aan dat intraluminale LY fluorescentie alleen zichtbaar was in organoïden van wilde dieren behandeld met IFN-γ. Bij niet-gestimuleerde (PBS) controles noch bij organoïden afkomstig van knock-out dieren (IFN-γR2ΔIEC, figuur 1),was er na 70 min geen intraluminale LY fluorescentie aanwezig.
De toevoeging van EGTA veroorzaakt een niet-specifieke afbraak van de darmbarrière integriteit door sekwestreren TJ cofactors. Deze controle werd altijd gebruikt aan het einde van het experiment om het vermogen van de respectieve organoïde aan te tonen om LY op te nemen (Figuur 1). Als er geen intraluminale LY fluorescentie werd gedetecteerd bij de EGTA-behandeling, werd de organoïde uitgesloten van het experiment.
Voor de kwantitatieve evaluatie van de microscopische resultaten werd LY-fluorescentie gemeten in het lumen van de organoïde en buiten de organoïde. Relatieve intensiteitswaarden werden berekend (fluorescentie binnen/ fluorescentie buiten + binnen) en worden weergegeven voor elk tijdspunt afgebeeld. Het wordt aanbevolen om beeldvorming van organoïden van verschillende grootte te voorkomen. We hebben ervoor gekozen om ons te richten op organoïden met een diameter van 80 ± 30 μm (Figuur 2). Een schema van het protocol met representatieve afbeeldingen wordt weergegeven in figuur 3. Enkele belangrijke problemen en probleemoplossingstechnieken worden getoond en besproken in figuur 4.
Figuur 1: De integriteit van de darmbarrière kan worden geanalyseerd in muisorganoïden. Intestinale organoïden van IFN-γR2WT en IFN-γR2ΔIEC werden gekweekt in aanwezigheid van IFN-γ gedurende 48 uur of onbehandeld. Om de integriteit van de darmbarrière te onderzoeken, werd LY (457 Da) toegevoegd en confocale fluorescerende beelden werden vastgelegd in intervallen van 5 minuten voor een totaal van 70 min. Representatieve afbeeldingen op tijdstip 0 min, 70 min, en na toevoeging van EGTA worden getoond (groen = Lucifer geel; Schaalbalk = 20 μm). Dit cijfer is gewijzigd van Bardenbacher et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Het integriteitsmodel voor kleine darmorganoïde barrières levert kwantitatieve resultaten. (A) LY fluorescentie werd binnen en buiten de organoïde bepaald. Relatieve intensiteitswaarden werden berekend (binnen/fluorescentie buiten + binnen) ten opzichte van de oorspronkelijke relatieve intensiteit + SEM en worden weergegeven voor elk tijdspunt. (B) Grootteverdeling van geanalyseerde organoïden. Om de standaarddeviatie en fouten als gevolg van veranderingen in de oppervlakte-volumeverhouding te verminderen, analyseerden we alleen organoïden met een diameter van 80 ± 30 μm. Gemiddelde waarden van de respectieve organoïde diameters worden getoond + SD (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). De gemiddelde diameterwaarden varieerden niet significant tussen de verschillende groepen (one-way ANOVA). (C) De doorlaatbaarheid van de organoïden werd vastgesteld 70 min na de toevoeging van LY. Het werd gedefinieerd door de intraluminale fluorescentieintensiteiten na 70 min te delen door de minimale relatieve fluorescentieintensiteiten die tijdens de observatieperiode werden gemeten. Elke balk vertegenwoordigt gemiddelde waarden + SD, gemeten in 10 organoïden afgeleid van twee onafhankelijke experimenten (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). IFN-γ verhoogde de LY-opname alleen in IFN-γR2organoïden aanzienlijk. p-waarde <0,001 in de t-toets van de student. Dit cijfer is gewijzigd van Bardenbacher et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Schematisch protocol met representatieve afbeeldingen. (A) Schematische beschrijving van de belangrijkste stappen van het protocol. bB) Representatieve afbeeldingen van de belangrijkste stappen van het protocol. (B1) DIC microscopie beeld van een centrale slice door middel van een geschikte organoïde die werd geselecteerd voor doorlaatbaarheid analyse. De stippellijn vertegenwoordigt een breedte van 89 μm. (B2) Fluorescentie microscopie beeld van dezelfde organoïde in (B1) alvorens LY toe te voegen. Het beeld toont de autofluorescentie van organoïde. (B3) Een organoïde 70 min na de toevoeging van LY. De afgebeelde organoïde toont geen opname van LY en dus een intacte barrièrefunctie. Stippellijnen tonen de ROI's voor verdere analyse. Het binnenlumen van de organoïde en drie representatieve gebieden rond de organoïde zijn gemarkeerd. (B4) Een organoïde na de toevoeging van EGTA. De organoïde is bruikbaar voor verdere analyse omdat het ly opname na de EGTA behandeling toont. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Oplossen van veelvoorkomende problemen. (A) Tabel met gemeenschappelijke problemen en oplossingen. (B) Voorbeeldige beelden. (B1) DIC beeld van een grote multibranched organoïde die niet geschikt is voor deze test. (B2). Confocale afbeelding van een organoïde die hoge autofluorescentie weergeeft voordat LY aan het medium werd toegevoegd. De organoïde werd uitgesloten van kwantificering. (B3) Confocale afbeelding van een organoïde die lage autofluorescentie weergeeft voordat LY aan het medium werd toegevoegd. De fluorescentie werd in dit geval gekwantificeerd. (B4) Organoïde toont geen LY opname van het medium 30 min na toevoeging van EGTA en daarom uitgesloten van kwantificering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Deze test biedt een techniek om de darmbarrière integriteit binnen levende organoïden te bestuderen. De hele test is gebaseerd op kleine darmmuis organoïden en confocale live celmicroscopie. Daarom is het verplicht om de juiste behandeling van organoïden op voorhand te oefenen. Bij isolatie kunnen organoïden routinematig worden gesplitst en opgeslagen doorcryofreezing 3,9. Voor deze test raden we aan om de organoïden 48 uur te splitsen voordat de behandeling wordt gestart. Deze periode geeft de organoïden de kans om sferische structuren volledig te sluiten en te vormen. Het zaaien van de organoïden voor het experiment is een kritische stap binnen de test. Om individuele handlingvariaties te verminderen, raden we een routineprocedure aan voor het zaaiproces. Deze stap is cruciaal en een routinebehandelingsprotocol vermindert duidelijk experimentele variaties.
Tijdens de zaaiprocedure (stap 1.7) raken de organoïden gefragmenteerd door herhaaldelijk door een standaard 10 μL pipettip te gaan. De porie grootte van dit product varieert van bedrijf tot bedrijf. Deze procedure moet vooraf worden toegepast en het resultaat moet altijd worden gecontroleerd door fasecontrastmicroscopie. Zodra de verkregen organoïden de gewenste grootte bereiken, wijzig de procedure niet.
Het zaaien van de organoïden moet worden geoptimaliseerd en aangepast voor de beschikbare microscopische opstelling. Om organoïden minstens 48 uur te kunnen kweken en imagoen, is een geïncubeerde microscoopkamer absoluut vereist. Kies een chambered coverslip dat aan uw eisen voldoet. Bij het zaaien van de organoïden, zorg ervoor dat de organoïden concentreren op het coverslip oppervlak. Dit is mogelijk door het chambered coverslip 5 min na het plaatsen van de celmatrix-organoïde suspensie op een ijspak te houden. Deze stap is belangrijk om de kwaliteit van confocale live celbeeldvorming te verhogen. De axiale resolutie en werkafstand van confocale microscooplenzen is bijzonder beperkt. Hoe dichter je het monster naar de lens brengt, hoe beter je het in beeld brengen en hoe minder laserenergie nodig is om de LY-fluorescentie op te wekken.
Phototaxis is een belangrijk probleem als het gaat om live cel microscopie. Binnen deze test sluiten we deze optie uit. Een functionele AJC is zichtbaar door uitsluiting van LY van het lumen van de organoïde (Figuur 1, PBS). De toevoeging van EGTA aan het einde van het experiment veroorzaakt sekwestreren van bivalente ionen, die cofactoren zijn voor AJC-eiwitten. LY is alleen uitgesloten van het lumen van de organoïde in vitale organoïden met een functioneel AJC-complex. In het algemeen kunnen fluorescerende moleculen worden gebruikt om de integriteit van de darmbarrière te meten. We kozen voor LY in plaats van andere veelgebruikte fluorophoren zoals fluoresceine gelabeld dextran omdat die transcellig worden vervoerd in darmcellen van de basale naar de apicale compartiment9. We hebben ook gekozen voor LY vanwege het kleine formaat. LY heeft een moleculair gewicht van 457 Da en faciliteert daarom het onderzoek naar de doorlaatbaarheid van de barrière voor kleine moleculen. Het fluorescerende molecuul moet worden gekozen afhankelijk van de onderzochte wetenschappelijke vraag. Omdat fototoxische AJC-defecten aanwezig zijn, moet de laserexcitatie-energie worden verminderd of moet het beeldvormingsinterval worden verlengd. De optimale confocale beeldvormingstechniek voor deze test is het spinnen van discmicroscopie. De respectieve instrumenten maken confocale beeldvorming mogelijk met een korte belichtingstijd bij laag laservermogen.
Er zijn al verschillende modellen ontwikkeld om de integriteit van de darmbarrière in vitro te bestuderen. Terwijl het gebruik van tests op basis van cellijnmonolagen of experimenten in vivo afneemt, nemen op organoïden gebaseerde methoden toe. In tegenstelling tot eerder beschreven methoden4,5,6,7, maakt onze methode kwantificering van de barrièrefunctie in de tijd mogelijk. Hierdoor kunnen de organoïden in de loop van het experiment worden blootgesteld aan extra stimuli. Hier passen we EGTA als een tweede stimulans aan het einde van het experiment als een positieve controle.
In tegenstelling tot de situatie in vivowordt in onze test LY in het medium toegevoegd en dringt het organoïde van buiten basolaterale epitheliale kant naar de binnenkant apicallumen. De LY is klein en wordt alleen gebruikt om de dichtheid van de darmbarrière te visualiseren. Moleculen en stimuli die de epitheliale laag op het apicale oppervlak moduleren, moeten worden geïnjecteerd in het lumen van de organoïde7. Om de experimentele inspanning te verminderen en de barrière-integriteit van veel organoïden tegelijkertijd te kunnen meten, hebben we ervoor gekozen om de fluorescerende kleurstof van buitenaf toe te passen.
We gebruikten de test om de functie van IFN-γ te onderzoeken op de strakke kruising van kleine darmmuizenorganoïden. Het feit dat we in staat waren om de barrière-integriteit in levende organoïden te analyseren biedt toekomstige mogelijkheden om deze techniek toe te passen om remmers te beschrijven voor de ontstekings-geïnduceerde afbraak van de darmbarrière. Stoffen die de door IFN-γ veroorzaakte verminderde barrièrefunctie tegengaan, kunnen kandidaten zijn voor de behandeling van inflammatoire darmziekten, waarbij een verminderde barrièrefunctie een van de pathogene factoren is10.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) [KFO257, project 4 aan M.S. en project 1 aan C.B.; FOR2438, project 2 aan M.S. en E.N. en project 5 naar C.B.; SFB1181 project C05 aan C.B.; TRR241, project A06 to N.B.L. and M.S., project A03 to C.B., BR5196/2-1 to N.B.L. and BE3686/2 to C.B.]; het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van het Klinisch Centrum Erlangen (aan M.S., E.N., en M.B.), de W. Lutz Stiftung (aan M.S.) en de Forschungsstiftung Medizin van het Klinisch Centrum Erlangen (aan M.S.). Het huidige werk werd uitgevoerd in (gedeeltelijke) vervulling van de eisen voor het behalen van de graad Dr. Med. van Marco Bardenbacher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
| 96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
| Axio Observer.Z1 - spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Centrifugation tube 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
| Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
| Microscope coverslip | 24 mm x 60 mm | ||
| Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
| Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |
References
- López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 16831 (2015).
- Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
