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Medicine

लिविंग ऑर्गेनॉइड में आंतों की बाधा टूटने की जांच

doi: 10.3791/60546 Published: March 26, 2020
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम छोटे आंतों के ऑर्गेनॉइड की बाधा अखंडता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। तथ्य यह है कि विधि जीवित ऑर्गेनॉइड पर आधारित है, विभिन्न बाधा अखंडता की अनुक्रमिक जांच को समय-समाधान तरीके से पदार्थों या संयोजनों को मॉड्यूल करने में सक्षम बनाता है।

Abstract

ऑर्गेनॉइड और त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृतियां विट्रो में जटिल जैविक तंत्र और विनियमों की जांच की अनुमति देतीहैं, जो पहले शास्त्रीय कोशिका संस्कृति मोनोलेयर में संभव नहीं थीं। इसके अलावा, मोनोलेयर सेल संस्कृतियां इन विट्रो मॉडल सिस्टम हैं, लेकिन जटिल सेलुलर विभेदन प्रक्रियाओं और कार्यों का प्रतिनिधित्व नहीं करती हैं जो 3 डी संरचना पर भरोसा करतेहैं। यह अब तक केवल पशु प्रयोगों में संभव हो पाया है, जो श्रमसाध्य, समय लेने वाली हैं, और ऑप्टिकल तकनीकों द्वारा आकलन करना कठिन है। यहां हम छोटे आंतों माउस ऑर्गेनॉइड रहने में समय के साथ बाधा अखंडता निर्धारित करने के लिए एक परख का वर्णन करते हैं। हमारे मॉडल को मान्य करने के लिए, हमने इंटरफेरॉन गामा (आईएफएन-) को बाधा विनाश और आईएफएन-रिसेप्टर 2 से प्राप्त ऑर्गेनोइड के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लागू किया, जो चूहों को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में खटखटाते हैं। परख ने हमें आंतों की बाधा अखंडता और आईएफएन-प्रेरित गिरावट पर आईएफएन-ए के प्रभाव को निर्धारित करने की अनुमति दी, जो तंग जंक्शन प्रोटीन क्लॉडर्न-2, -7 और -15 के प्रेरित होता है। इस परख का उपयोग आंतों की बाधा अखंडता पर रासायनिक यौगिकों, प्रोटीन, विषाक्त पदार्थों, बैक्टीरिया या रोगी-व्युत्पन्न जांच के प्रभाव की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

एपिथेलियल बैरियर की अखंडता को एपिकल जंक्शनल कॉम्प्लेक्स (एजेसी) द्वारा बनाए रखा जाता है, जिसमें टाइट जंक्शन (टीजे) और पालन जंक्शन (एजे) प्रोटीन1शामिल होते हैं। एजेसी की ध्रुवीकृत संरचना वीवो में अपने कार्य के लिए महत्वपूर्ण है। एजेसी का डिस्रेगुलेशन विभिन्न रोगों में मौजूद है और इसमें भड़काऊ आंत्र रोगजनन का एक महत्वपूर्ण ट्रिगर होने की आशंका है । आंतों की बाधा समारोह का नुकसान रोग की शुरुआत की घटना का प्रतिनिधित्व करता है। कॉममेंसल बैक्टीरिया और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का निम्नलिखित स्थानांतरण दर्दनाक परिणाम हैं

एजेसी के नियमन की जांच के लिए विभिन्न इन विट्रो और वीवो मॉडल विकसित किए गए हैं ट्रांसवेल परख दो आयामी (2डी) कोशिका मोनोलेयर पर आधारित है जो ट्यूमर सेल लाइनों से प्राप्त किए गए थे। ये प्रणालियां ऑप्टिकल और जैव रासायनिक तरीकों का आकलन करना और एक ही समय में कई नमूनों के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए अच्छी हैं लेकिन प्राथमिक कोशिकाओं की कई विशेषताओं और वीवो में मौजूद विभेदन प्रक्रियाओं की कमीहै । पशु मॉडल में बाधा अखंडता की जांच करना भी संभव है। टर्मिनल प्रयोगों में, पूरी आंत की स्थायित्व पर वीवो में विशिष्ट उपचार ों के प्रभावों को निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, इन मॉडलों को बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती है, और वे अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं के विस्तृत दृश्य की अनुमति नहीं देते हैं। आजकल बेहतर 3डी इन विट्रो मॉडल उपलब्ध हैं जो सेल विभेदन प्रक्रियाओं, सेल ध्रुवीकरण को बारीकी से पुनर्निर्मित करते हैं, और आंत3की तहखाना-विलस संरचना का प्रतिनिधित्व करते हैं। कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए 3डी आंतों के ऑर्गेनॉइड के आवेदन के लिए 2डी मॉडल से उपलब्ध तरीकों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। यहां हम छोटे आंतों माउस ऑर्गेनॉइड रहने में आंतों की बाधा अखंडता की जांच करने के लिए एक मॉडल का वर्णन करते हैं। परख बाधा अखंडता और संबंधित तंग जंक्शन प्रोटीन8पर IFN-के प्रभाव की जांच करने के लिए स्थापित किया गया था ।

लेस्ली4,Zietek5,या Pearce6,जो माध्यम से लूसिफ़ेर पीले (LY) को हटाने के बाद फ्लोरेसेंस उपाय द्वारा लागू तकनीक के विपरीत, हमारे दृष्टिकोण समय के साथ फ्लोरोफोर के चमकदार तेज की मात्रा की अनुमति देता है । इसलिए, परिणाम एक गतिशील तेज गतिज का प्रतिनिधित्व करता है और हमारी परख प्रयोग के दौरान अतिरिक्त उत्तेजनाओं या अवरोधकों के आवेदन को सक्षम बनाता है। तथ्य यह है कि दोनों परख बाहर की ओर से अंदर की ओर से ऊपर की ओर से अंदर की ओर से अपटेक को मापने के लिए वीवो में स्थिति के विपरीत स्पष्ट है । हिल एट अल7द्वारा वर्णित एक मॉडल में, इस विषय का पता लगाया गया था। ऑर्गेनॉइड के लुमेन में फ्लोरोफोर के माइक्रोइंजेक्शन पर, फ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रसार की दिशा वीवो में मौजूद दिशा का प्रतिनिधित्व करती है। माइक्रोइंजेक्शन का तकनीकी प्रयास स्पष्ट रूप से इस विधि के थ्रूपुट को कम करता है। यहां वर्णित मॉडल के विपरीत, माइक्रोइंजेक्शन विधि उन प्रभावों की माप को सक्षम बनाती है जिन्हें एपिकल एपिथेलियल सतह पर जैविक सक्रियण की आवश्यकता होती है।

यहां प्रस्तुत ऑर्गेनोइड बैरियर इंटीग्रिटी मॉडल लाइव सेल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है और समय के साथ एजेसी नियमन के भीतर गतिशील परिवर्तनों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। सेटअप को आंतों की बाधा की अखंडता को प्रेरित करने और बाधित करने वाले पदार्थों के औषधीय प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड-आधारित मॉडल औषधीय अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करने में मदद करते हैं।

Protocol

सभी संबंधित नियामक और संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार और अनुपालन के अनुसार सभी कदम पूरे किए गए ।

1. ऑर्गेनोइड्स की चढ़ाना

  1. ऑर्गेनॉइड को अलग करें जैसा कि पहलेवर्णित है3 । प्रक्रिया संक्षेप में नीचे वर्णित है।
    1. चूहों से छोटी आंतों को लीजिए।
    2. छोटी आंतों को देशीयरूप से खोलें और एक कवरस्लिप के साथ आंतरिक आंतों के ऊतकों को स्क्रैप करके विली युक्तियों को हटा दें।
    3. कैंची का उपयोग करके आंतों के ऊतकों को छोटे टुकड़ों में काट लें।
    4. 25 मीटर पिपेट के साथ टुकड़ों को 10x ऊपर और नीचे पाइपकर ठंडे फॉस्फेट-बफरेड लवलाइन (पीबीएस) में 5x धोएं।
    5. एक क्षैतिज मिलाते हुए मंच पर 30 मेंस के लिए बर्फ पर ठंड 2 mM EDTA समाधान में ऊतक टुकड़े इनक्यूबेट। ऊतक के टुकड़ों को तलछट की अनुमति दें।
    6. एक बार ऊतक टुकड़े नीचे बसने के बाद पीबीएस बफर के साथ EDTA समाधान को बदलें। अधिनेता को त्यागें और पीबीएस के 20 mL जोड़ें।
    7. 10 मीटर पाइपेट के साथ 10x ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ऊतक से आंतों के तहखाने को छोड़ें।
    8. सेंट्रलाइज्ड ट्यूबमें अधिनेता एकत्र करें और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा इसका निरीक्षण करें। ऐसा करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में अधिनेत की एक बूंद जोड़ें। बर्फ पर सेंट्रलाइज्ड ट्यूब रखें।
    9. संग्रहित सुपरनेटेंट में आंतों के तहखाने की संख्या कम होने तक चरण 1.1.6-1.1.8 दोहराएं।
    10. 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से सबसे अधिक तहखाने वाले अंशों को पास करें।
    11. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस पर तहखाना निलंबन को केंद्रित रखें।
    12. अधिनायक को त्यागें और तहखाने को धोने के लिए ठंडे पीबीएस में पैलेट को फिर से निलंबित करें। फिर 1.1.11 में वर्णित केंद्रीकरण चरण दोहराएं।
    13. सेल मैट्रिक्स समाधान और मूत्र ऑर्गेनॉइड संस्कृति माध्यम के 1:1 मिश्रण के कुल 25 माइक्रोन प्रति कुएं में गोली को फिर से निलंबित करें और 48 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेटों में ऑर्गेनॉइड प्लेट करें।
    14. कोशिका मैट्रिक्स समाधान को जमना करने की अनुमति देने केलिए 20 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर ऑर्गेनॉइड को इनक्यूबेट करें।
    15. ऑर्गनॉइड को प्रति अच्छी तरह से 300 माइक्रोन के साथ कवर करें।
    16. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर ऑर्गेनॉइड संस्कृति, हर 2-3 दिनों में माध्यम बदल रहा है।
    17. संस्कृति के 7 दिनों के बाद प्रयोगों के लिए ऑर्गनॉइड का उपयोग करें।
  2. बैरियर इंटीग्रिटी मेजरमेंट के लिए ऑर्गनॉइड तैयार करें।
    1. सभी सेंटियूगेशन ट्यूबों को प्रीकोट करें जिनका उपयोग गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ चढ़ाना प्रक्रिया के दौरान ऑर्गेनॉइड के भंडारण के लिए किया जाएगा, सभी प्लास्टिक सतहों को कवर करने के लिए पीबीएस में 0.1% बीएसए समाधान के लिए पर्याप्त जोड़कर। इसके बाद बीएसए समाधान को फिर से निकाल लें और बर्फ पर सेंट्रलाइज्ड ट्यूब स्टोर करें।
    2. बर्फ पर सेल मैट्रिक्स समाधान और ऑर्गेनोइड कल्चर मीडियम को पिघलाएं।
  3. ऑर्गेनॉइड को अलग करने के लिए, संस्कृति माध्यम को ध्यान से हटा दें और कोल्ड पीबीएस के 1 मिलील में 48 अच्छी प्लेट के एक कुएं से ऑर्गनॉइड को फिर से निलंबित करें। जोरदार पाइपिंग से सेल मैट्रिक्स को भंग कर दें। हमेशा सेंट्रलाइज्ड ट्यूब्स में ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन को बीएसए के साथ प्रीकोटेड रखें और हमेशा बर्फ पर रखें।
    नोट: कक्षित कवरस्लिप स्लाइड के भीतर ऑर्गेनॉइड का घनत्व, आकार और स्थिति विभाजन अनुपात, सेल मैट्रिक्स समाधान एकाग्रता और ऑर्गेनोइड-सेल मैट्रिक्स निलंबन की हैंडलिंग से प्रभावित होती है। सेल मैट्रिक्स समाधान की हैंडलिंग का अभ्यास पहले से करने की सिफारिश की जाती है। आमतौर पर आठ अच्छी तरह से कक्षित ग्लास कवरस्लिप परख के लिए उपयुक्त होते हैं। एक शंख48 अच्छी प्लेट के एक कुएं से प्राप्त ऑर्गेनोइड को आठ अच्छी तरह से कक्षित कवरस्लिप (ऑर्गेनोइड-सेल मैट्रिक्स पैलेट प्रति अच्छी तरह से 40 माइक्रोन) के दो कुओं में विभाजित किया जा सकता है।
  4. 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x ग्राम पर ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन को सेंट्रलाइज करें।
  5. ध्यान से अतिशयोक्ति त्यागें और ठंड पीबीएस के 1 mL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस पर ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन को सेंट्रलाइज करें।
  7. सुपरनेटेंट को पूरी तरह से त्यागें और ठंडे माध्यम के 40 माइक्रोन में 48 अच्छी प्लेट से एक कुएं से प्राप्त ऑर्गनॉइड को फिर से निलंबित करें। सीडिंग के लिए 40-60 माइक्रोन के आकार के साथ संरचनाओं को इकट्ठा करने के लिए 10 माइक्रोन पिपेट टिप के माध्यम से ऑर्गेनॉइड निलंबन 5x को पाइपकर बड़े ऑर्गनॉइड संरचनाओं को खंडित करके।
    नोट: ऑर्गेनॉइड संरचनाओं के विखंडन के लिए 100 माइक्रोन पिपेट टिप पर 10 μL टिप का उपयोग करें, और लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए पहले से चरण 1.7 का अभ्यास करें। सेंट्रलाइज्ड ट्यूब के भीतर फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा ऑर्गनॉइड के आकार को नियंत्रित करें। सुनिश्चित करें कि कोई और अधिक बहुशाखाओं वाले ऑर्गेनॉइड मौजूद नहीं हैं और ऑर्गेनॉइड टुकड़े लगभग 40-60 माइक्रोन लंबे हैं।
  8. एक बार ऑर्गेनॉइड वांछित आकार प्राप्त कर लेते हैं, तो उन्हें सेल मैट्रिक्स समाधान (मध्यम: सेल मैट्रिक्स समाधान = 1:1) के 40 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
    नोट: लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए मध्यम से सेल मैट्रिक्स समाधान अनुपात को स्थिर रखा जाना चाहिए। सेल मैट्रिक्स समाधान के कमजोर होने से ऑर्गेनोइड ब्लॉब की जकड़न कम हो जाती है और इसके प्रसार गुणों पर प्रभाव पड़ता है। सेल मैट्रिक्स समाधान वाले सभी निलंबनों के लिए प्रीकूल्ड पिपेट टिप्स (-20 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करें।
  9. 8 अच्छी तरह से कक्षित कवरस्लिप के प्रत्येक कुएं के केंद्र में ऑर्गेनॉइड-सेल मैट्रिक्स समाधान निलंबन के 40 माइक्रोन रखें।
  10. 5 मिन के लिए आइस पैक पर स्लाइड रखें। यह सेल मैट्रिक्स ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन लिक्विड को बरकरार रखता है और गुरुत्वाकर्षण द्वारा कवरस्लिप सतह पर ऑर्गनॉइड एकाग्रता को बढ़ाता है।
  11. ऑर्गेनोइड-सेल मैट्रिक्स बूँद के पॉलीमराइजेशन को सक्षम करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 20 मिन के लिए इनक्यूबेट।
  12. प्रायोगिक उपचार के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रति अच्छी तरह से ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडियम के 150 माइक्रोन जोड़ें और प्रायोगिक उपचार के साथ आगे बढ़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    1. ऑर्गेनॉइड का इलाज करने और इसी वैज्ञानिक परिकल्पना के अनुसार उनकी बाधा अखंडता को मिलाना करने के लिए इस अवधि का उपयोग करें। सकारात्मक नियंत्रण के लिए, आईएफएन-संबद्ध तंग जंक्शन क्षरण और परगम्यता वृद्धि की जांच करने के लिए आईएफएन-एफएफएन-के साथ 48 एच के लिए ऑर्गेनॉइड का इलाज करें। 10 यू/एमएल (10 एनजी/mL) रिकॉम्बिनेंट रिन आईएफएन-ए के साथ सकारात्मक नियंत्रण को प्रोत्साहित करें । एक अच्छी तरह से अनुपचारित के ऑर्गेनॉइड छोड़ दें।
  13. संस्कृति ऑर्गेनॉइड 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 48 घंटे तक के लिए।

2. ऑर्गेनोइडपरमीबिलिटी परख

  1. ऑर्गेनॉइड इमेजिंग करते समय थर्मल बहाव को कम करने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोप के ऊष्मायन कक्ष को कम से कम 2 घंटे तक लाएं।
  2. पीबीएस में LYके 100 mM समाधान तैयार करें। प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर स्टोर करें।
  3. पीबीएस में ईजीटीए का 200 एमएम समाधान तैयार करें। इसे बर्फ पर स्टोर करें।
  4. ऑर्गेनॉइड सहित चैम्बर कवरस्लिप को एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के ऊष्मायन कक्ष में स्थानांतरित करें और सीओ2 ऊष्मायन (5%) चालू करें। सुनिश्चित करें कि कक्ष कवरस्लिप माइक्रोस्कोप के चरण के भीतर कसकर बंद है।
  5. एक साथ एक संदर्भ में ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके, माइक्रोस्कोप की इमेजिंग सेटिंग्स को समायोजित करें। मध्यम के 300 माइक्रोन में 1 mM LY की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए LY (150 mM LY के 150 माइक्रो एल में 100 mM LY के 3 μL जोड़ें) । 1 घंटे के लिए माइक्रोस्कोप पर इनक्यूबेट और ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन की इमेजिंग के लिए ध्यान समायोजित करें। LY उत्तेजित (488 एनएम) और उपकरण की संबंधित पहचान संवेदनशीलता के लिए आवश्यक लेजर ऊर्जा को परिभाषित करें और उपयोग किए जा रहे उपकरण की उपलब्ध गतिशील सीमा के 30-40% पर LY फ्लोरेसेंस को छवि बनाने का प्रयास करें।
    नोट: LYके अलावा 70 मिन अनुपचारित ऑर्गेनोइड पर लेजर उत्तेजना ऊर्जा और पता लगाने की दक्षता समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि उत्तेजना ऊर्जा एक अच्छी तरह से उजागर छवि प्राप्त करने के लिए काफी अधिक है। सूक्ष्म छवियों के भीतर LY फ्लोरेसेंस के संतृप्ति से बचने के लिए, LY diffusion एक स्थिर स्थिति तक पहुंचने के बाद इन सेटिंग्स को समायोजित करने की सिफारिश की जाती है।
  6. अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) लाइव इमेजिंग द्वारा ऑर्गनॉइड की स्थिति को परिभाषित करें। तुलनीय व्यास (80 ± 30 माइक्रोन) के साथ ऑर्गेनॉइड छवि की कोशिश करें और ऑर्गनॉइड के केंद्रीय स्लाइस पर ध्यान केंद्रित करें ताकि वे अपने लुमेन को इमेज कर सके। प्रति अच्छी तरह से लगभग 10 ऑर्गेनॉइड को परिभाषित करें और गोलाकार संरचना के साथ कवरस्लिप सतह के करीब केवल ऑर्गनॉइड छवि बनाने की कोशिश करें।
    नोट: प्रति रन इमेज किए जा सकने वाले ऑर्गेनॉइड की संख्या माइक्रोस्कोप की गति पर निर्भर करती है। 5 मिनट के अंतराल के भीतर ऑर्गेनॉइड को इमेज करने की सिफारिश की जाती है। एक नियमित लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर, कुल में 40 पदों पर एक उचित प्रारंभिक बिंदु हैं.
  7. बाधा अखंडता परख के लिए उपयोग किए जाने वाले कुओं में LY जोड़ने से पहले ऑर्गेनॉइड के आकार और ऑटोफ्लोरेसेंस को दस्तावेज करने के लिए डीआईसी और वाई फ्लोरेसेंस को रिकॉर्ड करें।
  8. उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करने वाले ऑर्गनॉइड की छवि न करें। यह ऑर्गेनॉइड के लुमेन के भीतर मृत कोशिकाओं के संचय के कारण है, और ऑटोफ्लोरोसेंट ऑर्गेनॉइड के परिणाम बाद में विश्लेषण करना मुश्किल है।
  9. तैयार LY समाधान के 3 μL पतला (मध्यम के 150 माइक्रोन में 100 mM LY) और कक्ष कवरस्लिप को छूने के बिना प्रत्येक अच्छी तरह से इसे ध्यान से जोड़ें। प्रति अच्छी तरह से LYकी अनुशंसित एकाग्रता 1 mM है। प्रति अच्छी तरह से अंतिम मात्रा 300 μL होनी चाहिए।
  10. जल्दी से परिभाषित पदों का ध्यान केंद्रित करें और यदि आवश्यक हो तो सही करें।
    नोट: LY सेल मैट्रिक्स के माध्यम से जल्दी से फैलाता है। इसलिए फ्लोरोफोर के अलावा 3 मिनट के भीतर कॉन्फोकल इमेजिंग शुरू की जानी चाहिए।
  11. माइक्रोस्कोप पर एक समय चूक इमेजिंग शुरू करें। कुल 70 मिन के लिए हर 5 मिन की हर पोजीशन की फ्लोरेसेंस इमेज लें।
    नोट: समय के साथ LY तेज की कल्पना करने के लिए ऑर्गेनॉइड को 5 मिन अंतराल में चित्रित किया गया था। आंतों की बाधा टूटने को मापने के लिए, यह पहले फ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त है और LYअतिरिक्त के बाद 60 सीन और ईजीटीए के अलावा एक बार फिर 10 00।
  12. कक्षकवरस्लिप को छुए बिना तैयार ईजीटीए समाधान के 3 माइक्रोन जोड़ें। ईजीटीए के कक्षित कवरस्लिप के भीतर अनुशंसित एकाग्रता 2 एमएम है। प्रति अच्छी तरह से कुल मात्रा 300 माइक्रोन होना चाहिए।
  13. दूसरी बार चूक शुरू करें। कुल 30 मिन के लिए 5 मिन के अंतराल के साथ फिर से परिभाषित ऑर्गेनॉइड की फ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करें।
  14. स्थानीय सुरक्षा नियमों के अनुसार सब कुछ त्यागें।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है।

3. डेटा विश्लेषण

  1. केवल एग्टा अतिरिक्त के बाद LY लेने वाले ऑर्गेनॉइड के परिणामों का विश्लेषण करें।
  2. परिणाम फिजी इमेजजे के साथ निर्धारित किया जा सकता है।
  3. फ़ाइल पर क्लिक करके इमेजजे में डेटासेट खोलें । छवि डेटा खोलें और चुनें। निम्नलिखित जैव-प्रारूपों में आयात विकल्प संवाद के साथ देखें ढेर का चयन करें: हाइपरस्टैक।
  4. विश्लेषण पर क्लिक करके ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) प्रबंधक खोलें । उपकरणआरओआई मैनेजर
  5. इमेजजे मेनू बार में ओवल चयन बटन पर क्लिक करके एक अंडाकार आरओआई ड्रा करें। ऑर्गेनॉइड के आंतरिक लुमेन वाले चयन को ड्रा करें। फिर आरओआई मैनेजर में ऐड दबाएं।
  6. ऑर्गेनॉइड के बाहर तीन प्रतिनिधि क्षेत्रों के लिए चरण दोहराएं।
  7. मेनू बार में विश्लेषण पर क्लिक करें और सेट मापका चयन करें । केवल मतलब ग्रे मूल्य सक्षम करें और किसी भी अन्य माप को अक्षम करें। फिर ओकेपर क्लिक करें ।
  8. सुनिश्चित करें कि सभी आरओआई का चयन आरओआई प्रबंधक में किया जाता है। आरओआई मैनेजर में, अधिक क्लिक करें । मल्टी उपाय। विकल्प संवाद में सभी उपाय का चयन करें [...] स्लाइस और प्रति स्लाइस एक पंक्ति। फिर ओकेपर क्लिक करें ।
  9. परिणाम खिड़की में सभी मूल्यों का चयन करें और उन्हें आगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट आवेदन में कॉपी करें।
    नोट: यदि समय-चूक इमेजिंग के दौरान ऑर्गेनॉइड की स्थिति चली गई, तो आरओआई को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए आरओआई मैनेजर में सही आरओआई का चयन करें और उसे नए मुकाम पर ले जाएं। इसके बाद आरओआई मैनेजर में अपडेट पर क्लिक करें। आरओआई प्रबंधक में माप पर क्लिक करके व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक टाइमपॉइंट के लिए माप करें, फिर नीचे बार का उपयोग करके छवि खिड़की में अगले टाइमपॉइंट पर स्विच करें। स्प्रेडशीट में सभी माप एकत्र करें। इमेजिंग अवधि के दौरान व्यक्तिगत आकार और ऑर्गेनॉइड के आंदोलन के लिए मैन्युअल तरीके से डेटा के विश्लेषण की आवश्यकता होती है।
  10. प्रत्येक समय बिंदु के लिए ऑर्गेनॉइड के बाहर तीन आरओआई के औसत तीव्रता मूल्य की गणना करें।
  11. बाहर आरओआई की मतलब तीव्रता और ऑर्गेनॉइड के अंदर मतलब तीव्रता से ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन के अंदर आरओआई की तीव्रता को विभाजित करें।
  12. चमकदार ऑर्गेनोइड फ्लोरेसेंस की सापेक्ष वृद्धि की गणना करने के लिए, न्यूनतम सापेक्ष फ्लोरेसेंस द्वारा छवि वाले प्रत्येक समय बिंदु पर सापेक्ष फ्लोरेसेंस (चरण 3.11 देखें) को विभाजित करें।
    नोट: न्यूनतम सापेक्ष फ्लोरेसेंस का उपयोग करें, क्योंकि कभी-कभी प्रयोग की शुरुआत में फ्लोरोफोर का प्रसार धीमा हो सकता है।

Representative Results

आंतों की बाधा अखंडता को विनियमित करने वाले यौगिकों के प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मॉडल के रूप में 3डी छोटे आंतों के माउस ऑर्गेनॉइड के आवेदन को मान्य करने के लिए, हमने आईएफएन-ए लागू किया। ऐसा करने के लिए, हम आईएफएन-ए-उत्तरदायी जंगली प्रकार और आईएफएन-रिसेप्टर-2 नॉकआउट चूहों से प्राप्त अलग8और सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड, जो आईएफएन-8 का जवाब नहीं देते हैं। आईएफएन-ए-या पीबीएस (नियंत्रण) के साथ 48 एच के उपचार पर, सभी ऑर्गेनॉइड को आईवाई के संपर्क में रखा गया था और 70 मिन की अवधि के लिए 5 मिन अंतराल में कॉन्फोकल स्पिनिंग डिस्क लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजकिया गया था। इस मॉडल में आंतों की बाधा की कार्यात्मक अखंडता के परिणामस्वरूप टीजे के LYकोग्नीकृत विनाश के इंट्राल्यूमिनल संचय के दौरान ऑर्गेनॉइड के लुमेन से LY का बहिष्कार हुआ। LYके साथ ऊष्मायन के 70 मिन के बाद प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस सूक्ष्म छवियां स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करती हैं कि इंट्राल्यूमिनल LY फ्लोरेसेंस केवल आईएफएन-ए के साथ इलाज किए गए जंगली प्रकार के जानवरों से ऑर्गेनॉइड में दिखाई देता था। अउत्तेजित (पीबीएस) नियंत्रण में और न ही नॉक आउट जानवरों (आईएफएन-आर 2एआईईसी, चित्रा 1)से प्राप्त ऑर्गेनोइड में, 70 मिन के बाद कोई इंट्राल्यूमिनल LY फ्लोरेसेंस मौजूद नहीं था।

ईजीटीए के अलावा टीजे कोफैक्टर्स को तनहा कर आंतों की बाधा अखंडता का एक अविशिष्ट टूटने का कारण बनता है। इस नियंत्रण का उपयोग हमेशा प्रयोग के अंत में किया जाता था ताकि संबंधित ऑर्गेनॉइड की LY(चित्रा 1)लेने की क्षमता प्रदर्शित की जा सके। यदि ईटीए उपचार पर कोई इंट्राल्यूमिनल LY फ्लोरेसेंस का पता नहीं चला, तो ऑर्गेनॉइड को प्रयोग से बाहर रखा गया था।

सूक्ष्म परिणामों के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए, LY फ्लोरेसेंस को ऑर्गेनोइड के लुमेन के भीतर और ऑर्गेनोइड के बाहर मापा गया था। सापेक्ष तीव्रता मूल्यों की गणना की गई (अंदर फ्लोरेसेंस/अंदर + अंदर फ्लोरेसेंस) और हर बार छवि बिंदु के लिए दिखाए जाते हैं । अलग-अलग आकारों के ऑर्गनॉइड की इमेजिंग से बचने की सिफारिश की जाती है। हमने 80 ± 30 माइक्रोन(चित्रा 2)के व्यास वाले ऑर्गेनॉइड पर ध्यान केंद्रित करने का फैसला किया। प्रतिनिधि छवियों के साथ प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रित चित्र 3में दिखाया गया है। कुछ प्रमुख समस्याओं और समस्या निवारण तकनीकों को चित्र4में दिखाया और चर्चा की जाती है ।

Figure 1
चित्रा 1: आंतों की बाधा अखंडता माउस ऑर्गेनॉइड में विश्लेषण किया जा सकता है। आईएफएन-आरडब्ल्यूटी और आईएफएन-आर 2 से आंतोंΔIEC के ऑर्गेनॉइड को आईएफएन-ए-की उपस्थिति में 48 एच के लिए सुसंस्कृत किया गया था या अनुपचारित छोड़ दिया गया था।WT आंतों की बाधा की अखंडता की जांच करने के लिए, LY (457 डीए) जोड़ा गया था और कुल 70 मिन के लिए 5 मिन अंतराल में कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट छवियों को कैप्चर किया गया था। टाइम पॉइंट 0 मिन, 70 मिन में प्रतिनिधि छवियां, और ईजीटीए के अलावा दिखाए जाते हैं (हरा = लूसिफ़ेर पीला; स्केल बार = 20 माइक्रोन)। इस आंकड़े को बार्डनबाचर एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: छोटे आंतों ऑर्गेनोइड बैरियर अखंडता मॉडल मात्रात्मक परिणाम प्रदान करता है। (क)LY फ्लोरेसेंस ऑर्गेनोइड के अंदर और बाहर निर्धारित किया गया था। प्रारंभिक सापेक्ष तीव्रता + एसईएम के सापेक्ष सापेक्ष तीव्रता मूल्यों की गणना (अंदर/अंदर + अंदर) की गणना की गई थी और प्रत्येक समय बिंदु के लिए दिखाया गया है। (ख)विश्लेषण किए गए ऑर्गनॉइड का आकार वितरण। सतह से मात्रा अनुपात में परिवर्तन के कारण मानक विचलन और त्रुटियों को कम करने के लिए, हमने केवल 80 ± 30 माइक्रोन के व्यास वाले ऑर्गेनॉइड का विश्लेषण किया। संबंधित ऑर्गेनोइड व्यास के मतलब मूल्यों को + एसडी (आईएफएन-आर2डब्ल्यूटी,एन = 20; IFN-1R2ΔIEC मतलब व्यास मूल्यों में विभिन्न समूहों (एक तरह से ANOVA) के बीच काफी भिन्नता नहीं थी। (ग)LYके अलावा ऑर्गेनॉइड की सामर्थ्य 70 मिन निर्धारित की गई थी। इसे अवलोकन अवधि के दौरान मापी गई न्यूनतम सापेक्ष फ्लोरेसेंस तीव्रता द्वारा 70 न्यूनतम के बाद इंट्राल्यूमिनल फ्लोरेसेंस तीव्रता को विभाजित करके परिभाषित किया गया था। प्रत्येक बार मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है + एसडी, दो स्वतंत्र प्रयोगों (IFN-1N-1R2WT,n = 20) से प्राप्त 10 ऑर्गेनोइड में मापा जाता है; IFN-1R2ΔIEC आईएफएन-ए-ने केवल आईएफएन-आर2डब्ल्यूटी ऑर्गेनॉइड में एलवाई तेज में काफी वृद्धि की। छात्र टी-टेस्ट में पी-वैल्यू & 0.001। इस आंकड़े को बार्डनबाचर एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि छवियों के साथ योजनाबद्ध प्रोटोकॉल। (A)प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों का योजनाबद्ध विवरण। (ख)प्रोटोकॉल के प्रमुख कदमों की प्रतिनिधि तस्वीरें । (B1) एक उपयुक्त ऑर्गेनोइड के माध्यम से एक केंद्रीय स्लाइस की डीआईसी माइक्रोस्कोपी छवि जिसे पारगम्यता विश्लेषण के लिए चुना गया था। बिंदीदार रेखा LYको जोड़ने से पहले 89 माइक्रोन(B2)फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तस्वीर में एक ही ऑर्गनॉइड की(B1)की चौड़ाई का प्रतिनिधित्व करती है। छवि ऑर्गेनॉइड के ऑटोफ्लोरेसेंस को दिखाती है। (B3) LYके अलावा एक ऑर्गेनोइड 70 मिन। चित्रित ऑर्गेनोइड LY का कोई तेज नहीं दिखाता है और इसलिए एक अक्षुण्ण बाधा कार्य करता है। बिंदीदार लाइनें आगे के विश्लेषण के लिए आरओआई दिखाती हैं। ऑर्गेनॉइड के आंतरिक लुमेन और ऑर्गेनॉइड के आसपास के तीन प्रतिनिधि क्षेत्र चिह्नित किए जाते हैं। (B4) ईजीटीए के अलावा के बाद एक ऑर्गेनोइड। ऑर्गेनॉइड आगे के विश्लेषण के लिए प्रयोज्य है क्योंकि यह ईटीए उपचार के बाद LY तेज दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आम समस्याओं की समस्या निवारण। (क)सामान्य समस्याओं और समाधानों के साथ तालिका । (ख)अनुकरणीय छवियां । (B1) एक बड़े बहुशाखाकृत ऑर्गेनॉइड की डीआईसी छवि जो इस परख के लिए उपयुक्त नहीं है। (B2)। LYको मीडियम में जोड़े जाने से पहले हाई ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करने वाले ऑर्गेनॉइड की कॉन्फोकल इमेज। ऑर्गेनॉइड को क्वांटिफिकेशन से बाहर रखा गया था। (B3) LYको मीडियम में जोड़े जाने से पहले कम ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करने वाले ऑर्गेनॉइड की कॉन्फोकल इमेज। इस मामले में फ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित की गई थी । (B4) ऑर्गेनॉइड ईजीटीए के अलावा मध्यम 30 मिन से कोई LY तेज नहीं दिखा रहा है और इसलिए क्वांटिफिकेशन से बाहर रखा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह परख जीवित ऑर्गेनॉइड के भीतर आंतों की बाधा अखंडता का अध्ययन करने की तकनीक प्रदान करती है। पूरी परख छोटे आंतों के माउस ऑर्गनॉइड और कॉन्फोकल लाइव सेल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है। इसलिए ऑर्गनॉइड की उचित हैंडलिंग का अभ्यास पहले से करना अनिवार्य है। अलगाव पर, ऑर्गेनॉइड को नियमित रूप से विभाजित किया जा सकता है और क्रायोफ्रीजिंग3,,9द्वारा संग्रहित किया जा सकता है। इस परख के लिए हम उपचार शुरू होने से पहले ऑर्गेनॉइड 48 एच को विभाजित करने की सलाह देते हैं। यह अवधि ऑर्गेनॉइड को पूरी तरह से बंद करने और गोलाकार संरचनाओं के रूप में मौका देती है। प्रयोग के लिए ऑर्गेनॉइड की सीडिंग परख के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम है। व्यक्तिगत हैंडलिंग विविधताओं को कम करने के लिए, हम सीडिंग प्रक्रिया के लिए एक नियमित प्रक्रिया की सलाह देते हैं। यह कदम महत्वपूर्ण है, और एक नियमित हैंडलिंग प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से प्रयोगात्मक विविधताओं को कम कर देता है ।

सीडिंग प्रक्रिया (चरण 1.7) के दौरान ऑर्गेनॉइड एक मानक 10 μL पिपेट टिप के माध्यम से दोहराव वाले पासिंग से खंडित हो जाते हैं। इस उत्पाद का पोर आकार कंपनी से लेकर कंपनी तक अलग-अलग होता है। इस प्रक्रिया को पहले से अभ्यास किया जाना चाहिए, और परिणाम हमेशा चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जानी चाहिए । एक बार ऑर्गेनॉइड वांछित आकार तक पहुंचने के बाद, प्रक्रिया को न बदलें।

ऑर्गनॉइड की सीडिंग को अनुकूलित और उपलब्ध सूक्ष्म सेटअप के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। कम से कम 48 घंटे के लिए संस्कृति और छवि ऑर्गेनॉइड करने में सक्षम होने के लिए, एक इनक्यूबेटेड माइक्रोस्कोप चैंबर की बिल्कुल आवश्यकता है। एक चैम्बर कवरस्लिप चुनें जो आपकी आवश्यकताओं से मेल खाता है। ऑर्गेनॉइड को सीडिंग करते समय, कवरस्लिप सतह पर ऑर्गेनॉइड को ध्यान केंद्रित करना सुनिश्चित करें। सेल मैट्रिक्स-ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन रखने के बाद 5 मिन के लिए आइस पैक पर चैम्बर कवरस्लिप रखकर यह संभव है। कॉन्फोकल लाइव सेल इमेजिंग की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप लेंस की अक्षीय संकल्प और कार्य दूरी विशेष रूप से सीमित है। करीब आप लेंस के लिए नमूना लाने के लिए, बेहतर आप इसे छवि कर सकते है और कम लेजर ऊर्जा LY फ्लोरेसेंस उत्तेजित करने की जरूरत है ।

जब लाइव सेल माइक्रोस्कोपी की बात आती है तो फोटोटैक्सिस एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। इस परख के भीतर हम इस विकल्प को बाहर करते हैं। एक कार्यात्मक एजेसी ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन(चित्रा 1,पीबीएस) से LY के बहिष्कार से दिखाई देता है। प्रयोग के अंत में ईजीटीए के अलावा बाइवेलेंट आयनों की तनहा का कारण बनता है, जो एजेसी प्रोटीन के लिए सहकारक हैं। LYको केवल एक कार्यात्मक एजेसी परिसर के साथ महत्वपूर्ण ऑर्गनॉइड में ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन से बाहर रखा गया है। सामान्य तौर पर, आंतों की बाधा की अखंडता को मापने के लिए फ्लोरोसेंट अणुओं का उपयोग किया जा सकता है। हमने अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस जैसे फ्लोरोसेसिन लेबल ्ड्टिन के बजाय LYको चुना क्योंकि उन्हें आंतों की कोशिकाओं में बेसल से एपिकल डिब्बे9तक ले जाया जाता है । हमने अपने छोटे आकार की वजह से भी LY को चुना । LYके पास 457 डीए का आणविक वजन है और इसलिए छोटे अणुओं के लिए बाधा पारगम्यता की जांच की सुविधा प्रदान करता है। फ्लोरोसेंट अणु की जांच किए गए वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर चुना जाना चाहिए । क्योंकि फोटोटॉक्सिक एजेसी दोष मौजूद हैं, लेजर उत्तेजना ऊर्जा को कम करना होगा या इमेजिंग अंतराल बढ़ाया जाना चाहिए। इस परख के लिए इष्टतम कॉन्फोकल इमेजिंग तकनीक डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई है। संबंधित उपकरण कम लेजर पावर पर कम एक्सपोजर समय के साथ कॉन्फोकल इमेजिंग को सक्षम करते हैं।

विट्रो में आंतों की बाधा अखंडता का अध्ययन करने के लिए विभिन्न मॉडल पहले ही विकसित किए जा चुके हैं। जबकि वीवो में सेल लाइन मोनोलेयर या प्रयोगों के आधार पर परखों का उपयोग घट रहा है, ऑर्गेनोइड आधारित तरीके बढ़ रहे हैं। पहले4,,5,,6,7वर्णित तरीकोंकेविपरीत, हमारी विधि समय के साथ बाधा कार्य की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है। यह प्रयोग के दौरान ऑर्गेनॉइड के अतिरिक्त उत्तेजनाओं के संपर्क की अनुमति देता है। यहां हम एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग के अंत में एक दूसरी उत्तेजना के रूप में EGTA लागू होते हैं ।

वीवो की स्थिति केविपरीत, हमारी परख में LY को माध्यम में जोड़ा जाता है और अंदर के एपिकल ल्यूमेन की ओर बाहर के बासोलेटरल एपिथेलियल साइड से ऑर्गेनोइड में प्रवेश करता है। LY छोटा है और केवल आंतों की बाधा की जकड़न की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अणुओं और उत्तेजनाओं कि apical सतह पर एपिथेलियल परत मिलाना है ऑर्गेनॉइड ल्यूमेन7में इंजेक्शन की जरूरत है । प्रायोगिक प्रयास को कम करने और एक ही समय में कई ऑर्गेनॉइड की बाधा अखंडता को मापने में सक्षम होने के लिए, हमने बाहर से फ्लोरोसेंट डाया लागू करने का फैसला किया।

हमने छोटे आंतों के माउस ऑर्गेनॉइड के तंग जंक्शन पर आईएफएन-एके के फ़ंक्शन की जांच करने के लिए परख का इस्तेमाल किया। तथ्य यह है कि हम जीवित ऑर्गेनॉइड में बाधा अखंडता का विश्लेषण करने में सक्षम थे, आंतों की बाधा के सूजन-प्रेरित टूटने के लिए अवरोधकों का वर्णन करने के लिए इस तकनीक को लागू करने के लिए भविष्य की संभावनाएं प्रदान करता है। ऐसे पदार्थ जो आईएफएन-ए-की वजह से बिगड़ा बैरियर फ़ंक्शन का प्रतिकार करते हैं, वे भड़काऊ आंत्र रोगों के उपचार के लिए उम्मीदवार हो सकते हैं, जिसमें बिगड़ा बाधा कार्य रोगजनक कारकों में से एक है10।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) [KFO257, प्रोजेक्ट 4 से एम.एस. और प्रोजेक्ट 1 से सीबी; FOR2438, परियोजना 2 से एम.एस. और ई.एन. और परियोजना 5 से सीबी; SFB1181 परियोजना C05 से C.B.; TRR241, परियोजना A06 से N.B.L. और एमएस, परियोजना A03 से C.B., BR5196/2-1 से N.B.L. और BE3686/2 से C.B.] ; नैदानिक केंद्र एर्लैंगन (एम. एस., ई.एन., और एम. बी.), डब्ल्यू लुट्ज स्टिफतुंग (एम.एस.) और नैदानिक केंद्र एर्लांगन (एम.एस.) के Forschungsstiftung Medizin के नैदानिक अनुसंधान के लिए अंतःविषय केंद्र (IZKF) । वर्तमान कार्य मार्को Bardenbacher की डिग्री डॉ मेड प्राप्त करने के लिए आवश्यकताओं की (आंशिक) पूर्ति में किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well culture plate Thermo Fisher Scientific #150687
8-well chamber slides Ibidi #80826
96-well culture plate Greiner Bio-One #655101
Axio Observer.Z1 - spinning disc Zeiss excitation laser 488 nm / emission filter 525/25
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell strainer Falcon 352350
Centrifugation tube 15 mL Thermo Fisher Scientific 11507411
Centrifugation tube 50 mL Thermo Fisher Scientific 10788561
EDTA Sigma-Aldrich 431788-25g
EGTA Sigma-Aldrich 431788
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich L0259
Matrigel, growth factor reduced, phenol red free Corning 356231 Cell matrix solution
Mice The Jackson Laboratory M. musculus C57/Bl6
Microscope coverslip 24 mm x 60 mm
Organoid Growth Medium mouse Stemcell Technologies #06005
Phosphate buffered saline Biochrom L182-05
Recombinant murine IFN-γ Biolegend Cat#575304

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References

  1. López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).
  2. Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20, (1), 91-99 (2014).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  4. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83, (1), 138-145 (2015).
  5. Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5, (1), 16831 (2015).
  6. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16, (1), 19 (2018).
  7. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
  8. Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
  9. Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22, (3), 330-331 (1999).
  10. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews: Immunology. 9, (11), 799-809 (2009).
लिविंग ऑर्गेनॉइड में आंतों की बाधा टूटने की जांच
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Bardenbacher, M., Ruder, B., Britzen-Laurent, N., Naschberger, E., Becker, C., Palmisano, R., Stürzl, M., Tripal, P. Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids. J. Vis. Exp. (157), e60546, doi:10.3791/60546 (2020).More

Bardenbacher, M., Ruder, B., Britzen-Laurent, N., Naschberger, E., Becker, C., Palmisano, R., Stürzl, M., Tripal, P. Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids. J. Vis. Exp. (157), e60546, doi:10.3791/60546 (2020).

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