Summary
Het doel van dit protocol is om een nieuwe methode voor de beoordeling van de segmentale cardiale functie bij embryonale zebravissen onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden te beschrijven.
Abstract
Zebravissen worden steeds meer gebruikt als een model organisme voor cardiomyopathies en regeneratie. Huidige methoden evaluatie cardiale functie niet op betrouwbare wijze detecteren segmentale mechanica en zijn niet gemakkelijk haalbaar bij zebravissen. Hier presenteren we een semigeautomatiseerde, open-source methode voor de kwantitatieve beoordeling van vierdimensionale (4D) segmentale hartfunctie: verplaatsingsanalyse van myocardiale mechanische vervorming (DIAMOND). Transgene embryonale zebravissen werden in vivo afgebeeld met behulp van een lichtbladfluorescentiemicroscopiesysteem met 4D-hartbewegingssynchronisatie. Verworven 3D digitale harten werden gereconstrueerd op end-systole en end-diastole, en de ventrikel werd handmatig gesegmenteerd in binaire datasets. Vervolgens werd het hart geheroriënteerd en isotropisch opnieuw gesampled langs de ware korte as, en de ventrikel werd gelijkmatig verdeeld in acht porties (I-VIII) langs de korte as. Vanwege de verschillende resampling vlakken en matrices bij end-systole en end-diastole, werd een transformatiematrix toegepast voor beeldregistratie om de oorspronkelijke ruimtelijke relatie tussen de opnieuw gesamplede systolische en diastolische beeldmatrices te herstellen. Na beeldregistratie werd de verplaatsingsvector van elk segment van eind-systole tot end-diastole berekend op basis van de verplaatsing van massacentroids in drie dimensies (3D). DIAMOND toont aan dat basale myocardiale segmenten grenzend aan het atrioventriculair kanaal de hoogste mechanische vervorming ondergaan en het meest vatbaar zijn voor doxorubicin-geïnduceerde cardiale letsel. Over het algemeen biedt DIAMOND nieuwe inzichten in segmentale cardiale mechanica in zebravissenembryo's dan de traditionele uitwerpfractie (EF) onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden.
Introduction
Door chemotherapie veroorzaakte harttoxiciteit en daaruit voortvloeiende hartfalen zijn een van de belangrijkste redenen voor het staken van chemotherapie1. Daarom speelt cardiale functionele beoordeling een cruciale rol bij de identificatie van cardiale toxiciteit en, nog belangrijker, bij de voorspelling van vroeg cardiale letsel na chemotherapie2. De huidige benaderingen voor cardiale functionele beoordeling ondervinden echter beperkingen. Methoden zoals linker ventriculaire uitwerpfractie (LVEF) bieden alleen globale en vaak vertraagde hartmechanica na letsel3,4. Weefsel Doppler beeldvorming biedt segmentale myocardiale vervorming informatie, maar lijdt aan aanzienlijke intraobserver en interobserver variabiliteit, deels als gevolg van echografie straalhoek afhankelijkheid5. Tweedimensionale (2D) speckle tracking maakt gebruik van de B-modus van echocardiografie, die theoretisch elimineert de hoek afhankelijkheid, maar de nauwkeurigheid ervan wordt beperkt door out-of-plane beweging6. Daarom ontbreekt een rigoureuze aanpak voor het kwantificeren van de segmentale hartfunctie in zowel onderzoeks- als klinische omgevingen.
In deze context ontwikkelden we een 4D kwantificeringsmethode voor de analyse van de segmentale hartfunctie die we verplaatsingsanalyse van myocardiale mechanische vervorming (DIAMOND) noemden, om de verplaatsingsvectoren van myocardiale massacentroids in de 3D-ruimte te bepalen. We hebben DIAMOND toegepast voor de in vivo beoordeling van de hartfunctie en doxorubicin-geïnduceerde cardiale toxiciteit met zebravissen (Danio rerio) als het dier model, gekozen vanwege hun regenererende myocard en zeer geconserveerde ontwikkelingsgenen7. We vergeleken verder segmentale DIAMANT verplaatsing met global ejection fraction (EF) bepaling en 2D-stam na doxorubicin behandeling. Door de integratie van DIAMOND verplaatsing met 4D light-sheet fluorescentmicroscopie (LSFM) verworven weergave van embryonale zebravis harten, DIAMOND toont aan dat de basale myocardiale segmenten grenzend aan de atrioventriculair kanaal ondergaan de hoogste mechanische vervorming en zijn het meest gevoelig voor acute doxorubicin hartletsel8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het UCLA Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door het UCLA Office of Animal Research.
1. Foktg(cmlc2:mCherry) zebravis en inzameling van embryo's
- Volg de procedures voor huisvesting, fokken en embryo's zoals beschreven in eerder gevestigde veehouderij- en fokpraktijken. Zie Messerschmidt et al.9.
- Behandel de verzamelde embryo's met 0,003% 1-fenyl-2-thiourea (PTU) in E3 medium 18 h postbevruchting om de transparantie van de embryo's voor LSFM-beeldvorming te behouden.
2. Doxorubicinbehandeling om hartletsel op te wekken
- Behandel bij 3 dagen nabevruchting (dpf) de embryo's met doxorubicin met een concentratie van 10 μM in e3-viswatermedium. Vervang na een behandeling van 24 uur tot 4 dpf het doxorubicinmedium door vers E3 medium.
LET OP: Doxorubicin is een chemotherapie medicatie. Er is passende persoonlijke beschermingsmiddelen (BESCHERMINGSMIDDELEN) vereist en het afval moet worden afgevoerd in afvalcontainers met biohazard.
3. Notch pad modulatie
- Behandel zebravissenembryo's met de Notch-padremmer (2S)-N-[(3,5-difluorofenyl)acetyl]-L-alanyl-2-fenyl]glycine 1,1-dimethylethylester (DAPT) bij een concentratie van 10 μM in E3-viswatermedium van 3-6 dpf.
- Microinjecteer de Notch downstream effectors Notch intracellulair domein (NICD) en Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA bij concentraties van respectievelijk 10 pg/nL en 5 pg/nL in de 1-cel trap zebravis embryo's8,10.
OPMERKING: De micro-injectie wordt uitgevoerd onder een microscoop met de steun van een luchtpomp om het geïnjecteerde volume nauwkeurig te regelen. De mRNA micro-injectie in de cel wordt gedaan wanneer de bevruchte eicel zich in de eerste celfase bevindt. Zie Chen et al.8. Zie Rosen et al.10voor meer informatie over de micro-injectie en de bereiding van injectienaalden.
4. LSFM-beeldvorming en synchronisatie van de beeldvorming na de beeldvorming
- Voor de LSFM-beeldvormingstechnieken en het post-imaging synchronisatiealgoritme zie details in eerdere publicaties9,11.
OPMERKING: Kort, ons systeem maakt gebruik van een continue-golf laser als de verlichting bron om beeld alle transgene zebravis lijnen. De detectiemodule bestaat uit twee wetenschappelijke complementaire metaaloxide halfgeleider (sCMOS) camera's en twee sets filters voor dual-channel beeldvorming. De detectiemodule wordt loodrecht op het verlichtingsvlak geïnstalleerd. Elk LSFM-frame wordt binnen een belichtingstijd van 20 msec verkregen, terwijl het oplossende vermogen in dwarsdoorsnede ~ 0,65 μm is en de stapgrootte tussen opeenvolgende frames ~ 2 μm is. Een 589 nm laser werd gebruikt om mCherry tl-signalen te prikkelen.
5. Reconstructie van het 3D-systolische en diastolische hart
- Open de map die is gemaakt door het algoritme voor postsynchronisatie en open vervolgens de mapUitvoer. Selecteer het middelste vlak van het hart en laad de hele map in ImageJ. Zoek de eerste diastolische en systolische fase en neem het framenummer op.
- Open de map Uitvoer/Op staat en zoek de mappen met dezelfde nummers als de zojuist opgenomen framenummers. Zet de afbeeldingen in de map om in 3D TIFF-bestanden (gelabelde afbeeldingsbestandsindeling) en geef ze de naam "diastole.tif" en "systole.tif".
6. Segmentatie van de ventrikel
- Open de software voor beeldanalyse (zie Tabel met materialen). Klik op Bestand | Open gegevensen laad "diastole.tif" en "systole.tif". Voer de voxel grootte volgens de beeldvorming instellingen.
OPMERKING: Voor het gebruikte LSFM-systeem is de typische voxelgrootte 0,65 μm x 0,65 μm x 2 μm. - Klik op het paneel "SEGMENTATIE"en segmenteer handmatig het ventrikelgedeelte van het hart. Het ingebouwde"Drempel"gereedschap dat alle regio's boven een bepaalde intensiteit kan selecteren, kan dit proces vergemakkelijken. De ventrikel is de dikkere kamer met een sterkere fluorescentie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het atrioventriculaire kanaal en het uitstroomkanaal in de gesegmenteerde ventrikel verwijdert, omdat dit van invloed is op de verplaatsingsanalyse. - Nadat de segmentatie is uitgevoerd, klikt u op het deelvensterProject. Klik met de rechtermuisknop op de" diastole. Labels.tifensystole. Labels.tif" tabbladen in de console en klik op "Gegevens exporteren als" om de gegevens op te slaan als 3D TIFF-bestanden.
7. Creatie van rechthoekige parallelpipeds voor beeldregistratie
- Run "prepImage_1.m" in de programmeeromgeving (zie Tabel met materialen). Open "prepImage_1.m", "ImPath" in regel 5, zodat de map de originele en gesegmenteerde TIFF-bestanden bevat en "slice" in lijn 4 wijzigt in het aantal segmenten van de 3D-tif-bestanden.
- Na het uitvoeren van de code genereert het vijf nieuwe 3D TIFF-bestanden ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" en "sysLabel200.tif") en twee nieuwe mappen ("resample_dia" en "resample_sys").
8. Systolische en diastolische 3D-harten opnieuw samplen langs het korte asvlak
- Importeer alle vijf 3D TIFF-bestanden in de software voor beeldanalyse (zie Tabel met materialen).
LET OP: De voxel grootte is ongewijzigd. - Ga naar het MULTIPLANAR-paneel. Kies 'diastole_200.tif' als primaire gegevens. Lijn de X-as (de groene lijn in het XY-vlak) uit met de verticale lange as van de ventrikel en lijn de Z-as (de rode lijn in het YZ-vlak) uit met de horizontale lange as van de ventrikel.
OPMERKING: De verticale lange as wordt bepaald door het vinden van de langste as die de top en het uitstroomkanaal in het XY-vlak verbindt, en de horizontale lange as wordt bepaald door het vinden van de langste as die de top en het uitstroomkanaal in het YZ-vlak verbindt. Draai de as door de cursor aan het einde van de as te plaatsen. - Kies drie willekeurige punten uit het schuine YZ-vlak (het korte asvlak) tegen de klok in en noteer hun 3D-positiecoördinaten.
LET OP: Zorg ervoor dat de punten tegen de klok in worden gekozen. - Herhaal stap 8.2 en 8.3 voor "systole_200.tif".
- Klik op het deelvensterPROJECT. Maak een object"Segment"voor 'diastole_200.tif' door met de rechtermuisknop op 'diastole_200.tif' te klikken en te zoeken naar object' Segment'. Links op het object Segment net gemaakt en in het deelvenster Eigenschappen | Opties, check "Set Plane" en kies drie punten in "Plane Definition". Voer de coördinaten van de drie punten in vanaf stap 7.3.
- Herhaal stap 8.5 voor "systole_200.tif".
OPMERKING: Het gemaakt segmentobject moet de naam "Slice 2" hebben. - Klik met de rechtermuisknop op 'diastole_200.tif' en zoek naar 'Getoomgetransformeerde afbeeldingopnieuw' en maak het object. Kies in het deelvenster Eigenschappen "Segment" als de "Referentie" en klik op Toepassen. Dit zou een object met de naam" diastole_200.getransformeerd" moeten genereren.
- Klik met de rechtermuisknop op "diastole_200.transformed" en zoek naar "Resample" en maak het object. Kies "Voxel Size" als de "Mode" en verander "Voxel Size" om x = 1, y = 1 en z = 1 te zijn in het deelvenster Eigenschappen.
- Klik op "Toepassen". Dit moet een object genereren met de naam" diastole_200.opnieuw gesampled". Klik met de rechtermuisknop op 'diastole_200.resampled' en sla het op als een 3D TIFF-bestand.
- Herhaal dezelfde stap voor "diaLabel.tif" en "test.tif". Sla 'diaLabel.resampled' en "test.resampled" op als 3D TIFF-bestanden. Herhaal dezelfde stap voor "systole_200.tif", "sysLabel.tif" en "test.tif" met "Slice 2" als referentie, en sla "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" en "test2.resampled" op als 3D TIFF-bestanden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er in deze stap in totaal zes TIFF-bestanden zijn opgeslagen.
9. Verdeling van het hermonsterde hart
- Importeer alle zes opnieuw gesamplede bestanden van stap 8 naar ImageJ. Selecteer een stukje "systole_200.resampled" waarin het atrioventriculaire kanaal duidelijk wordt gevisualiseerd. Neem het nummer van het segment op.
- Gebruik de "Afbeelding | Transformatie | Draai" functie van ImageJ, zodat het atrioventriculaire kanaal verticaal is. Pas dezelfde rotatie toe op alle bestanden. Sluit alle vensters en sla alle wijzigingen op.
- Verplaats "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" en "test.resampled" naar de map "resample_dia" en verplaats "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" en "test2.resampled" naar de map "resample_sys".
- Open "divider_2_8_pieces.m". Verander "ImPath" in regel 5 en "ImPath" in regel 395 in de afbeeldingsmap. Verander de variabele "Midden" in lijn 22 en lijn 411 in de snijnummers waarbij het atrioventriculaire kanaal duidelijk wordt gevisualiseerd in "systole_200.resampled" en "diastole_200.resampled".
- Voer de code, en in de gevraagde vensters klik een keer in het midden van de ventrikel en klik een keer in het midden van de atrioventriculaire kanaal. Dit moet twee keer worden gedaan voor zowel systole en diastole beelden.
10. Registratie van systolische en diastolische beeldmatrices
- Open 'register_3.m' en wijzig'ImPath'in regel 4 in het pad met de afbeeldingsmap. Het kan 5-20 min duren om deze code uit te voeren, afhankelijk van de rekenkracht van het systeem.
OPMERKING: De kunstmatig gecreëerde rechthoekige parallelpipeds in stap 7 worden gebruikt voor 3D-rigide registratie die de afstand tussen twee punten en hoeken met drie punten behoudt. Wanneer de einddiastole rechthoekige parallelepiped (rood) is geregistreerd op de eind-systole rechthoekige parallelepiped (groen), de daaruit voortvloeiende discrepant 3D-locatie maakt het mogelijk de afleiding van een unieke matrix van rigide transformatie bestaande uit rotatie en vertaling van de end-diastole matrix naar de end-systole matrix (figuur 1H). We voeren de registratie uit en regulariseerden energieminimalisatie om de matrix na de transformatie te denoiseen met behulp van een gereedschapskist voor beeldverwerking (zie Tabel met materialen). Voor een gedetailleerde wiskundige beschrijving, zie Chen et al.8.
11. Uitvoer van de verplaatsingsvectoren
- Open "displacement_4.m" en verander "ImPath" in regel 4 in het pad van de afbeeldingsmap.
- Voer "displacement_4.m" uit, dat een "vector8.txt"-bestand genereert in de map 'vectoren'. Zodra het bestand "vector8.txt" is geopend, zal er een 8 x 4 matrix zijn. Elke rij van de matrix heeft vier getallen, dat zijn de grootheden van de X-component, Y-component, Z-component en de som-grootte van de verplaatsingsvector van een specifiek segment van de ventrikel.
OPMERKING: De verplaatsingsvector wordt verkregen door de verplaatsing van de massacentroid van elk segment in 3D-ruimte te berekenen. We berekenen de 3D-massa centroid (P
S en PD)coördinaten (waarbij k respectievelijk de X-, Y- of Z-coördinaat aangeeft) van elk segment (I-VI) in de segmentatiegegevensset van systole tot diastole(figuur 1J). We definiëren de massa centroid in 3D-ruimte als volgt:
waar Cx = X, Cy = Y en Cz = Z, Mi = de massa van elk segment (I ≤ i ≤ VI), m = het aantal voxels van elk segment en ρ = de dichtheidsfunctie als gesegmenteerde regio 1 is, terwijl de rest 0 is. De L2-norm van de subverplaatsingsvectoren langs de X-, Y- en Z-assen en de somverplaatsingsvector worden berekend tijdens de hartcyclus. Er zijn in totaal acht rijen in de matrix. De eerste rij en de achtste rij bevatten het atrioventriculaire kanaal en worden dus genegeerd in onze analyse. Segmenten I tot VI worden vertegenwoordigd door de tweede rij naar de zevende rij.
S en PD)coördinaten (waarbij k respectievelijk de X-, Y- of Z-coördinaat aangeeft) van elk segment (I-VI) in de segmentatiegegevensset van systole tot diastole(figuur 1J). We definiëren de 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het proces waarmee DIAMOND is ontwikkeld om de 3D-segmentale hartfunctie te beoordelen, wordt gepresenteerd in figuur 1. Na lsfm beeldverwerving en wederopbouw in 3D van het embryonale zebravishart (Figuur 1A), werd het ware korte asvlak bepaald als het vlak loodrecht op de verticale en horizontale lange assen, die beide worden bepaald in een meerdekker -viewer (figuur 1B). Het hart werd vervolgens opnieuw gesampled langs de korte as vlak (Figuur 1C), en verdeeld in acht gelijke segmenten gevormd door gelijkmatige hoeken volgens een virtuele verdeling lijn (rode stippellijn) het aansluiten van het centrum van de endocardiale ventriculaire holte naar het midden van het atrioventriculaire kanaal (Figuur 1E). De 3D-afbeeldingen van de geïdentificeerde segmenten worden geïllustreerd in een dwarsdoorsnedeweergave (figuur 1F) en in vergelijking met de ruwe gegevens (figuur 2). Segmenten VII en VIII werden uit de analyse verwijderd omdat ze het atrioventriculaire kanaal omvatten en dus minder myocardbevatten in vergelijking met andere segmenten. De verschillende resampling-vlakken voor end-systole (HS)en end-diastole (HD)leiden tot verschillende coördinatensystemen voor end-systolische en end-diastolische matrixen, die moeten worden geregistreerd om hun oorspronkelijke ruimtelijke relatie te herstellen (figuur 1G). Het coördinatensysteem van de end-systolische matrix werd gekozen als referentie voor consistentie. Om de transformatiematrix (Tm)te bepalen van de end-diastolische matrix tot de end-systolische matrix, is vrijwel een matrix van drie parallelpipeds gemaakt, die asymmetrisch is in 3D en dezelfde dimensie heeft als de oorspronkelijke beeldmatrix. De parallelepipeds werden twee maal opnieuw gesampled, eerst in het korte asvlak van de eind-systole matrix, en vervolgens in het korte asvlak van de eind-diastole matrix, wat leidt tot verschillende getransformeerde parallelepipeds voor end-systole (groen) en end-diastole (rood) (Figuur 1H).
De groene en rode parallelepipeds werden vervolgens samen geregistreerd door een rigide lichaam registratie algoritme en Tm werd berekend en toegepast op de end-diastole matrix om de coördinaten te herstellen (Figuur 1I). Dit proces maakt het mogelijk om tijdens de hartcyclus(figuur 1J)de 3D-ruimte van de verplaatsingsvectoren van massacentroids uit elk segment van de hartkamer te volgen. DIAMOND verplaatsing van ventriculaire segmenten I-VI kan worden gevolgd tijdens meerdere tijdpunten in de hartcyclus(figuur 1K), die kan worden vereenvoudigd voor kwantitatieve analyse tot twee tijdpunten, variërend van end-systole tot end-diastole(figuur 1L). De segmenten gegenereerd door DIAMOND kunnen worden gevisualiseerd in figuur 2, waar elke kleur vertegenwoordigen een hartsegment.
Met DIAMOND ontdekten we segmentale heterogeniteit van de hartfunctie en de gevoeligheid voor doxorubicin-geïnduceerde myocardiale letsel bij zebravissen. Na een behandeling van 24 uur met 10 μM doxorubicin van 3-4 dpf(figuur 3A),vergeleken we diamond verplaatsing van ventriculaire segmenten tussen controle en met chemotherapie behandelde groepen(figuur 3B) en 48 uur na de behandeling(figuur 3C). Alle DIAMOND-figuren volgen hetzelfde grafische patroon als de opnieuw gesamplede ventrikels langs de korte as (figuur 1E). De gegevens worden gepresenteerd als percentages door het normaliseren van de L2-norm van de verplaatsingsvector naar de binnenste omtrek van het hart, met de X (groen), Y (blauw) en Z componenten (oranje) geïllustreerd als hun gewogen bijdragen. Bij 4 dpf varieerde de gemiddelde L2-norm van de segmentale verplaatsingsvectoren in controlevissen van 6,6-11,3 μm of 3,8-6,6% na normalisatie. Onze resultaten geven aan dat onder controleomstandigheden de basale segmenten I en VI de grootste verplaatsingen ondergaan en degenen zijn die het meest vatbaar zijn voor door doxorubicin geïnduceerde cardiale schade(figuur 3B, 29% daling van 6,6-4,7%, n = 10 controle en n = 8 doxorubicin, p < 0,01). Bij 6 dpf varieerde de gemiddelde L2-norm van de segmentale verplaatsingsvectoren in de controlevis van 6,8-14 μm, of 3,9-8% na normalisatie. Bij 6 dpf herstelden de basale segmenten I en VI de DIAMANT-verplaatsing naar controleniveaus, wat wijst op segmentale regeneratie(figuur 3C, n = 10 controle en n = 8 doxorubicin). Tegelijkertijd werd een verslechtering van de 2D-basale stam van -53 tot -38% waargenomen bij 4 dpf na doxorubicinbehandeling, gevolgd door een terugkeer naar controleniveaus bij 6 dpf, wat de resultaten van de DIAMANTverplaatsing bevestigt(figuur 3D, 3E). Er werd ook een parallelle daling van de globale uitwerpfractie waargenomen in reactie op doxorubicin bij 4 dpf met herstel bij 6 dpf (figuur 3F, 3G).
Vervolgens hebben we DIAMOND toegepast tijdens doxorubicin behandeling en Notch pad modulatie met behulp van de Notch remmer DAPT en redding met notch downstream effectors NICD en NRG1 mRNA (Figuur 4A). NICD en NRG1 mRNA micro-injectie gered de daling van diamond verplaatsing en EF na acute chemotherapie-geïnduceerde schade op 4 dpf (Figuur 4B, 4D). Blootstelling aan de Notch-remmer DAPT samen met doxorubicin leidde tot een meer diffuse afname van de DIAMANT-verplaatsing, naast de basale segmenten I en VI (figuur 4B). Bovendien belemmerde remming van de Notch-route na chemo-geïnduceerde verwonding en het herstel van DIAMOND-verplaatsing van de basale segmenten en EF bij 6 dpf verder. De remming werd gered door de Notch downstream-effectoren NICD en NRG1 (figuur 4C, 4E).
Figuur 1: 4D DIAMOND verplaatsingsontwikkeling. (A) Ruwe beelden werden vastgelegd door licht-sheet fluorescerende microscopie. (B en C) Gereconstrueerd 3D-hart werd opnieuw gesampled langs de echte korte as vlak weergave. (D) Schematische illustratie van embryonale zebravissen hart. (E en F) 2D- en 3D-illustraties van de verdeling van de ventrikel in acht segmenten, met uitzondering van de segmenten VII en VIII. (G) De verschillende coördinatensystemen van end-systole en end-diastole na resampling. (H) Voor de opwekking van een transformatiematrix (Tm)is een groep rechthoekige parallelpipeds gemaakt. (I) Geregistreerde end-systolische en end-diastolische coördinatensystemen door toepassing van Tm. (J) Verplaatsingsvector van de segmentale massacentroid van eind-systole aan eind-diastole. (K) DIAMANT verplaatsing van ventriculaire segmenten I–VI bijgehouden tijdens meerdere tijdpunten in de hartcyclus. (L) DIAMANT verplaatsing van ventriculaire segmenten I-VI van end-systole naar end-diastole. Dit cijfer uit Chen et al.8 wordt gereproduceerd met toestemming van de American Society for Clinical Investigation (ASCI). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: DIAMOND-segmentatie van het embryonale zebravishart in vergelijking met ruwe gegevens in 3D. Het embryonale zebravishart werd verdeeld in zes segmenten (volumes) die hier in verschillende kleuren voor de berekening van de verplaatsingen van de DIAMANT (links) worden afgebeeld. De verplaatsingsvector van elk segment berekend door DIAMOND vertegenwoordigt zijn segmentale hartfunctie. Het atrium en de uitstroom tract werden verwijderd tijdens segmentatie. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: DIAMOND ontrafelt de segmentale heterogeniteit in de hartfunctie en de gevoeligheid voor door chemotherapie veroorzaakte letsel. (A) Experimenteel schema van doxorubicin behandeling. (B en C) Segmentale vergelijking van DIAMOND verplaatsing vectoren genormaliseerd naar de binnenste myocardiale omtrek tussen controle en doxorubicin-behandelde groepen op 4 en 6 dpf (t tests, **p < 0,01, n = 8-10 per groep). (D en E) Beoordeling van de stam in de ventriculaire basis met een vergelijkbaar letsel- en regeneratiepatroon als de DIAMOND-verplaatsingsvectoren (*p < 0,05, n = 6-8 per groep). (F en G) Daling van de uitwerpfractie in reactie op doxorubicin bij 4 dpf met herstel bij 6 dpf, volgens een patroon vergelijkbaar met segmentale DIAMANT verplaatsingen op mondiaal ventriculair niveau (t-tests, **p < 0,01, foutbalken SEM, n = 6-10 per groep). Dit cijfer uit Chen et al.8 wordt gereproduceerd met toestemming van de ASCI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: DIAMOND mechanica voor de beoordeling van Notch-gemedieerd myocardialherstel na doxorubicin-geïnduceerde letsel. (A) Experimenteel schema. (B en C) NICD en NRG1 Notch downstream-effectoren gered de vermindering van diamond verplaatsing in segmenten I en VI op 4 dpf. Bij 6 dpf heeft remming van Notch-signalering door DAPT het herstel van de segmentale hartfunctie verminderd (ANOVA, **p < 0,01 Dox vs. control; †p < 0,05, ††p < 0,01, Dox + DAPT vs. control, n = 6–10 per groep). (D en E) Uitwerpfractie bevestigt DIAMOND mechanica op mondiaal niveau (ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, error bars SEM, n = 5–11 per groep). Dit cijfer uit Chen et al.8 wordt gereproduceerd met toestemming van de ASCI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een rigoureuze strategie voor kwantificering van de segmentale myocardiale functie is van cruciaal belang om hartmechanica te beoordelen buiten de traditionele EF, bekend als een ongevoelige en vertraagde indicator van myocardiale letsel1,4,12. Vandaar, is er een groeiende interesse in markers van vroege myocardiale veranderingen, en een groeiend lichaam van literatuur ondersteunt myocardiale vervorming parameters als een vroege indicator voor de voorspelling ventriculaire disfunctie4,13. Echocardiografische meting van linker ventriculaire (LV) stam biedt een gevestigde methode van myocardiale vervorming meting13. Weefsel Op doppler gebaseerde stambeeldvorming heeft echter te lijden onder een aantal tekortkomingen als gevolg van hoekafhankelijkheid en intraobserver- en interobservervariabiliteit14. Speckle tracking echocardiografie (STE) kan oplossen hoek-onafhankelijke 2D en 3D weefsel vervorming, maar de nauwkeurigheid van 2D speckle tracking wordt beïnvloed door door-vliegtuig beweging6, terwijl 3D speckle tracking vereist superieure ruimtelijke resolutie om de positieve ultrasone interferentie patronen (spikkels) op te lossen in 3D en hoge temporele resolutie om de spikkels tussen frames15volgen . In het huidige protocol beschrijven we DIAMOND-verplaatsing als een nieuwe myocardiale vervormingsparameter voor in vivo kwantificering van 4D-segmentale cardiale functie bij zebravissen. Vergeleken met EF- en 2D-stam als referentiestandaarden, biedt DIAMOND aanvullende segmentale vervormingsinformatie zonder te worden beïnvloed door bewegingen in het doorhet vliegtuig. Door DIAMOND te integreren met 4D LSFM, kan onze techniek de verplaatsingsvector van een hartsegment van 20-30 μm in breedte beoordelen, wat momenteel onmogelijk is voor zelfs het meest geavanceerde 3D STE-systeem, dat millimeterbereikresolutie16heeft.
Om DIAMOND toe te passen, is het van cruciaal belang om een uitgebreid begrip te hebben van de anatomische structuur van het embryonale zebravishart. Tijdens beeldsegmentatie is het essentieel dat het atrioventriculaire kanaal en het uitstroomkanaal correct worden geïdentificeerd en gesegmenteerd van de rest van het myocardwanneer de gebruiker stap 6 in het protocol uitvoert. Bovendien moeten de horizontale en verticale lange assen van de ventrikel nauwkeurig worden bepaald om het echte korte asvlak af te leiden voor beeldherbemonstering in stap 8.
De belangrijkste tariefbeperkende factor van het toepassen van DIAMOND is de handmatige segmentatie van de ventrikel, die tijdrovend wordt wanneer meerdere fasen tijdens de hartcyclus moeten worden geëvalueerd. Met de vooruitgang van machine learning en neurale netwerken, een geautomatiseerde cardiale segmentatie methode17,18,19,20 zou kunnen worden geïntegreerd met DIAMOND om monitoring van de segmentale hartfunctie te bieden gedurende de gehele hartcyclus. Verdere toepassingen van DIAMOND omvatten ook de integratie met echocardiografie, micro-CT of micro-MRI, geschikt in grotere diermodellen voor de multiscale beoordeling van hartletsel en regeneratie21. De methode zal echter eerst aanpassing aan de aanwezigheid van myocardiale vezels vereisen, wat leidt tot complexere hartvervorming, waaronder torsie bij zoogdieren22,23.
Over het geheel genomen biedt DIAMOND een nieuwe methode om de segmentale cardiale functie bij embryonale zebravissen te evalueren onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden en kan worden gebruikt als platform voor hoge doorvoer in vivo screening van trajecten in verband met chemotherapie-geïnduceerde cardiale toxiciteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard dat er geen belangenconflict bestaat.
Acknowledgments
Het huidige werk werd gefinancierd door American Heart Association subsidies 16SDG30910007 en 18CDA34110338, en door National Institutes of Health subsidies HL083015, HL111437, HL118650, en HL129727.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
- Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
- Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
- Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
- Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362 (2019).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763 (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
- Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
- Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
- Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
- Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
- Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
- Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
- Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603 (2017).
- Jay Kuo, C. C., Chen, Y. On data-driven Saak transform. Journal of Visual Communication and Image Representation. 50, 237-246 (2018).
- Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
- Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
- Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).
