Summary
Le but de ce protocole est de détailler une nouvelle méthode pour l’évaluation de la fonction cardiaque segmentale chez le poisson zèbre embryonnaire dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Abstract
Les poissons zèbres sont de plus en plus utilisés comme organisme modèle pour les cardiomyopathies et la régénération. Les méthodes actuelles d’évaluation de la fonction cardiaque ne détectent pas de façon fiable la mécanique segmentaire et ne sont pas facilement réalisables chez les poissons zèbres. Nous présentons ici une méthode semi-automatisée et open source pour l’évaluation quantitative de la fonction cardiaque segmentaire en quatre dimensions (4D) : analyse de déplacement de la déformation mécanique myocardique (DIAMOND). Le poisson zèbre embryonnaire transgénique a été photographié in vivo à l’aide d’un système de microscopie à fluorescence par feuille de lumière avec synchronisation du mouvement cardiaque 4D. Les cœurs numériques 3D acquis ont été reconstruits à la fin-systole et au fin-diastole, et le ventricule a été segmenté manuellement en jeux de données binaires. Ensuite, le cœur a été réorienté et isotropically rééchantillonné le long du véritable axe court, et le ventricule a été divisé uniformément en huit parties (I-VIII) le long de l’axe court. En raison des différents plans et matrices de rééchantillonnage à la fin-systole et au diastole final, une matrice de transformation a été appliquée pour l’enregistrement d’image pour reconstituer la relation spatiale originale entre les matrices d’image systoliques et diastoliques rééchantillonnées. Après l’enregistrement de l’image, le vecteur de déplacement de chaque segment de la fin-systole au diastole final a été calculé en fonction du déplacement des centroïdes de masse en trois dimensions (3D). DIAMOND montre que les segments myocardiques basal adjacents au canal atrioventriculaire subissent la déformation mécanique la plus élevée et sont les plus sensibles aux lésions cardiaques induites par la doxorubicine. Dans l’ensemble, DIAMOND fournit de nouvelles perspectives sur la mécanique cardiaque segmentale dans les embryons de poissons zèbres au-delà de la fraction d’éjection traditionnelle (EF) dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Introduction
La toxicité cardiaque induite par la chimiothérapie et l’insuffisance cardiaque qui s’ensuit sont l’une des principales raisons de l’arrêt de la chimiothérapie1. Par conséquent, l’évaluation fonctionnelle cardiaque joue un rôle crucial dans l’identification de la toxicité cardiaque et, plus important encore, dans la prédiction des lésions cardiaques précoces après la chimiothérapie2. Cependant, les approches actuelles pour l’évaluation fonctionnelle cardiaque rencontrent des limitations. Des méthodes telles que la fraction d’éjection ventriculaire gauche (LVEF) ne fournissent que la mécanique cardiaque globale et souvent retardée après une blessure3,4. L’imagerie de Doppler tissu l’assure des informations segmentaires sur la déformation myocardique, mais souffre d’une variabilité intra-observateur et inter-observateur importante, en partie en raison de la dépendance à l’angle du faisceau d’ultrasons5. Le suivi bidimensionnel (2D) de la tache utilise le mode B de l’échocardiographie, qui élimine théoriquement la dépendance à l’angle, mais sa précision est limitée par le mouvement hors plan6. Par conséquent, une approche rigoureuse pour quantifier la fonction cardiaque segmentale fait défaut dans la recherche et les milieux cliniques.
Dans ce contexte, nous avons développé une méthode de quantification 4D pour l’analyse de la fonction cardiaque segmentale que nous avons appelée analyse de déplacement de la déformation mécanique myocardique (DIAMOND), afin de déterminer les vecteurs de déplacement des centroïdes de masse myocardiques dans l’espace 3D. Nous avons appliqué DIAMOND pour l’évaluation in vivo de la fonction cardiaque et de la toxicité cardiaque induite par la doxorubicine avec le poisson zèbre (Danio rerio) comme modèle animal, choisi en raison de leur myocarde régénératrice et de leurs gènes développementaux hautement conservés7. Nous avons en outre comparé le déplacement segmentaire de DIAMOND avec la détermination globale de fraction d’éjection (EF) et la souche 2D suivant le traitement de doxorubicine. En intégrant le déplacement DE DIAMOND à la microscopie fluorescente en feuille de lumière 4D (LSFM) acquise en matière de cœurs de poissons zèbres embryonnaires, DIAMOND montre que les segments myocardiques basaux adjacents au canal atrioventriculaire subissent la déformation mécanique la plus élevée et sont les plus sensibles aux lésions cardiaques de la doxorubicine aigue8.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UCLA (IACUC), et des expériences ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Bureau de recherche sur les animaux de l’UCLA.
1. Élevage de poissons zèbres Tg(cmlc2:mCherry) et de la collecte d’embryons
- Suivez les procédures de logement, d’élevage et de collecte d’embryons telles que décrites dans les pratiques d’élevage et d’élevage précédemment établies. Pour plus de détails, voir Messerschmidt et coll.9.
- Traiter les embryons recueillis avec 0,003% 1-phényl-2-thiourea (PTU) dans E3 moyenne 18 h postfertilization pour maintenir la transparence des embryons pour l’imagerie LSFM.
2. Traitement de la doxorubicine pour induire des lésions cardiaques
- À 3 jours de postfertilisation (dpf), traiter les embryons avec de la doxorubicine à une concentration de 10 M dans le milieu de l’eau de poisson E3. Après un traitement de 24 h à 4 dpf, remplacer le milieu de doxorubicine par un milieu E3 frais.
CAUTION: La doxorubicine est un médicament de chimiothérapie. Un équipement de protection individuelle (EPI) approprié est nécessaire et les déchets doivent être éliminés dans des contenants de déchets biorisques.
3. Modulation de voie d’entaille
- Traiter les embryons de poisson zèbre avec l’inhibiteur de la voie Notch (2S)-N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine 1,1-dimethylethyl ester (DAPT) à une concentration de 10 M dans le milieu d’eau de poisson E3 à partir de 3-6 dpf.
- Microinjectez les effecteurs en aval Notch Notch domaine intracellulaire (NICD) et Neuregulin-1 (Nrg-1) ARNm à des concentrations de 10 pg/nL et 5 pg/nL, respectivement, dans les embryons de poisson zèbre stade 1 cellule8,10.
REMARQUE : La microinjection est effectuée au microscope avec le soutien d’une pompe à air pour contrôler avec précision le volume injecté. La microinjection d’ARNm dans la cellule se fait lorsque l’ovule fécondé est au premier stade cellulaire. Pour plus de détails sur la préparation et la séquence des ARNM, voir Chen et coll.8. Pour plus de détails sur la microinjection et la préparation des aiguilles d’injection, voir Rosen et coll.10.
4. Imagerie LSFM et synchronisation post-imagerie
- Pour les techniques d’imagerie LSFM et l’algorithme de synchronisation post-imagerie, voir les détails dans les publications précédentes9,11.
REMARQUE : En bref, notre système utilise un laser à ondes continues comme source d’éclairage pour imager toutes les lignes transgéniques de poisson zèbre. Le module de détection est composé de deux caméras scientifiques complémentaires de semi-conducteurs à oxyde métallique (sCMOS) et de deux ensembles de filtres pour l’imagerie bicanal. Le module de détection est impuriculairement installé sur le plan d’éclairage. Chaque cadre LSFM est acquis dans un délai d’exposition de 20 msec, tandis que la puissance de résolution en section transversale est de 0,65 m et la taille de l’étape entre les images consécutives est de 2 m. Un laser de 589 nm a été utilisé pour exciter les signaux fluorescents mCherry.
5. Reconstruction du cœur systolique et diastolique 3D
- Ouvrez le dossier créé par l’algorithme de synchronisation post, puis ouvrez le dossier "Sortie". Sélectionnez le plan du milieu du cœur et chargez le dossier entier dans ImageJ. Trouvez la première phase diastolique et systolique et enregistrez le numéro d’image.
- Ouvrez le dossier "Sortie/par état" et trouvez les dossiers qui ont les mêmes numéros que les numéros d’image qui viennent d’être enregistrés. Convertissez les images du dossier en fichiers 3D TIFF (format de fichier d’image étiqueté) et nommez-les "diastole.tif" et "systole.tif".
6. Segmentation du ventricule
- Ouvrez le logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux). Cliquer sur Le Fichier Données ouvertes, et charger "diastole.tif" et "systole.tif". Entrez la taille du voxel en fonction des paramètres d’imagerie.
REMARQUE : Pour le système LSFM utilisé, la taille typique du voxel est de 0,65 m x 0,65 m x 2 m. - Cliquez sur le panneau «SEGMENTATION» et segmentez manuellement la partie ventriculaire du cœur. L’outil intégré «Seuil» qui peut sélectionner toutes les régions au-dessus d’une certaine intensité peut faciliter ce processus. Le ventricule est la chambre plus épaisse avec une fluorescence plus forte.
REMARQUE : Assurez-vous d’enlever le canal atrioventriculaire et le tractus sortant dans le ventricule segmenté, car cela affecte l’analyse de déplacement. - Une fois la segmentation terminée, cliquez sur le panneau «Projet». Cliquez à droite sur lediastole. Labels.tif" et "systole. Labels.tif" onglets dans la console et cliquez sur "Export Data as" pour enregistrer les données que les fichiers TIFF 3D.
7. Création de parallélépipèdes rectangulaires pour l’enregistrement d’images
- Exécuter "prepImage_1.m" dans l’environnement de programmation (voir Tableau des matériaux). Ouvrez "prepImage_1.m", "ImPath" en ligne 5 afin que le dossier contienne les fichiers TIFF originaux et segmentés, et changez "tranche" en ligne 4 au nombre de tranches des fichiers tif 3D.
- Après l’exécution du code, il générera cinq nouveaux fichiers TIFF 3D ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif", et "sysLabel200.tif") ainsi que deux nouveaux dossiers ("resample_dia" et "resample_sys").
8. Rééchantillonner les coeurs 3D systoliques et diastoliques le long du plan à axe court
- Importer les cinq fichiers TIFF 3D dans le logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : La taille du voxel est inchangée. - Rendez-vous sur le panneau MULTIPLANAR. Choisissez "diastole_200.tif" comme données primaires. Alignez l’axe X (la ligne verte du plan XY) avec l’axe vertical long du ventricule, et alignez l’axe Z (la ligne rouge dans le plan YZ) avec l’axe horizontal long du ventricule.
REMARQUE : L’axe vertical long est déterminé en trouvant l’axe le plus long reliant l’apex et le tractus sortant dans le plan XY, et l’axe horizontal long est déterminé en trouvant l’axe le plus long reliant l’apex et le tractus sortant dans le plan YZ. Faites pivoter l’axe en plaçant le curseur à l’extrémité de l’axe. - Choisissez trois points aléatoires à partir du plan YZ oblique (le plan à axe court) dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et enregistrez leurs coordonnées de position 3D.
REMARQUE : Assurez-vous que les points sont choisis dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. - Répétez les étapes 8.2 et 8.3 pour "systole_200.tif".
- Cliquez sur le panneau "PROJECT". Créez un objet "Slice" pour "diastole_200.tif" en cliquant à droite sur "diastole_200.tif" et en recherchant "Slice" objet. Cliquez à gauche sur l’objet Slice qui vient d’être créé, et dans le panneau Propriétés Options, vérifier "Set Plane" et choisir trois points dans "Plane Definition". Entrez les coordonnées des trois points à partir de l’étape 7.3.
- Répétez l’étape 8.5 pour "systole_200.tif".
REMARQUE: L’objet de tranche créé doit avoir le nom "Slice 2". - Cliquez à droite sur "diastole_200.tif" et recherchez "Resample Transformed Image" et créez l’objet. Dans le panneau Propriétés, choisissez "Slice" comme "Référence" et cliquez sur Appliquer. Cela devrait générer un objet nommé "diastole_200.transformé".
- Cliquez à droite "diastole_200.transformé" et recherchez "Resample" et créez l’objet. Choisissez "Voxel Size" comme le "Mode" et changez "Voxel Size" pour être x 1, y et 1, et z 1 dans le panneau Propriétés.
- Cliquez sur "Appliquer". Cela devrait générer un objet nommé "diastole_200.resampled". Cliquez à droite "diastole_200.resampled" et enregistrez-le sous forme de fichier TIFF 3D.
- Répétez la même étape pour "diaLabel.tif" et "test.tif". Enregistrer "diaLabel.resampled" et "test.resampled" comme fichiers TIFF 3D. Répétez la même étape pour "systole_200.tif", "sysLabel.tif", et "test.tif" en utilisant "Slice 2" comme référence, et enregistrez "systole_200.resampled", "sysLable.resampled", et "test2.resampled" comme fichiers TIFF 3D.
REMARQUE : Assurez-vous qu’il y a un total de six fichiers TIFF enregistrés dans cette étape.
9. Division du cœur rééchantillonné
- Importer les six fichiers rééchantillonnés de l’étape 8 à ImageJ. Sélectionnez une tranche de "systole_200.resampled" dans laquelle le canal atrioventriculaire est clairement visualisé. Enregistrez le nombre de la tranche.
- Utilisez l’image " Transformer Rotation" fonction de ImageJ de sorte que le canal atrioventriculaire est vertical. Appliquez la même rotation à tous les fichiers. Fermez toutes les fenêtres et enregistrez tous les changements.
- Déplacer "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled", et "test.resampled" to the "resample_dia" folder, et déplacer "systole_200.resampled", "sysLable.resampled", et "test2.resampled" to the "resample_sys" folder.
- Ouvert "divider_2_8_pieces.m". Changement "ImPath" dans la ligne 5 et "ImPath" dans la ligne 395 au répertoire d’image. Changer la variable "Moyen" dans la ligne 22 et la ligne 411 pour les nombres de tranches où le canal atrioventriculaire est clairement visualisé en " systole_200.resampled" et "diastole_200.resampled".
- Exécutez le code, et dans les fenêtres incitées cliquez une fois au centre du ventricule et cliquez une fois au centre du canal atrioventriculaire. Cela doit être fait deux fois pour les images systole et diastole.
10. Enregistrement des matrices d’images systoliques et diastoliques
- Ouvrez "register_3.m" et changez "ImPath" dans la ligne 4 sur le chemin du dossier d’image. Il peut prendre 5 à 20 minutes pour exécuter ce code en fonction de la puissance de calcul du système.
REMARQUE : Les parallélépipèdes rectangulaires créés artificiellement à l’étape 7 sont utilisés pour l’enregistrement rigide en 3D qui préserve la distance entre deux points et les angles souscrits par trois points. Lorsque le parepiped rectangulaire fin-diastole (rouge) est enregistré au paraléphat rectangulaire fin-systole (vert), l’emplacement 3D discrepant qui s’ensuit permet la dérivation d’une matrice unique de transformation rigide consistant en rotation et traduction de la matrice de la tordeur à la matrice de fin-systole (Figure 1H). Nous effectuons l’enregistrement et la minimisation de l’énergie pour débruitner la matrice après la transformation à l’aide d’une boîte à outils de traitement d’image (voir Tableau des matériaux). Pour une description mathématique détaillée, veuillez consulter Chen et coll.8.
11. Sortie des vecteurs de déplacement
- Ouvrez "displacement_4.m" et changez "ImPath" dans la ligne 4 sur le chemin du dossier d’image.
- Exécutez "displacement_4.m", qui génère un fichier " vector8.txt " dans le dossier " vecteurs ". Une fois que le fichier "vector8.txt" est ouvert, il y aura une matrice 8 x 4. Chaque rangée de la matrice a quatre nombres, qui sont les magnitudes de la composante X, composant Y, composant Z, et l’ampleur SUM du vecteur de déplacement d’un segment spécifique du ventricule.
REMARQUE : Le vecteur de déplacement est obtenu en calculant le déplacement du centroïde de masse de chaque segment dans l’espace 3D. Nous calculons les coordonnées de centroïde de
masse 3D (PS et PD)(où k indique la coordonnées X, Y ou Z, respectivement) de chaque segment (I-VI) dans le jeu de données de segmentation de systole à diastole (Figure 1J). Nous définissons le centroïde de masse dans l’espace 3D comme suit :
où Cx x, Cy , Y, Y, et Cz, Z, Mi - la masse de chaque segment (I i 'VI), m - le nombre de voxels de chaque segment, et la fonction de densité comme la région segmentée est de 1 alors que le reste est de 0. La norme L2 des vecteurs de sous-déplacement le long des axes X, Y et Z et le vecteur de déplacement de somme sont calculés pendant le cycle cardiaque. Il y a un total de huit lignes dans la matrice. La première rangée et la huitième rangée contiennent le canal atrioventriculaire et sont donc ignorées dans notre analyse. Les segments I à VI sont représentés par la deuxième rangée à la septième rangée.
masse 3D (PS et PD)(où k indique la coordonnées X, Y ou Z, respectivement) de chaque segment (I-VI) dans le jeu de données de segmentation de systole à diastole (Figure 1J). Nous définissons le 
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Representative Results
Le processus par lequel DIAMOND a été développé pour évaluer la fonction cardiaque segmentaire 3D est présenté à la figure 1. Après l’acquisition et la reconstruction d’images LSFM en 3D du cœur embryonnaire de poisson zèbre (Figure 1A), le véritable plan à axe court a été déterminé comme le plan perpendiculaire aux axes longs verticaux et horizontaux, qui sont tous deux déterminés dans un visualiseur multiplan (Figure 1B). Le cœur a ensuite été rééchantillonné le long du plan à axe court (Figure 1C), et divisé en huit segments égaux constitués par des angles égaux selon une ligne de division virtuelle (ligne pointillée rouge) reliant le centre de la cavité ventriculaire endocardique au centre du canal atrioventriculaire (Figure 1E). Les représentations 3D des segments identifiés sont illustrées dans une vue transversale (figure 1F) et en comparaison avec les données brutes (Figure 2). Les segments VII et VIII ont été retirés de l’analyse parce qu’ils englobent le canal atrioventriculaire et contiennent donc moins de myocarde que d’autres segments. Les différents plans de rééchantillonnage pour les systèmes fin-systole (HS) et end-diastole (HD) conduisent à des systèmes de coordonnées distincts pour les matrices fin-systoliques et diastoliques finodiques, qui doivent être enregistrées pour restaurer leur relation spatiale d’origine (Figure 1G). Le système de coordonnées de la matrice systolique a été choisi comme référence pour la cohérence. Pour déterminer la matrice de transformation (Tm) de la matrice fin-diastolique à la matrice systolique, une matrice de trois parallélépipèdes, qui est asymétrique en 3D et a la même dimension que la matrice d’image originale, a été pratiquement créée. Les parallélépipèdes ont été rééchantillonnés deux fois, d’abord dans le plan à axe court de la matrice de systole final, puis dans le plan à axe court de la matrice de diastole d’extrémité, ce qui a conduit à différents parallélépipèdes transformés pour le systole final (vert) et le diastole final (rouge) (Figure 1H).
Les parallélépipèdes verts et rouges ont ensuite été enregistrés ensemble par un algorithme rigide d’enregistrement du corps et Tm a été calculé et appliqué à la matrice de diastole final pour restaurer les coordonnées (figure 1I). Ce processus permet un suivi ultérieur dans l’espace 3D des vecteurs de déplacement des centroïdes de masse de n’importe quel segment du ventricule pendant le cycle cardiaque (Figure 1J). LE déplacement DIAMOND des segments ventriculaires I-VI peut être suivi pendant plusieurs moments du cycle cardiaque (Figure 1K ), qui peuvent être simplifiés pour l’analyse quantitative à deux points de temps allant de la fin-systole à la fin-diastole (Figure 1L). Les segments générés par DIAMOND peuvent être visualisés dans la figure 2, où chaque couleur représente un segment cardiaque.
Avec DIAMOND, nous avons découvert l’hétérogénéité segmentale de la fonction cardiaque et de la susceptibilité aux dommages myocardiques induits par la doxorubicine chez le poisson zèbre. Après un traitement de 24 h avec 10 m doxorubicine de 3 à 4 dpf (figure 3A), nous avons comparé le déplacement DE DIAMOND des segments ventriculaires entre les groupes témoins et traités par chimiothérapie (figure 3B) et 48 h après le traitement (figure 3C). Toutes les figures DE DIAMOND suivent le même motif graphique que les ventricules rééchantillonnés le long de l’axe court (Figure 1E). Les données sont présentées en pourcentages en normalisant la norme L2 du vecteur de déplacement vers le périmètre intérieur du cœur, avec les composants X (vert), Y (bleu) et Z (orange) illustrés comme leurs contributions pondérées. À 4 dpf, la moyenne de La 2-norm des vecteurs de déplacement segmentaire dans les poissons témoins variait de 6,6 à 11,3 m, soit 3,8 à 6,6 % après normalisation. Nos résultats indiquent que, dans des conditions de contrôle, les segments basaux I et VI subissent les déplacements les plus importants et sont les plus sensibles aux lésions cardiaques induites par la doxorubicine(figure 3B, diminution de 29 % de 6,6 à 4,7 %, n - 10 contrôle et n - 8 doxorubicine, p lt; 0,01). À 6 dpf, la moyenne de La 2-norm des vecteurs de déplacement segmentaire dans le poisson témoin variait de 6,8 à 14 m, soit 3,9 à 8 % après normalisation. À 6 dpf, les segments basaux I et VI ont récupéré le déplacement de DIAMOND aux niveaux de contrôle, suggérant la régénération segmentaire(figure 3C, n - 10 contrôle et n - 8 doxorubicine). En parallèle, une aggravation de la souche basale 2D de -53 à -38% a été observée à 4 dpf après traitement à la doxorubicine, suivie d’un retour aux niveaux de contrôle à 6 dpf, corroborant les résultats du déplacement DIAMOND (Figure 3D, 3E). Une diminution parallèle de la fraction d’éjection globale en réponse à la doxorubicine à 4 dpf avec récupération à 6 dpf a également été observée (Figure 3F, 3G).
Nous avons ensuite appliqué DIAMOND pendant le traitement de la doxorubicine et la modulation de la voie Notch à l’aide de l’inhibiteur Notch DAPT et de sauvetage en utilisant Notch effecteurs en aval NICD et NRG1 mRNA (Figure 4A). La microinjection d’ARNM de NICD et de NRG1 a sauvé la diminution du déplacement de DIAMOND et de l’EF après des dommages aigus induits par la chimiothérapie à 4 dpf (figure 4B, 4D). L’exposition à l’inhibiteur DeCh DAPT ainsi qu’à la doxorubicine ont entraîné une diminution plus diffuse du déplacement de DIAMOND, en plus des segments basiques I et VI(figure 4B). En outre, l’inhibition de la voie de notch après des dommages chimio-induits a encore entravé la récupération du déplacement de DIAMOND des segments basal et de l’EF à 6 dpf. L’inhibition a été sauvée par les effecteurs en aval Notch NICD et NRG1 (figure 4C, 4E).
Figure 1 : Développement de déplacement 4D DIAMOND. (A) Des images brutes ont été capturées par microscopie fluorescente par feuille de lumière. (B et C) Le cœur 3D reconstruit a été rééchantillonné le long de la vue de plan à axe court véritable. (D) Illustration schématique du coeur embryonnaire de poisson zèbre. (E et F) illustrations 2D et 3D de la division du ventricule en huit segments à l’exclusion des segments VII et VIII. (G) Les différents systèmes de coordonnées de la fin-systole et de la fin-diastole après rééchantillonnage. (H) Un groupe de parallélépipèdes rectangulaires a été créé pour la génération d’une matrice de transformation (Tm). (I) Systèmes de coordonnées end-systoliques et diastoliques enregistrés en appliquant Tm. (J) Vecteur de déplacement du centroïde de masse segmental de la fin-systole à la fin-diastole. (K) DIAMOND déplacement des segments ventriculaires I-VI suivis pendant plusieurs moments du cycle cardiaque. (L) DÉPLACEMENT DIAMOND des segments ventriculaires I-VI de la fin-systole à la fin-diastole. Ce chiffre de Chen et coll.8 est reproduit avec la permission de l’American Society for Clinical Investigation (ASCI). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Segmentation DIAMOND du cœur embryonnaire du poisson zèbre par rapport aux données brutes en 3D. Le cœur embryonnaire de poisson zèbre a été divisé en six segments (volumes) représentés ici dans différentes couleurs pour le calcul des déplacements DE DIAMOND (à gauche). Le vecteur de déplacement de chaque segment calculé par DIAMOND représente sa fonction cardiaque segmentaire. L’atrium et le tractus sortant ont été enlevés pendant la segmentation. Barre d’échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : DIAMOND démêle l’hétérogénéité segmentale dans la fonction cardiaque et la susceptibilité aux lésions induites par la chimiothérapie. (A) Calendrier expérimental de traitement de la doxorubicine. (B et C) Comparaison sectorielle des vecteurs de déplacement DIAMOND normalisés au périmètre myocardique intérieur entre les groupes témoins et traités à la doxorubicine à 4 et 6 dpf (t tests,p 'lt; 0.01, n '8-10 par groupe). (D et E) Évaluation de la souche dans la base ventriculaire représentant une blessure et un modèle de régénération similaires à ceux des vecteurs de déplacement DIAMOND(p 'lt; 0.05, n '6'8 par groupe). (F et G) Diminution de la fraction d’éjection en réponse à la doxorubicine à 4 dpf avec récupération à 6 dpf, suivant un modèle similaire aux déplacements segmentaires DE DIAMOND au niveau ventriculaire global (t tests,p 'lt; 0.01, barres d’erreur SEM, n '6-10 par groupe). Ce chiffre de Chen et coll.8 est reproduit avec la permission de l’ASCI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Mécanique DE DIAMOND pour l’évaluation de la récupération myocardique Notch-négociée après des dommages induits par la doxorubicine. (A) Horaire expérimental. (B et C) NICD et NRG1 Notch afaits en aval a sauvé la réduction du déplacement DE DIAMOND dans les segments I et VI à 4 dpf. À 6 dpf, l’inhibition de la signalisation notch par DAPT a altéré la restauration de la fonction cardiaque segmentaire (ANOVA,p 'lt; 0.01 Dox vs. contrôle;'p 'lt; 0.05,'p 'lt; 0.01, Dox 'DAPT vs. control, n '6'10 par groupe). (D et E) La fraction d’éjection corrobore la mécanique DIAMOND au niveau global (ANOVA,p 'lt; 0.05,'p 'lt; 0.01, barres d’erreur SEM, n '5-11 par groupe). Ce chiffre de Chen et coll.8 est reproduit avec la permission de l’ASCI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Une stratégie rigoureuse pour quantifier la fonction myocardique segmentaire est essentielle pour évaluer la mécanique cardiaque au-delà de l’EF traditionnel, connu pour être un indicateur insensible et retardé de la lésion myocardique1,4,12. Par conséquent, il y a eu un intérêt croissant dans des marqueurs des changements myocardiques tôt, et un corps croissant de littérature soutient des paramètres de déformation myocardique comme indicateur tôt pour prévoir le dysfonctionnement ventriculaire4,13. La mesure échocardiographique de la souche ventriculaire gauche (LV) fournit une méthode établie de mesure de déformation myocardique13. Cependant, l’imagerie de souche à base de tissu Doppler souffre d’un certain nombre de lacunes dues à la dépendance à l’angle et à la variabilité intra-observateur et interobservateur14. L’échocardiographie de suivi de speckle (STE) peut résoudre la déformation 2D et 3D de tissu angle-indépendante, mais la précision du suivi 2D de tache est affectée par le mouvement par-plan6,alors que le suivi 3D de tache exige la résolution spatiale supérieure pour résoudre les modèles positifs d’interférence d’ultrason (speckles) en 3D et la résolution temporelle élevée pour suivre les taches entre des images15. Dans le protocole actuel, nous décrivons le déplacement de DIAMOND comme paramètre de déformation myocardique nouveau pour la quantification in vivo de la fonction cardiaque segmental 4D chez le poisson zèbre. Par rapport à la souche EF et 2D comme normes de référence, DIAMOND fournit des informations de déformation segmentaire supplémentaires sans être affectée par le mouvement de l’avion. En intégrant DIAMOND à 4D LSFM, notre technique permet d’évaluer le vecteur de déplacement d’un segment cardiaque de 20 à 30 m de largeur, ce qui est actuellement impossible même pour le système 3D STE le plus avancé, qui a une résolution millimétrique-portée16.
Pour appliquer DIAMOND, il est essentiel d’avoir une compréhension complète de la structure anatomique du cœur embryonnaire de poisson zèbre. Pendant la segmentation de l’image, il est essentiel que le canal atrioventriculaire et le tractus sortant soient correctement identifiés et segmentés à partir du reste du myocarde lorsque l’utilisateur effectue l’étape 6 du protocole. En outre, les axes horizontaux et verticaux longs du ventricule doivent être déterminés avec précision afin de dériver le véritable plan à axe court pour le rééchantillonnage d’image à l’étape 8.
Le principal facteur limitant le taux de l’application de DIAMOND est la segmentation manuelle du ventricule, qui prend beaucoup de temps lorsque plusieurs phases du cycle cardiaque peuvent devoir être évaluées. Avec l’avancement de l’apprentissage automatique et des réseaux neuronaux, une méthode automatisée de segmentation cardiaque17,18,19,20 pourrait être intégrée avec DIAMOND pour assurer la surveillance de la fonction cardiaque segmentaire tout au long du cycle cardiaque. D’autres applications de DIAMOND incluent également l’intégration avec l’échocardiographie, le micro-CT, ou micro-IRM, approprié dans de plus grands modèles animaux pour l’évaluation à plusieurs échelles des dommages cardiaques et de la régénération21. Cependant, la méthode nécessitera d’abord l’adaptation à la présence de fibres myocardiques conduisant à une déformation cardiaque plus complexe, y compris la torsion chez les mammifères22,23.
Dans l’ensemble, DIAMOND fournit une nouvelle méthode pour évaluer la fonction cardiaque segmentale chez le poisson zèbre embryonnaire dans des conditions physiologiques et pathologiques et peut être utilisée comme plate-forme pour le dépistage in vivo à haut débit des voies associées aux toxicité cardiaque induite par la chimiothérapie.
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Disclosures
Les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les travaux actuels ont été financés par les subventions de l’American Heart Association 16SDG30910007 et 18CDA34110338, et par les subventions HL083015, HL111437, HL118650 et HL129727.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
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