Summary
ويشارك ضعف نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في مختلف الأمراض العصبية التنكسية. يستخدم البروتوكول المقدم الخلايا العصبية الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة لتقييم نقل الميتوكوندريا والمورفولوجيا في الشلل النصفي التشنجي الوراثي. يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار بالميتوكوندريا على طول المحاور وتحليل مورفولوجيا ها ، مما سيسهل دراسة الأمراض العصبية.
Abstract
الخلايا العصبية لديها مطالب مكثفة للحصول على طاقة عالية من أجل دعم وظائفها. وقد لوحظ ضعف نقل الميتوكوندريا على طول محاور عصبية في الخلايا العصبية البشرية, التي قد تسهم في التنكس العصبي في مختلف الدول المرض. على الرغم من أنه من الصعب دراسة ديناميات الميتوكوندريا في الأعصاب البشرية الحية ، فإن مثل هذه النماذج حاسمة لدراسة دور الميتوكوندريا في التنكس العصبي. وصف هنا هو بروتوكول لتحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا الميتوكوندريا في محاور عصبية الدماغ الأمامية المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة الإنسان (iPSCs). يتم تمييز iPSCs إلى الخلايا العصبية الجلوتامات telencephalic باستخدام أساليب راسخة. يتم تلطيخ الميتوكوندريا من الخلايا العصبية مع MITOTracker CMXRos، ويتم التقاط حركة الميتوكوندريا داخل محاور عصبية باستخدام مجهر التصوير الخلية الحية مجهزة حاضنة لثقافة الخلايا. يتم تحليل الصور الفاصلة الزمنية باستخدام البرامج مع "MultiKymograph" ، "المستورد Bioformat" ، والإضافات "وحدات الماكرو". يتم إنشاء Kymographs النقل الميتوكوندريا، ويتم قراءة متوسط سرعة الميتوكوندريا في الاتجاهات الانتريوية وإلى الوراء من الكيموغراف. فيما يتعلق بتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا ، يتم الحصول على طول الميتوكوندريا والمنطقة ونسبة العرض إلى الارتفاع باستخدام ImageJ. وباختصار، يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار بالميتوكوندريا على طول محاور عصبية وتحليل مورفولوجيا ها لتسهيل دراسات الأمراض العصبية.
Introduction
تلعب الحركة التوزيعية الميتوكوندريا دورًا حيويًا في تلبية المطالب النشطة المتغيرة والمتخصصة في الخلايا العصبية المستقطبة. الخلايا العصبية يمكن أن تمتد محاور طويلة للغاية للتواصل مع الأهداف من خلال تشكيل نقاط الاشتباك العصبي، والتي تتطلب مستويات عالية من الطاقة لكاليفورنيا2 + التخزين المؤقت والتيارات الأيون. نقل الميتوكوندريا من سوما إلى محور عصبي أمر بالغ الأهمية لدعم وظيفة المحاور العصبية ومتشابك من الخلايا العصبية. يتم إجراء حركة الميتوكوندريا الديناميكية مكانيًا وزمنيًا عن طريق النقل المحوري السريع بمعدلات عدة ميكرومترات في الثانية1.
على وجه التحديد، البروتينات الحركية أو المحولة، مثل kinesin وdynein، والمشاركة في النقل العضي السريع على طول microtubules للسيطرة على حركة الميتوكوندريا2،3. يتطلب النشاط العصبي العادي النقل السليم للميتوكوندريا المجمعة حديثًا من سوما الخلايا العصبية إلى محور عصبي بعيد (النقل المحوري الأنتري) والنقل العكسي للميتوكوندريا من محور عصبي بعيد إلى جسم الخلية (النقل الرجعي). وقد أشارت الدراسات الحديثة إلى أن تخصيص الميتوكوندريا غير لائق يرتبط بقوة مع عيوب الخلايا العصبية والأمراض التنكسية الخلايا العصبية الحركية4,5. لذلك ، لتشريح دور الميتوكوندريا في التنكس العصبي ، من المهم إنشاء طرق لفحص حركة الميتوكوندريا على طول المحاور في الثقافات الحية.
هناك تحديان رئيسيان في فحص وتحليل تتبع الميتوكوندريا: (1) تحديد الميتوكوندريا من الخلفية في كل إطار ، و (2) تحليل وتوليد الروابط بين كل إطار. في حل التحدي الأول ، يتم استخدام نهج وضع العلامات على نطاق واسع لتمييز الميتوكوندريا عن الخلفية ، مثل صبغة MitoTracker أو الترانفسيفان للميتوكوندريا المنصهر ة الفلورية التي تستهدف البروتين (على سبيل المثال ، mito-GFP)6،7،8. لتحليل الارتباط بين الإطارات ، تم وصف العديد من الخوارزميات وأدوات البرامج في الدراسات السابقة9. في ورقة حديثة، قارن الباحثون أربع أدوات آلية مختلفة (على سبيل المثال، Volocity، Imaris، wrMTrck، وتعقب الفرق) لتحديد النقل الميتوكوندريا. وأظهرت النتائج أنه على الرغم من التناقضات في طول المسار، وإزاحة الميتوكوندريا، ومدة الحركة، والسرعة، فإن هذه الأدوات الآلية مناسبة لتقييم فرق النقل بعد العلاج10. بالإضافة إلى هذه الأدوات ، تم استخدام البرنامج المساعد المتكامل "وحدات الماكرو" لImageJ (كتبه ريتدورف وSeitz) على نطاق واسع لتحليل نقل الميتوكوندريا11. تولد هذه الطريقة الكيموغرافيات التي يمكن استخدامها لتحليل حركة الميتوكوندريا، بما في ذلك السرعة في كل من الاتجاهات السابقة وإلى الوراء.
الميتوكوندريا هي العضيات ديناميكية للغاية التي تتغير باستمرار في العدد والمورفولوجيا استجابة لكل من الحالات الفسيولوجية والمرضية. الانشطار الميتوكوندريا والانصهار تنظيم بإحكام مورفولوجيا الميتوكوندريا والتوازن. يمكن أن يؤدي عدم التوازن بين الانشطار الميتوكوندريا والانصهار إلى شبكات الميتوكوندريا القصيرة أو الطويلة للغاية ، والتي يمكن أن تضعف وظيفة الميتوكوندريا وتؤدي إلى أنشطة عصبية غير طبيعية وانحطاط عصبي. ويشارك ضعف نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في مختلف الأمراض العصبية التنكسية, مثل مرض الزهايمر, مرض باركنسون, مرض هنتنغتون, والشلل النصفي التشنجي الوراثي (HSP)12,13,14,15. HSP هي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات العصبية الموروثة التي تتميز بانحطاط الجهاز القشري والفشل اللاحق في السيطرة على عضلات الأطراف السفلية16،17. في هذه الدراسة, وتستخدم الخلايا العصبية الأمامية المستمدة من iPSC لتقييم نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في HSP. توفر هذه الطريقة نموذجًا فريدًا لفحص ديناميكيات الميتوكوندريا من المحاور العصبية في الثقافات الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد الخلايا العصبية الجلوتامات من iPSCs telencephalic
ملاحظة: البروتوكول التفصيلي للحفاظ على iPSCs وتمايزها إلى الخلايا العصبية الجلوتامية telencephalic مماثلة لتلك التي وصفت سابقا18. هنا ، يتم إدخال العملية الحرجة أثناء تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وتسليط الضوء عليها.
- الثقافة iPSCs على الخلايا الليفية الجنينية الفأر (MEF) مغذيات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) المتوسطة تستكمل مع عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF، 4 نانوغرام /مل).
- بعد الحضانة مع dispase (1 ملغ / مل) لمدة 3 دقيقة ، وفصلها iPSCs إلى كتل صغيرة. ثم، ثقافة المجاميع iPSC في تعليق في وسط hESC لمدة 4 أيام. الرجوع إلى هذه النقطة الزمنية، عندما تبدأ iPSCs كثقافة التعليق، كيوم 1 (D1). تغيير المتوسط يوميا لمدة 4 أيام.
- في D5، جمع المجاميع iPSC بعد الطرد في 200 × ز لمدة 2 دقيقة والثقافة في وسائل الإعلام التعريفي العصبي (NIM) لمدة 3 أيام. ثقافة الخلية المجاميع في تعليق لمدة 3 أيام عن طريق تغيير نصف وسائل الإعلام كل 2 أيام. أضف DMH-1 (2 ميكرومتر) وSB431542 (2 ميكرومتر) إلى متوسط NIM لزيادة كفاءة الاستقراء العصبي.
- في D8، جمع المجاميع iPSC بعد الطرد في 200 × ز لمدة 2 دقيقة والسماح لهم الانضمام إلى 6 لوحات بئر (حوالي 20-30 المجاميع لكل بئر من لوحة) عن طريق الاستزراع في NIM مع FBS 10٪ (أو مع لوحات مغلفة لامينين) بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بإزالة الوسط القديم وتغييره إلى NIM كل يومين حتى D17.
ملاحظة: يلاحظ توليد الخلايا العصبية البُرَبية، التي يُشار إليها من خلال تكوين خلايا عمودية ذات هياكل وردية، في هذه الفترة. - في D17 ، عزل الخلايا العصبية في وسط المستعمرات ميكانيكيًا (الرفع مباشرة عن طريق الضغط الصغير على مركز المستعمرات) أو الأنزيمية (تعامل مع dispase). نقل الخلايا العصبية المعزولة إلى زراعة الأنسجة غير المعالجة T25 قارورة تحتوي على 8 مل من NIM مع إضافة B27 (1x)، cAMP (1 ميكرومتر)، ومنتدى إدارة الإنترنت (10 نانوغرام / مل).
ملاحظة: تسمح ثقافة التعليق للخلايا بتكوين خلايا عصبية يتم إثراؤها بالسلف العصبية للإسقاط القشري. - بعد D35، لوحة neurospheres على بولي أورنيثين وLDEV خالية من انخفاض عامل النمو مصفوفة غشاء الطابق السفلي(جدول المواد)المغلفة 35 ملم الأطباق الزجاجية القاع لتوليد الخلايا العصبية الجلوتامات telencephalic (الخلايا العصبية الإسقاط القشرية). قبل الطلاء ، فصل الخلايا العصبية إلى مجموعات صغيرة عن طريق الاحتضان مع محلول مفرزة الخلية 1 ملغ / مل لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إزالة حل انفصال الخلية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق في 1 مل من وسط التمايز العصبي (NDM). خلايا لوحة على الطبق السفلي الزجاجي (حوالي خمس مجموعات في 100 ميكرولتر من المتوسط لكل طبق) للسماح لهم بإرفاق. ثم أضف NDM (1 مل لكل طبق) وزراعة الخلايا في NDM التي تحتوي على B27 (1x) و cAMP (1 μM) وIGF (10 نانوغرام / مل) وhBDNF (10 نانوغرام / مل) و GDNF (10 نانوغرام / مل).
ملاحظة: يتم مطلي مجموعات صغيرة لأنها البقاء على قيد الحياة بشكل جيد، وتؤدي إلى الخلايا العصبية الإسقاط طويلة. بدلا من ذلك، يمكن فصل الخلايا ومطلي بكثافة حوالي 20،000 خلية لكل طبق لفصل أفضل. - تميز الخلايا العصبية الجلوتاماتية telencephalic عن طريق التحسس المناعي علامات Tbr1 و αIII-tubulin.
2. فحص نقل الميتوكوندريا على طول محاور عصبية من الخلايا العصبية الجلوتاماتية telencephalic
- احماء NDM وتحويل على حاضنة المجهر الفلوري تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- لتصور الميتوكوندريا على طول محاور عصبية الدماغ، احتضان الخلايا العصبية مع 50 nM صبغة الفلورسنت الحمراء لوصمة الميتوكوندريا في الخلايا الحية (على سبيل المثال، MitoTracker CMXRos) في NDM لمدة 3 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد ذلك، غسل الخلايا 2x مع NDM الدافئة. يتم احتضان الخلايا العصبية في NDM.
- من أجل تسجيل نقل الميتوكوندريا على طول محاور عصبية، واتخاذ الصور الفاصل الزمني لحركة الميتوكوندريا باستخدام الهدف 40x مع المجهر الفلوري.
ملاحظة: لتحقيق الاستقرار في الثقافة، قم بإجراء تصوير الخلية الحية عندما يتم احتضان الخلايا في الحاضنة لمدة 20 دقيقة بعد تلطيخ الميتوكوندريا. - تحت مجال المرحلة، وتحديد محاور عصبية على أساس الخصائص المورفولوجية (يخرج مباشرة من جسم الخلية العصبية، النيوتات طويلة رقيقة ثابتة مع عدم وجود تفريع). الميتوكوندريا تتحرك في anterograde (من جسم الخلية إلى محور عصبي بعيد) والاتجاهات الرجعية (من محطة محاور عصبية إلى جسم الخلية). للتمييز بين اتجاه حركة الميتوكوندريا على طول محاور عصبية، حدد بوضوح أجسام الخلايا العصبية. في هذه الخطوة، ركز محاور عصبية تحت حقل المرحلة للحد من التبييض الضوئي.
- بعد التمييز بين جسم الخلية ومحور عصبي، ضبط وقت التعرض والتركيز من الميتوكوندريا في محاور عصبية. ثم، التقاط نقل الميتوكوندريا داخل محاور عصبية كل 5 s لمدة إجمالية قدرها 5 دقيقة، مما أسفر عن 60 إطارات. التقاط عشوائي خمسة مواقع لكل طبق وتكرار 3x لكل مجموعة.
3. تحليل البيانات من نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية القشرية
ملاحظة: تحليل البيانات التي تم جمعها عن نقل الميتوكوندريا باستخدام برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال، ImageJ أومتحول19). منذ ImageJ هو متاح بسهولة ، وإجراء تحليل النقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا باستخدام ImageJ مع MultiKymograph، وحدات الماكرو، وتحليل المكونات الإضافية الجسيمات.
- تحليل نقل الميتوكوندريا باستخدام ImageJ
- بعد التقاط الصور الفاصلالزمني ة من حركية الميتوكوندريا، وتحليل سرعة وحركة الميتوكوندريا باستخدام البرنامج المساعد MultiKymograph. يتم حفظ الصور كملفات تنسيق .tiff ، والتي يتم تحليلها من قبل برنامج فيجي بعد طريقة تم الإبلاغ عنها مسبقًا20.
- تحميل برنامج فيجي. تحميل الإضافات التي ستكون هناك حاجة لتحليل سرعة التحرك الميتوكوندريا من kymographs. تحميل حزمة Bio-تنسيقات والمساعد Kymograph جنبا إلى جنب مع هذه الإضافات .class الأربعة، بما في ذلك: MultiKymograph.class، MultipleOverlay.class، StackDifference.class، وWalkingAverage.class (جدول المواد). نقل هذه الملفات إلى مجلد الإضافات فيجي. تحميل "tsp050706.txt" الإضافات إلى مجلد الإضافات. إعادة تشغيل برنامج فيجي عندما يتم نقل الملفات إلى مجلد الإضافات.
- فتح البرمجيات فيجي. اختيار الإضافات، ثم استيراد الصور من سلسلة.tiff من خلال Bio- تنسيقات المستورد تحت Bio -الأشكال. تأكد من اختيار ImageJ القياسية في عرض المكدس،واختيار فتح جميع المسلسلات،والتحقق من Autoscale،ثم انقر فوق موافق. يحيط علما رقم الإطار وحجم الصور في بكسل، والتي يتم عرضها في الجزء العلوي من الصورة.
ملاحظة: خذ 60 إطارًا لكل صورة. - فكر في جعل الصور أكثر وضوحًا عن طريق ضبط السطوع / التباين تحت قائمة الصور لجميع الإطارات الـ 60.
- انقر بزر الماوس الأيمن على أداة الخط لاختيار خط مجزأ ورسم خط مجزأ يبدأ من جسم الخلية وينتهي عند محور المحطة الطرفية. توليد kymograph عن طريق اختيار MultiKymograph تحت الإضافات. تتم المطالبة بتحديد عرض الخط بعد اختيار MultiKymograph. تأكد من أن هذا رقم فردي. اختر 1 لعرض الخط. يتم إنشاء كيموجراف بعد هذه الخطوة.
ملاحظة: يمكن قراءة العديد من أجزاء هامة من المعلومات من الكيموغراف. المحور ص من كيموغراف هو الوقت من المدة (5 دقيقة) لإطارات 60. يمثل المحور س موضع المحاور المحددة. - استخدام خط قطري في الكيموغراف لتحديد اتجاه حركة الميتوكوندريا (ما قبل الوراء، الوراء، أو مستقرة). على سبيل المثال، يشير خط إلى أسفل إلى اليمين على طول المحور ص إلى حركة ما قبل الرُص، ويشير خط إلى أسفل إلى اليسار على طول المحور ص إلى حركة رجعية. يشير الخط العمودي إلى أنه لم تكن هناك حركة في المياتوشوندريون.
- قياس المسافة، والقيم الزمنية، والسرعة للالميتوكوندريا المتحركة باستخدام البرنامج المساعد ماكرو في برنامج فيجي. انتقل إلى الإضافات | وحدات الماكرو | تثبيت | tsp050607.txt. رسم خط مجزأة على أثر حركة الميتوكوندريا على الكيموغراف ، ودائما رسم الخط من المنطقة العليا إلى أدنى (ص المحور).
- بعد رسم الخط ، انتقل إلى الإضافات | وحدات الماكرو | قراءة السرعات من ملعقة صغيرة. نظرًا لأنه يتم رسم خط مجزأ على طول التتبع ، يقرأ المكون الإضافي سرعات مجزأة تقابل الخط.
ملاحظة: الوحدة لكافة البيانات هي وحدات بكسل. dy مجموع هو الوقت المستهلك من نقطة البداية، وdx مجموع يشير إلى مسافة mitochondrion تتحرك في المحور س. dy الآن وdx يظهر الآن الوقت الفترة ومسافة الحركة لكل شريحة، على التوالي. السرعة الفعلية تظهر السرعة لكل شريحة (dx الآن / dy الآن). يشير متوسط السرعة إلى متوسط سرعة الميتوكوندريا المتحركة (مجموع dx/dy). - تغيير وحدة dx الآن من بكسل إلى ميكرومتر كنسبة بكسل في μm عن طريق قياس شريط المقياس. قم بتحويل الوحدة للمسافة من البكسل إلى الميكرومتر عن طريق قياس أشرطة المقياس في الصور. استخدم أداة الخط لرسم خط على طول شريط المقياس وقياس طول الخط عن طريق اختيار Measure' تحت "تحليل. تغيير الوقت من بكسل إلى ثانية، كـ 1 بكسل = 5 ثوان في هذه التجربة.
- في ملف جدول البيانات، قم بحساب متوسط السرعة وتسمية الحركة الرجعية أو السابقة. متوسط سرعة الحركة السابقة أو الرجعية.
- تحديد النسبة المئوية للالميتوكوندريا الثابتة والمتحركة من الكيموغراف. يتم تعريف الميتوكوندريا المتحركة الانتريوية أو الرجعية بأنها تتحرك 5 ميكرومتر إلى الأمام أو الخلف من الأصل خلال الفترة بأكملها21. تعتبر الميتوكوندريا ثابتة إذا لم تتحرك أكثر من 5 ميكرومتر خلال 5 دقيقة.
- تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام ImageJ
ملاحظة: تحديد مورفولوجيا الميتوكوندريا عن طريق قياس طول الميتوكوندريا والمنطقة ونسبة العرض إلى الارتفاع باستخدام ImageJ. للقيام بذلك، اتبع الخطوات التالية.- من أجل تحليل طول الميتوكوندريا والمنطقة داخل محاور عصبية ، قم بتنزيل البرنامج المساعد Straighten_.jar من موقع ImageJ (انظر جدول المواد)ونقله إلى مجلد الإضافات. إعادة تشغيل برنامج ImageJ.
- افتح الصورة من خلال الدالة المفتوحة تحت الملف وتحويل صورة 32 بت إلى 8 بت باستخدام اكتب تحت الصورة.
- رسم خط مجزأة على طول محاور عصبية. اختر استقامة تحت الإضافات وتعيين 50 بكسل لعرض خيوط / خط واسع. هذا سوف يولد محور عصبي مستقيم.
- ضبط عتبة تحت الصورة وتعيين القياس تحت تحليل عن طريق اختيار "المنطقة | محيط | تناسب القطع الناقص | واصفات الشكل.
- قياس شريط المقياس باستخدام وظيفة الخط وتعيين المقياس تحت تحليل عن طريق ملء المسافة في بكسل، تعرف المسافة، ووحدة الطول. ثم اختر عمومية لتعيين إعداد المقياس هذا.
- استخدام تحليل الجسيمات تحت تحليل لتحديد المنطقة. معلمات المطالبة هي الحجم (بكسل ^2) = 0.20-ما لا نهاية، ودائرية = 0.00-1.00، وتظهر = القطع الناقص. اختر نتائج العرض.
ملاحظة: سيؤدي القياس إلى نتائج معلمات مورفولوجيا الميتوكوندريا المتعددة بما في ذلك المساحة ومحيط هاوية الطول (الرئيسية) والعرض (طفيفة) ونسبة العرض إلى الارتفاع (AR). كما يتم سرد رقم الميتوكوندريا المقابل. - حساب عدد الميتوكوندريا لكل محور عصبي (μm) باستخدام عدد الميتوكوندريا مقسومًا على طول المحور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، تم تمييز iPSCs الإنسان إلى الخلايا العصبية الجلوتاميتي ة الخلايا العصبية telencephalic ، والتي تميزت بتلطيخ المناعة مع علامات Tbr1 و αIII tubulin(الشكل 1A). لفحص النقل المحوري للميتوكوندريا ، كانت هذه الخلايا ملطخة بصبغة فلورية حمراء ، وتم إجراء التصوير بفارق زمني. نظرًا لأن ImageJ متاح بسهولة وأسهل في الحصول عليه ، تم تحليل نقل الميتوكوندريا بشكل أكبر باستخدام الإضافات "MultiKymograph" و "Macros" ImageJ ، الموضحة في الشكل 1.
هناك ثلاث ولايات من حركة الميتوكوندريا ، بما في ذلك الحركة الثابتة ، والسابقة ، والحركة الرجعية(الشكل 1B ، C). يمكن أن تظل mitochondrion واحدة ثابتة أو تتحرك في اتجاه ما قبل الوراء أو الوراء داخل محور عصبي ، وهنا ، تم رسم خط مجزأ على طول مسار حركة الميتوكوندريا لتحديد السرعة(الشكل 1D). تظهر سرعة حركة الميتوكوندريا على طول المحور المحوري في الشكل 1E وتتوافق مع الخطوط المجزأة في الشكل 1D بعد القراءة بواسطة "وحدات الماكرو" في ImageJ. على غرار برنامج التحوّل، يمكن استخدام ImageJ لتحديد سرعة الميتوكوندريا والنسبة المئوية للميتوكوندريا المتحركة استنادًا إلى الكيموغراف الذي تم إنشاؤه بواسطة ImageJ(الشكل 1F). باستخدام برامج التحليل المتاحة تجاريا (على سبيل المثال، متحولة)، أظهرت البيانات السابقة أن النسبة المئوية للالميتوكوندريا المتحركة انخفضت بشكل كبير في الخلايا العصبية SPG3A مقارنة بالخلايا العصبية العادية، في حين لم يتم تغيير السرعة19. لتقييم برنامج ImageJ ، تم فحص النسبة المئوية للميتوكوندريا المتحركة ، وتم ملاحظة انخفاض مماثل في النسبة المئوية للالميتوكوندريا المتحركة في الخلايا العصبية SPG3A مقارنة بالخلايا العصبية من النوع البري (WT)(الشكل 1G).
فيما يتعلق بتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا ، تم تحليل منطقة الميتوكوندريا والطول وAR باستخدام وظيفة "تحليل الجسيمات" في ImageJ. تم تقويم أكسونباستخدام البرنامج المساعد "تصويب"(الشكل 2A, B). تم اختيار الميتوكوندريا بوضوح عن طريق تعديل العتبة(الشكل 2C, D). وأخيرا، تم الحصول على منطقة الميتوكوندريا، وطول (الرئيسية)، وعرض (طفيفة)، ونسبة العرض إلى الارتفاع، ومحيط من محور عصبي تقويمها باستخدام "تحليل الجسيمات" البرنامج المساعد(الشكل 2E، F). وكان مورفولوجيا الميتوكوندريا غير طبيعي (وكان سابقا) لوحظ في HSP iPSC المستمدة من الخلايا العصبية الجلوتامات، بما في ذلك خلايا SPG15(الشكل 2G, H, I)13,22. تم تخفيض كل من طول الميتوكوندريا ونسبة العرض إلى الارتفاع بشكل ملحوظ في محاور عصبية SPG15 مقارنة بالتحكم في محاور عصبية WT(الشكل 2G, H, I).
الشكل 1: تحليل نقل الميتوكوندريا باستخدام ImageJ. (أ)التحسس المناعي الذي يظهر جيل الخلايا العصبية الجلوتاميتية المنحلة. Tbr1 (أحمر) ، βIII tubulin (الأخضر) ، وهويشت (الأزرق). أشرطة المقياس = 50 ميكرون. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة19. (ب)نقل الميتوكوندريا داخل محاور عصبية من الخلايا العصبية. تعرف حركة الميتوكوندريا الانتريوية كما الميتوكوندريا الانتقال من جسم الخلية إلى محور عصبي بعيد, وحركة الميتوكوندريا الرجعية تنشأ من محور عصبي بعيد وتمتد إلى الجسم الخلية العصبية. يتم رسم خط الجزء على طول محاور عصبية من جسم الخلية العصبية إلى محطة محاور عصبية بعيدة من أجل توليد kymographs. (ج)يتم إنشاء كيموغراف باستخدام ImageJ; x-المحور هو موضع المحور المحوري والمحور ص هو الوقت. خط أبيض واحد مستمر هو mitochondrion تتحرك في اتجاه ما سبق (رأس السهم الوردي) ، والاتجاه إلى الوراء (رأس السهم الأزرق) ، أو حالة ثابتة (رأس السهم الأصفر). (D)يتم رسم الخط المجزأ لقراءة السرعة باستخدام البرنامج المساعد وحدات الماكرو. تصف الأرقام من 1 إلى 8 الجزء من السطر. يمكن تمييز حركة ما قبل الرُدُج (1-4، 6، 8) والحالة الساكنة (5، 7) عن هذه الكيموجراف المكبرة. (E)الوقت والمسافة المتحركة لكل شريحة، السرعة الفعلية والمتوسطة (بالبكسل). (واو)كيموغراف من نقل الميتوكوندريا لWT وSPG3A الـ PNs القشرية باستخدام ImageJ. مقياس شريط = 10 μm. (G) نسبة الميتوكوندريا Motile في WT و SPG3A المؤشرات القشرية باستخدام ImageJ (*p < 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام ImageJ. (أ)معلمات لتقويم محور عصبي. (ب)قام الممثل بتقويم محور عصبي. (C،D) تعديل عتبة لاختيار الميتوكوندريا. (E،F) منطقة الميتوكوندريا المقاسة، المحيط، الطول (الرئيسي)، العرض (طفيفة)، ونسبة العرض إلى الارتفاع (AR) المقابلة للالميتوكوندريا المختارة في (E). (G)صور تمثيلية من الميتوكوندريا في WT وSPG15 الخلايا العصبية الجلوتامات ية telencephalic. مقياس القضبان = 20 ميكرومتر (H) طول الميتوكوندريا في الخلايا العصبية WT و SPG15. (I)نسبة العرض إلى الارتفاع من الميتوكوندريا في الخلايا العصبية WT و SPG15. **p < 0.01 مقابل. WT. (G) و (H) و (I) يتم تعديلها من دراسة سابقة13. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أدوات الفلورسنت | مزايا | عيوب | مراجع |
| ميتو تراكر | MitoTracker هو الميتوكوندريا المحتملة المستقلة ويمكن استخدامها لتحليل توطين الميتوكوندريا مع autophagosome أو الليسوسوم. | MitoTracker ليست phototable بما فيه الكفاية للبحث على المدى الطويل. | 35 |
| NPA-TPP | هذه الصبغة هي رواية قابلة للصور الميتوكوندريا وضع العلامات الكاشف. | عملية التوليف وتنقية هذه الصبغة تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. | 23 |
| ميتوبادي | يمكن استخدام هذه الصبغة لتصور الميتوكوندريا باستخدام المجهر رامان مع حساسية عالية وخصوصية. | استخدام هذه الصبغة يتطلب المجهر رامان. | 25 |
| TMRE | هذه الصبغة هي صبغة تلطيخ الميتوكوندريا غير السامة والمحددة بتركيز منخفض وليس تأثير إخماد. | TMRE وضع العلامات الميتوكوندريا يعتمد على احتمال غشاء الميتوكوندريا. | 36, 37 |
| بروتينات الفلورسنت المستهدفة بالميتوكوندريا | البروتينات الفلورية المستهدفة بالميتوكوندريا أكثر تحديداً واستقراراً. | هذا الأسلوب يحتاج إلى transfection وtransfection الكفاءة يختلف عن أنواع الخلايا المختلفة. | 38, 39 |
الجدول 1: مزايا وعيوب بعض الأدوات الفلورية لوسم الميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه المقالة طريقة لتحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في محاور عصبية باستخدام صبغة الفلورسنت الحمراء وبرنامج ImageJ ، وكلاهما يوفر منصة فريدة لدراسة الضمور المحوري ومورفولوجيا الميتوكوندريا في الأمراض العصبية. هناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول ، بما في ذلك تلطيخ الميتوكوندريا ، والتصوير الحي للخلايا ، وتحليل الصور. في هذه الطريقة ، تم استخدام صبغة فلورية لوصمة الميتوكوندريا. نظرًا لأن الخلايا العصبية المشتقة من iPSC البشرية يتم فصلها بسهولة عن الطبق ، فمن المهم ترك بعض المحلول في الطبق وإضافة وسط عصبي. يمكن إجراء الغسيل ثلاث أو أربع مرات لإزالة الصبغة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تسمية الميتوكوندريا مع مراسلين آخرين لقياس وسائل النقل على طول المحاور ، مثل البروتين الفلوري المنصهر الميتوكوندريا التي تستهدف البروتينات6. في التتبع على المدى الطويل ، أظهرت العديد من المسابير (أي NPA-TPP ، 2،1،3-benzothiadiazole [BTD] المشتقات الفلورية ، ومسبار رامان محدد) إمكانات كبيرة في تتبع الميتوكوندريا على المدى الطويل وتحليل ديناميات الميتوكوندريا23،24،25. ويمكن الاطلاع على مزايا وعيوب مختلف المسابير في الجدول 1.
بعد تلطيخ الميتوكوندريا ، يتم إجراء التصوير الحي للخلايا باستخدام مجهر مجهز بحاضنة. لتركيز الخلايا العصبية بشكل فعال أثناء التصوير ، يجب الاحتفاظ بالعينات العصبية في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 وفي بيئة رطبة لمدة 15 دقيقة على الأقل. لتقليل تأثيرات خارج التركيز البؤري، يمكن التقاط الصور في مواضع Z المختلفة لإنشاء مكدس Z، أو يمكن استخدام وظيفة التركيز التلقائي. الأهم من ذلك، لتحديد اتجاه نقل الميتوكوندريا (ما قبل التدرج أو الوراء)، يتم أخذ صور المرحلة للتمييز بين جسم الخلية العصبية ومحاور عصبية. وثمة مسألة هامة أخرى هي التبييض الضوئي لعينات الفلورسنت، التي يجب منعها للحصول على صور فعالة للنقل الميتوكوندريا الفاصل الزمني. طريقة فعالة لتقليل التبييض الضوئي هو تركيز العينات من خلال العدسة وتعيين جميع معلمات التصوير تحت قناة المرحلة ، باستثناء وقت التعرض. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يقلل نمط التحجيم التلقائي من التبييض الضوئي للفلورية.
الميتوكوندريا هي العضيات ديناميكية للغاية ويمكن أن تتحرك في كل من الاتجاهات السابقة وإلى الوراء. في الخلايا العصبية، وعدد قليل من الميتوكوندريا داخل محاور عصبية البقاء ثابتة أثناء التسجيل. بين الميتوكوندريا المتحركة، يمكن أن تختلف حالة الحركة مع مرور الوقت. هذه الظاهرة تثير سؤالا هاما عن نوع الميتوكوندريا الذي يعتبر ثابتا أو متحركا. ويمكن حل هذا عن طريق تحديد عتبة أثناء تحليل النقل المحوري الميتوكوندريا. للتمييز بين الميتوكوندريا الساكنة ، استخدم نيومان وآخرون مركز مسار الميتوكوندريا ، والذي يتم تعريفه على أنه متوسط إحداثيات موقعه بمرور الوقت ، ثم حدد العتبة إلى 350 نانومتر / ث بحيث تكون مسافة الانحراف القصوى للmitochondrion من مركز المسار الخاص بها في الإطار الأول26. وفي دراسة أخرى، حدد المؤلفون 50 نانومتر/سنة كعتبة للتمييز بين الحالة الثابتة والحالة المتحركة27. تم استخدام عتبة 300 نانومتر / ث هنا للتمييز بين النقل القائم على microtubule كما هو الحال في التقارير السابقة28،29. على الرغم من أن عتبة الميتوكوندريا الثابتة والمتحركة مختلفة، فإن تحديد العتبة يمكن أن يوفر معلومات نسبية هامة عن حركة الميتوكوندريا داخل محاور عصبية بين الخلايا العصبية البرية والتنكسية.
وقد استخدمت معظم البروتوكولات التي تنطوي على تحليل النقل الميتوكوندريا kymograms، والتي هي تمثيل ثنائي الأبعاد من المواقف مقابل الوقت. وقد تم تطوير أدوات آلية متعددة لتحليل تتبع الجسيمات26،30،31،32،33،34. هذه يمكن فصل بدقة كل إطار. بالإضافة إلى السرعة والنسبة المئوية المتنوعة التي يمكن لـ ImageJ قياسها، يمكن لهذه الطريقة قياس الأحداث المتحركة بدقة. ومع ذلك ، هذه ليست حرة في الاستخدام. هنا ، تم إجراء تحليل نقل الميتوكوندريا باستخدام ImageJ مع الإضافات "Multikymograph" و "Macros". هذه الإضافات يمكن قياس حركة الميتوكوندريا بشكل فعال. ميزة هذه الإضافات هي سهولة استخدامها والقدرة على الإشارة إلى التعديلات في النقل المحوري الميتوكوندريا في شكل kymographs والسرعة مع مرور الوقت.
تم تحليل الميتوكوندريا المتحركة في SPG3A والخلايا العصبية السيطرة. ولوحظ انخفاض مماثل في النسبة المئوية للميتوكوندريا المتحركة باستخدام طريقتين مختلفتين للتحليل، مما يؤكد فائدة ImageJ في تحليل النقل المحوري. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام نفس المجموعة من الصور ، والتي توفر قراءة مهمة لدراسة خلل الميتوكوندريا في الأمراض العصبية المختلفة. منذ الانحطاط المحوري واختلال وظيفي الميتوكوندريا عادة ما تحدث خلال المراحل المبكرة، قبل أن تموت الخلايا العصبية، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة التغيرات المرضية المبكرة للمساعدة في تحديد المسارات الجزيئية والعلاجات الشاشة لإنقاذ التنكس العصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الشلل النصفي التشنجي، ومؤسسة بليزر، والمعهد الوطني للصحة (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
