Summary
Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative. Il protocollo presentato utilizza neuroni del prosencefalo derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nella paraplegia spastica ereditaria. Questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l'analisi della loro morfologia, che faciliterà lo studio delle malattie neurodegenerative.
Abstract
I neuroni hanno richieste intense di alta energia al fine di sostenere le loro funzioni. Trasporto mitocondriale alterato lungo gli assoni è stato osservato nei neuroni umani, che possono contribuire alla neurodegenerazione in vari stati di malattia. Anche se è difficile esaminare le dinamiche mitocondriali nei nervi umani vivi, tali paradigmi sono fondamentali per studiare il ruolo dei mitocondri nella neurodegenerazione. Descritto qui è un protocollo per l'analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia mitocondriale negli assoni neuronali del prosencefalo derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Gli iPSC sono differenziati in neuroni glutamatergici telencefali utilizzando metodi consolidati. I mitocondri dei neuroni sono macchiati con MitoTracker CMXRos, e il movimento mitocondriale all'interno degli assoni viene catturato utilizzando un microscopio di imaging a cellule vive dotato di un'incubatrice per la coltura cellulare. Le immagini time-lapse vengono analizzate utilizzando un software con plugin "MultiKymograph", "Bioformat importer" e "Macros". Kymographs di trasporto mitocondriale sono generati, e la velocità mitocondriale media nelle direzioni anterograde e retrogrado è letto dal kymografo. Per quanto riguarda l'analisi morfologia mitocondriale, lunghezza mitocondriale, area, e proporzioni sono ottenuti utilizzando l'ImmagineJ. In sintesi, questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l'analisi della loro morfologia per facilitare gli studi sulle malattie neurodegenerative.
Introduction
La motilità e la distribuzione mitocondriali svolgono un ruolo vitale nel soddisfare le richieste energetiche variabili e specializzate nei neuroni polarizzati. I neuroni possono estendere gli assoni estremamente lunghi per connettersi con gli obiettivi attraverso la formazione di sinapsi, che richiedono alti livelli di energia per il buffering di Ca2 o più. Il trasporto di mitocondri da soma ad assone è fondamentale per supportare la funzione assonale e sinaptica dei neuroni. Il movimento mitocondriale a livello spaziale e temporale è condotto dal trasporto assonale veloce a velocità di diversi micrometri al secondo1.
In particolare, le proteine motorie o adattatori, come la cinesina e la dineina, partecipano al trasporto rapido di orgelli lungo i microtubuli per controllare il movimento dei mitocondri2,3. L'attività neuronale normale richiede un corretto trasporto dei mitocondri appena assemblati dal soma neuronale all'assone distale (trasporto assonale anterogrado) e il trasporto inverso dei mitocondri dall'assone distale al corpo cellulare (trasporto retrogrado). Recenti studi hanno indicato che l'allocazione mitocondriale impropria è fortemente associata a difetti neuronali e malattie degenerative del motoneurone4,5. Pertanto, per sezionare il ruolo dei mitocondri nella neurodegenerazione, è importante stabilire metodi per esaminare il movimento mitocondriale lungo gli assoni nelle culture vive.
Ci sono due sfide principali nell'esaminare e analizzare il tracciamento dei mitocondri: (1) identificare i mitocondri dallo sfondo in ogni fotogramma e (2) analizzare e generare le connessioni tra ogni fotogramma. Nel risolvere la prima sfida, un approccio di etichettatura a fluorescenza è ampiamente usato per distinguere i mitocondri dallo sfondo, come la tintura MitoTracker o la trasfezione di proteine bersaglio mitocondriali fusa di fluorescenza (ad esempio, mito-GFP)6,7,8. Per analizzare l'associazione tra i frame, diversi algoritmi e strumenti software sono stati descritti negli studi precedenti9. In un recente articolo, i ricercatori hanno confrontato quattro diversi strumenti automatizzati (ad esempio, Volocity, Imaris, wrMTrck e Difference Tracker) per quantificare il trasporto mitocondriale. I risultati hanno mostrato che, nonostante le discrepanze nella lunghezza della pista, nello spostamento mitocondriale, nella durata del movimento e nella velocità, questi strumenti automatizzati sono adatti per valutare la differenza di trasporto dopo il trattamento10. Oltre a questi strumenti, un plugin integrato "Macros" per ImageJ (scritto da Rietdorf e Seitz) è stato ampiamente utilizzato per l'analisi del trasporto mitocondriale11. Questo metodo genera kymografi che possono essere utilizzati per analizzare il movimento mitocondriale, compresa la velocità sia in direzione anterograda che retrogrado.
I mitocondri sono organelli altamente dinamici che cambiano costantemente in numero e morfologia in risposta sia a condizioni fisiologiche che patologiche. La fissione mitocondriale e la fusione regolano strettamente la morfologia mitocondriale e l'omeostasi. Lo squilibrio tra fissione mitocondriale e fusione può indurre reti mitocondriali estremamente brevi o lunghe, che possono alterare la funzione mitocondriale e provocare attività neuronali anormali e neurodegenerazione. Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Huntington e la paraplegia spastica ereditaria (HSP)12,13,14,15. HSP è un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici ereditari caratterizzati dalla degenerazione del tratto corticospinale e dalla conseguente incapacità di controllare i muscoli degli arti inferiori16,17. In questo studio, i neuroni del prosencefalo derivati da iPSC vengono utilizzati per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nell'HSP. Questo metodo fornisce un paradigma unico per esaminare le dinamiche mitocondriali degli assoni neuronali nelle culture vive.
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Protocol
1. Generazione di neuroni glutamatergici telencefali da iPSC
NOTA: Il protocollo dettagliato per il mantenimento degli iPSC e la loro differenziazione nei neuroni glutamatergici telencefali sono simili a quelli descritti in precedenza18. In questo caso, il processo critico durante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane viene introdotto ed evidenziato.
- Coltura iPSCs su alimentatori fibroblasti embrionali murini (MEF) in cellule staminali embrionali umane (hESC) con integrazione con fattore di crescita del fibroblasto (bFGF, 4 ng/mL).
- Dopo l'incubazione con dispase (1 mg/mL) per 3 min, dissociare gli iPSC in piccoli grumi. Quindi, la coltura l'iPSC aggrega in sospensione nel supporto hESC per 4 giorni. Fare riferimento a questo punto di riferimento, quando gli iPSC iniziano come coltura di sospensione, come giorno 1 (D1). Cambiare il mezzo giornaliero per 4 giorni.
- A D5, raccogliere gli aggregati iPSC dopo la centrifugazione a 200 x g per 2 min e la coltura in mezzi di induzione neurale (NIM) per 3 giorni. Coltura della cella aggrega in sospensione per 3 giorni cambiando metà dei media ogni 2 giorni. Aggiungere DMH-1 (2 m) e SB431542 (2 m) al mezzo NIM per aumentare l'efficienza di induzione neurale.
- A D8, raccogliere gli aggregati iPSC dopo la centrifugazione a 200 x g per 2 min e lasciarli aderire a 6 piastre di pozzo (circa 20-30 aggregati per pozzo del pozzo) culcolando in NIM con 10% FBS (o con piastre rivestite di laminaina) durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il vecchio supporto e passare a NIM ogni 2 giorni fino a D17.
NOTA: La generazione di cellule neuroepiteliali, che è indicata dalla formazione di cellule colonnari con strutture di rosette, è osservata in questo periodo. - A D17, isolare meccanicamente le cellule neuroepiteliali al centro delle colonie (sollevandosi direttamente applicando una piccola pressione al centro delle colonie) o enzimaticamente (trattata con dispase). Trasferire le cellule neuroepiteliali isolate in fiaschetta T25 con una coltura di 8 mL di NIM con aggiunta di B27 (1x), cAMP (1 m) e IGF (10 ng/mL).
NOTA: La coltura delle sospensioni consente alle cellule di formare neurosfere arricchite con progenitori neurali di proiezione corticale. - Dopo D35, piastra le neurosfere sulla poliorite e LDEV-free ridotto matrice della membrana seminterrato fattore di crescita (Tabella dei materiali)-rivestito 35 mm piatti di fondo in vetro per generare neuroni glutamanogici telencefali (neuroni di proiezione corticale). Prima della placcatura, dissociare le neurosfere in piccoli ammassi incubando con 1 soluzione di distacco cellulare mg/mL per 2 min a 37 gradi centigradi.
- Rimuovere la soluzione di distacco cellulare con centricazione e resospensione in 1 mL di mezzo di differenziazione neurale (NDM). Piatto di cellule sul piatto inferiore di vetro (circa cinque grappoli in 100 - L di media per piatto) per farli attaccare. Quindi, aggiungere NDM (1 mL per piatto) e la coltura delle cellule in NDM contenente B27 (1x), cAMP (1 -M), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) e GDNF (10 ng/mL).
NOTA: Piccoli ammassi sono placcati perché sopravvivono bene e danno origine a lunghi neuroni di proiezione. In alternativa, le cellule possono essere dissociate e placcate ad una densità di circa 20.000 cellule per piatto per una migliore separazione. - Caratterizzare i neuroni glutamanogici telencefali sfruttando i marcatori Tbr1 e tubulina.
2. Esame del trasporto mitocondriale lungo gli assoni di neuroni glutamatergici telencefali
- Riscaldare il NDM e accendere l'incubatrice per il microscopio a fluorescenza fissato a 37 e 5% di CO2.
- Per visualizzare i mitocondri lungo gli assoni dei neuroni prosencefalo, incubare i neuroni con 50 nN colorante fluorescente rosso per macchiare i mitocondri nelle cellule vive (ad esempio, MitoTracker CMXRos) in NDM per 3 min a 37 gradi centigradi. Successivamente, lavare le celle 2x con NDM riscaldato. I neuroni sono incubati in NDM.
- Per registrare il trasporto mitocondriale lungo gli assoni, scattare immagini time-lapse del movimento mitocondriale utilizzando l'obiettivo 40x con un microscopio a fluorescenza.
NOTA: Per stabilizzare la coltura, eseguire l'imaging delle cellule vive quando le cellule vengono incubate nell'incubatrice per 20 min a seguito di colorazione mitocondriale. - Sotto il campo di fase, identificare gli assoni in base alle caratteristiche morfologiche (emergono direttamente dal corpo cellulare neuronale, costanti neuriti lunghi sottili senza ramificazione). I mitocondri si muovono in direzioni anterogrado (dal corpo cellulare all'assone distale) e retrogrado (dal terminale assonale al corpo cellulare). Per distinguere la direzione del movimento mitocondriale lungo gli assoni, identificare chiaramente i corpi cellulari dei neuroni. In questo passaggio, mettere a fuoco gli assoni sotto il campo di fase per ridurre il fotosbiancamento.
- Dopo aver distinto il corpo cellulare e l'assone, regolare il tempo di esposizione e la messa a fuoco dei mitocondri negli assoni. Quindi, catturare il trasporto di mitocondri all'interno di assoni ogni 5 s per una durata totale di 5 min, producendo 60 fotogrammi. Cattura in modo casuale almeno cinque posizioni per ogni piatto e ripeti 3 volte per ogni gruppo.
3. Analisi dei dati del trasporto mitocondriale e morfologia nei neuroni corticali
NOTA: analizzare i dati raccolti sul trasporto mitocondriale utilizzando un software di analisi delle immagini (ad esempio ImageJ o MetaMorph19). Poiché ImageJ è prontamente disponibile, eseguire l'analisi del trasporto mitocondriale e morfologia utilizzando ImageJ con il MultiKymograph, Macros, e Analizzare le particelle plugin.
- Analisi del trasporto mitocondriale tramite ImageJAnalyzing mitocondrial transport using ImageJ
- Dopo aver catturato le immagini time-lapse della motilità mitocondriale, analizzare la velocità e il movimento dei mitocondri utilizzando il plugin MultiKymograph. Le immagini vengono salvate come file in formato .tiff, che vengono analizzati dal software Fiji seguendo un metodo precedentemente riportato20.
- Scarica il software Fiji. Scarica i plugin che saranno necessari per analizzare la velocità di movimento mitocondriale dai kymographs. Scaricare il pacchetto Bio-formati e Kymograph Plugin insieme a questi quattro plugin .class, tra cui: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class e WalkingAverage.class (Tabella dei materiali). Spostare questi file nella cartella dei plugin Fiji. Scaricare i plug-in "tsp050706.txt" nella cartella plugins. Riavviare il software Fiji quando i file vengono spostati nella cartella plugins.
- Apri il software Fiji. Scegli plugin, quindi importa le immagini della serie .tiff tramite Bio-Formats Importer in Bio-Formats. Assicurarsi di scegliere Immagine standardJ in Visualizzazione pila, scegliere Apri tutte le serie, selezionare Scala automatica, quindi fare clic su OK. Prendere nota del numero di fotogramma e delle dimensioni delle immagini in pixel, che vengono visualizzate nella parte superiore dell'immagine.
NOTA: prendi 60 fotogrammi per immagine. - È consigliabile rendere le immagini più chiare regolando la luminosità/contrasto nel menu Immagine per tutti i 60 fotogrammi.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento linea per scegliere la linea segmentata e disegnare una linea segmentata a partire dal corpo della cella e terminando in corrispondenza dell'assone terminale. Generare il kymograph scegliendo MultipleKymograph in Plugins. La selezione della larghezza della linea viene richiesta dopo aver scelto il multipleKymograph. Assicurarsi che si tratti di un numero dispari. Scegliere 1 per lo spessore della linea. Un kymografo viene generato dopo questo passaggio.
NOTA: Diverse informazioni importanti possono essere lette dal kymograph. L'asse y del kymografo è il tempo di durata (5 min) per i 60 fotogrammi. L'asse x rappresenta la posizione degli assoni selezionati. - Utilizzare una linea diagonale nel kymografo per determinare la direzione di movimento dei mitocondri (anterograda, retrogrado o stabile). Ad esempio, una linea che scende a destra lungo l'asse y indica il movimento anterogrado, mentre una linea che scende verso sinistra lungo l'asse y indica il movimento retrogrado. Una linea verticale indica che non c'era alcun movimento nel mitocondrio.
- Misurare la distanza, i valori di tempo e la velocità per i mitocondri in movimento utilizzando il plugin Macro nel software Fiji. Vai a Plugins Macros Proprietà Install . tsp050607.txt. Disegnare una linea segmentata sulla traccia del movimento mitocondriale sul kymograph e disegnare sempre la linea dalla regione superiore a quella inferiore (asse y).
- Dopo aver disegnato la linea, vai a Plugins . Macros velocità di lettura da tsp. Poiché viene disegnata una linea segmentata lungo la traccia, il plugin legge le velocità segmentate corrispondenti alla linea.
NOTA: l'unità per tutti i dati è pixel. somma dy è il tempo consumato dal punto iniziale, e dx somma indica la distanza del mitocondrio in movimento nell'asse x. dy now e dx ora mostra il tempo del periodo e la distanza di movimento per ogni segmento, rispettivamente. velocità effettiva mostra la velocità per ogni segmento (dx ora / dy ora). la velocità media indica la velocità media per il movimento mitocondriale (somma dx/dy). - Modificare l'unità di dx ora da pixel a m come rapporto di pixel in m misurando la barra della scala. Convertire l'unità per la distanza da pixel a m misurando le barre della scala nelle immagini. Utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea lungo la barra della scala e misurare la lunghezza della linea scegliendo Misura' in "Analizza. Modifica il tempo da pixel a secondi, come 1 pixel e 5 secondi in questo esperimento.
- Nel file del foglio di calcolo, calcolare la velocità media e il movimento di retrogrado o anterogrado dell'etichetta corrispondente. Calcolare la media della velocità di movimento anterogrado o retrogrado.
- Determinare la percentuale di mitocondri stazionari e motile dal kymograph. I mitocondri in movimento anterogrado o retrogrado sono definiti come in movimento di 5 m in avanti o indietro rispetto all'origine durante l'intero periodo21. I mitocondri sono considerati stazionari se non si sono mossi più di 5 m durante i 5 min.
- Analisi della morfologia mitocondriale utilizzando ImageJ
NOTA: determinare la morfologia mitocondriale misurando la lunghezza mitocondriale, l'area e le proporzioni utilizzando ImageJ. A tale scopo, attenersi alla seguente procedura.- Per analizzare la lunghezza mitocondriale e l'area all'interno degli assoni, scaricare il plug-in Straighten_.jar dal sito ImageJ (vedere Tabella dei materiali)e spostarlo nella cartella dei plugin. Riavviare il software ImageJ.
- Aprire l'immagine tramite la funzione open in File e convertire l'immagine a 32 bit in 8 bit utilizzando Tipo in Immagine.
- Disegnare una linea segmentata lungo gli assoni. Scegliere Raddrizza in Plugin e impostare 50 pixel per Larghezza linea di filamento/linea larga. Questo genererà un assone raddrizzato.
- Regolare la soglia sotto Immagine e impostare la misura in Analizza scegliendo "Area Proprietà Perimetro di proprietà . Adatta l'ellisse Descrittori di forma.
- Misurare la barra della scala utilizzando la funzione linea e impostare la scala in Analizza riempiendo la distanza in pixel, conoscerela distanza e l'unità di lunghezza. Quindi, scegliere Globale per impostare questa impostazione di scala.
- Utilizzare Analizza particelle in Analizza per determinare l'area. I parametri di prompt sono size (pixel -2) : 0,20–infinity, circularity - 0,00–1,00, e mostrano i puntini di sospensione. Scegliere Visualizza risultati.
NOTA: La misurazione produrrà i risultati di più parametri di morfologia mitocondriale, tra cui area, perimetri, lunghezza (maggiore), larghezza (minore) e proporzioni (AR). Viene elencato anche il numero mitocondriale corrispondente. - Calcolare il numero mitocondriale per assonale utilizzando il numero mitocondriale diviso per la lunghezza assonale.
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Representative Results
In questo caso, gli iPSC umani sono stati differenziati in neuroni glutamanogici telencefali, che sono stati caratterizzati dall'immunostaining con i marcatori di tubulina Tbr1 e .III (Figura 1A). Per esaminare il trasporto assonale dei mitocondri, queste cellule sono state macchiate di colorante fluorescente rosso ed è stata eseguita l'imaging time-lapse. Dal momento che ImageJ è prontamente disponibile e più facile da ottenere, il trasporto mitocondriale è stato ulteriormente analizzato con i plugin ImageJ "MultiKymograph" e "Macros", mostrati in Figura 1.
Ci sono tre stati di movimento mitocondriale, tra cui il movimento statico, anterogrado e retrogrado (Figura 1B,C). Un singolo mitocondrione può rimanere statico o muoversi in direzione anterograda o retrograda all'interno di un assone, e qui, una linea segmentata è stata tracciata lungo la pista del movimento mitocondriale per determinare la velocità (Figura 1D). La velocità del movimento mitocondriale lungo l'assone è illustrata nella Figura 1E e corrisponde alle linee segmentate in Figura 1D dopo la lettura da "Macro" in ImageJ. Simile al software MetaMorph, ImageJ può essere utilizzato per determinare la velocità mitocondriale e la percentuale di mitocondri motile in base al kymografo generato da ImageJ (Figura 1F). Utilizzando un software di analisi disponibile in commercio (ad esempio, MetaMorph), i dati precedenti hanno mostrato che la percentuale di mitocondri motile era significativamente ridotta nei neuroni SPG3A rispetto ai neuroni normali, mentre la velocità non è stata alterata19. Per valutare il software ImageJ, è stata esaminata la percentuale di mitocondri motile e una riduzione simile della percentuale di mitocondri motile nei neuroni SPG3A rispetto ai neuroni di tipo selvaggio (WT) (Figura 1G).
Per quanto riguarda l'analisi della morfologia mitocondriale, l'area mitocondriale, la lunghezza e l'AR sono state analizzate utilizzando la funzione "analizza particelle" in ImageJ. Gli assoni sono stati raddrizzati utilizzando il plugin "raddrizzare" (Figura 2A,B). I mitocondri sono stati scelti in modo chiaro regolando la soglia (Figura 2C,D). Infine, l'area mitocondriale, la lunghezza (maggiore), la larghezza (minore), le proporzioni e il perimetro sono stati ottenuti dall'assone raddrizzato utilizzando il plugin "Analizza particelle" (Figura 2E, F). La morfologia mitocondriale anormale è stata (ed è stata precedentemente) osservata nei neuroni glutamatergici telefluacici derivati da HSP, comprese le cellule SPG15 (Figura 2G,H,I)13,22. Sia la lunghezza mitocondriale che il rapporto di aspetto sono stati significativamente ridotti negli assoni neuronali SPG15 rispetto agli assoni neuronali WT(Figura 2G,H,I).
Figura 1: Analisi del trasporto mitocondriale utilizzando ImageJ. (A) Immunostaining che mostra la generazione di neuroni glutamatergici telencefali. Tbr1 (rosso), tubulina (verde) e Hoechst (blu). Barre della scala: 50 m. Questa cifra è stata modificata da uno studio precedente19. (B) Trasporto mitocondriale all'interno di assoni di neuroni. Il movimento mitocondriale anterogrado è definito come i mitocondri che si spostano dal corpo cellulare all'assone distale, e il movimento mitocondriale retrogrado proviene dall'assone distale e si estende al corpo cellulare neuronale. La linea del segmento viene tracciata lungo gli assoni dal corpo cellulare neuronale al terminale assonale distale al fine di generare kymografi. (C) Il kymografo viene generato utilizzando ImageJ; l'asse x è la posizione assonale e l'asse y è il tempo. Una linea bianca continua è il mitocondrione che si muove in direzione anterograda (punta della freccia rosa), direzione retrograda (freccia blu) o stato statico (freccia gialla). (D) La linea segmentata viene disegnata per leggere la velocità utilizzando il plugin Macro. I numeri da 1 a 8 descrivono il segmento della linea. Il movimento anterogrado (1-4, 6, 8) e lo stato statico (5, 7) possono essere distinti da questo kymograph ingrandito. (E) Tempo e distanza di spostamento per ogni segmento, velocità effettiva e media (in pixel). (F) Kymograph del trasporto mitocondriale per PN corticali WT e SPG3A utilizzando ImageJ. Barra di scala: rapporto mitocondriale motile (10 m. (G) in WT e SPG3A cortical PN utilizzando ImageJ (P < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi della morfologia mitocondriale mediante ImageJ. (A) Parametri per raddrizzare l'assone. (B) L'assone raddrizzato dal rappresentante. (C,D) Regolazione della soglia per scegliere i mitocondri. (E,F) L'area mitocondriale misurata, il perimetro, la lunghezza (maggiore), la larghezza (minore) e le proporzioni (AR) corrispondenti ai mitocondri selezionati in (E). (G) Immagini rappresentative dei mitocondri nei neuroni glutamatergici WT e SPG15. Barre di scala - 20 m. (H) Lunghezza mitocondriale nei neuroni WT e SPG15. (I) Rapporto di aspetto dei mitocondri nei neuroni WT e SPG15. < 0,01 vs. WT. (G), (H) e (I) sono modificati da uno studio precedente13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Strumenti fluorescenti | Vantaggi | Svantaggi | Riferimenti |
| MitoTracker | MitoTracker è mitocondriale potenziale indipendente e può essere utilizzato per analizzare la co-localizzazione dei mitocondri con autofagosoma o lisosoma. | MitoTracker non è abbastanza fototable per la ricerca a lungo termine. | 35 |
| NPA-TPP | Questo tinriè è un nuovo reagente di etichettatura mitocondriale fototavola. | Il processo di sintesi e purificazione di questo colorante è lungo e costoso. | 23 |
| MitoBADY | Questo tinriè può essere utilizzato per la visualizzazione mitocondriale utilizzando la microscopia Raman con alta sensibilità e specificità. | L'uso di questo tinrito richiede il microscopio Raman. | 25 |
| TMRE | Questo colorante è un colorante mitocondriale non tossico e specifico con bassa concentrazione e nessun effetto di spegnimento. | I mitocondri di etichettatura TMRE dipendono dal potenziale della membrana mitocondriale. | 36, 37 |
| Proteine fluorescenti mitocondriari | Le proteine fluorescenti mitocondriali sono più specifiche e stabili. | Questo metodo ha bisogno di trasfezione e l'efficienza della trasfezione è diversa per diversi tipi di cellule. | 38, 39 |
Tabella 1: Vantaggi e svantaggi di alcuni strumenti fluorescenti per l'etichettatura mitocondriale.
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Discussion
Questo articolo descrive un metodo per analizzare il trasporto mitocondriale e la morfologia negli assoni neuronali utilizzando il tinrito fluorescente rosso e il software ImageJ, entrambi che forniscono una piattaforma unica per studiare la degenerazione assonale e la morfologia mitocondriale nella malattia neurodegenerativa. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, tra cui la colorazione dei mitocondri, l'imaging delle cellule vive e l'analisi delle immagini. In questo metodo, un coloranti fluorescente è stato utilizzato per macchiare i mitocondri. Poiché i neuroni umani derivati da iPSC sono facilmente staccati dal piatto, è importante lasciare qualche soluzione nel piatto e aggiungere delicatamente il mezzo neurobasale. Il lavaggio può essere eseguito tre o quattro volte per rimuovere il tinri. Inoltre, i mitocondri possono essere etichettati con altri giornalisti per misurare il loro trasporto lungo gli assoni, come le proteine fluorescenti fuse mitocondri di puntamento delle proteine6. Nel tracciamento a lungo termine, diverse sonde (cioè, NPA-TPP, 2,1,3-benzothiadiazole [BTD] derivati fluorescenti, e una specifica sonda Raman) hanno mostrato un grande potenziale nel monitoraggio mitocondriale a lungo termine e nell'analisi della dinamica mitocondriale23,24,25. I vantaggi e gli svantaggi di varie sonde sono riportati nella Tabella 1.
Dopo la colorazione mitocondriale, l'imaging delle cellule vive viene eseguito utilizzando un microscopio dotato di un'incubatrice. Per mettere a fuoco efficacemente i neuroni durante l'imaging, i campioni neurali devono essere conservati nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e in un ambiente umido per almeno 15 min. Per ridurre al minimo gli effetti fuori fuoco, è possibile creare immagini in posizioni diverse per la creazione di uno stack di z oppure è possibile utilizzare la funzione di messa a fuoco automatica. È importante sottolineare che, per identificare la direzione del trasporto mitocondriale (anterogrado o retrogrado), vengono prese immagini di fase per distinguere il corpo cellulare neuronale e gli assoni. Un'altra questione critica è il fotosbiancamento di campioni fluorescenti, che devono essere prevenuti per ottenere immagini time-lapse di trasporto mitocondriale efficienti. Un metodo efficace per ridurre al minimo il fotobleaching consiste nel mettere a fuoco i campioni attraverso l'oculare e impostare tutti i parametri di imaging sotto il canale di fase, ad eccezione del tempo di esposizione. Inoltre, il modello di ridimensionamento automatico può ridurre il fotosbiancamento della fluorescenza.
I mitocondri sono organelli altamente dinamici e possono muoversi sia in direzione anterograda che retrograda. Nei neuroni, alcuni mitocondri all'interno degli assoni rimangono fermi durante la registrazione. Tra i mitocondri in movimento, lo stato del movimento può variare nel tempo. Questo fenomeno solleva l'importante questione di quale tipo di mitocondri è considerato fermo o in movimento. Questo problema può essere risolto impostando la soglia durante l'analisi del trasporto assonale mitocondriale. Per distinguere i mitocondri statici, Neumann e altri hanno utilizzato il centro della traccia mitocondriale, che è definito come la media delle sue coordinate di posizione nel tempo, quindi impostare la soglia a 350 nm/s in modo che la distanza massima di deviazione del mitocondrio dal centro della pista sia nel primo fotogramma26. In un altro studio, gli autori impostano 50 nm/s come soglia per distinguere lo stato stazionario dallo stato di spostamento27. In questo caso è stata utilizzata una soglia di 300 nm/s per distinguere il trasporto basato su microtubuli come fatto nei rapporti precedenti28,29. Anche se la soglia per i mitocondri stazionari e in movimento è diversa, l'impostazione della soglia può fornire importanti informazioni relative sul movimento mitocondriale all'interno degli assoni tra neuroni selvatici e degenerativi.
La maggior parte dei protocolli che coinvolgono l'analisi del trasporto mitocondriale hanno usato kymogrammi, che sono rappresentazioni bidimensionali delle posizioni rispetto al tempo. Sono stati sviluppati diversi strumenti automatizzati per l'analisi del tracciamento delle particelle26,30,31,32,33,34. Questi possono separare con precisione ogni fotogramma. Oltre alla velocità e alla percentuale di motile che ImageJ può misurare, questo metodo può misurare con precisione gli eventi motile. Tuttavia, questi non sono liberi di utilizzare. Qui, l'analisi del trasporto mitocondriale è stata eseguita utilizzando ImageJ con i plugin "Multikymograph" e "Macros". Questi plugin possono misurare efficacemente il movimento mitocondriale. Il vantaggio di questi plugin è la loro facilità d'uso e la capacità di indicare alterazioni nel trasporto assonale mitocondriale sotto forma di kymografi e velocità nel tempo.
I mitocondri motile sono stati analizzati in SPG3A e neuroni di controllo. Una riduzione simile della percentuale di mitocondri motile è stata osservata utilizzando due diversi metodi di analisi, confermando l'utilità di ImageJ per analizzare il trasporto assonale. Inoltre, la morfologia mitocondriale può essere analizzata utilizzando lo stesso set di immagini, che fornisce importanti letture per studiare la disfunzione mitocondriale in varie malattie neurologiche. Poiché la degenerazione assonale e la disfunzione mitocondriale di solito si verificano durante le fasi precedenti, prima che i neuroni muoiano, questo metodo può essere utilizzato per esaminare i primi cambiamenti patologici per aiutare a identificare le vie molecolari e le terapie dello schermo per salvare Neurodegeneration.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Spastic Paraplegia, dalla Blazer Foundation e dal NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
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