Summary
受损的线粒体迁移和形态学涉及各种神经退行性疾病。提出的协议使用诱导多能干细胞衍生前脑神经元来评估线粒体迁移和遗传性痉挛性截瘫的形态。该协议允许沿斧子对线粒体贩运进行表征，并分析其形态，这将有助于神经退行性疾病的研究。
Abstract
神经元对高能量有强烈的需求，以支持其功能。在人类神经元中观察到沿着斧子的线粒体传输受损，这可能导致各种疾病状态的神经退化。虽然研究活人类神经中的线粒体动力学具有挑战性，但这种模式对于研究线粒体在神经退化中的作用至关重要。本文介绍一个协议，用于分析前脑神经元的线粒体迁移和线粒体形态学，该词从人类诱导多能干细胞（iPSCs）中提取。iPSCs 使用成熟的方法分化为端脑谷氨酸神经元。神经元的线粒体被MitoTracker CMXRos染色，并且使用装有细胞培养箱的活细胞成像显微镜捕获斧子内的线粒体运动。使用带有"多Kymograph"、"生物格式导入器"和"宏"插件的软件对延时图像进行分析。生成线粒体传输的线粒体图，并从测速仪中读取反逆向线粒体的平均线粒体速度。在线粒体形态分析方面，利用ImageJ获得线粒体长度、面积和纵横比。总之，该协议允许沿斧子对线粒体贩运进行表征，并分析其形态，以促进神经退行性疾病的研究。
Introduction
线粒体运动和分布在满足极化神经元的可变和专门能量需求方面发挥着至关重要的作用。神经元可以延长极长的斧子，通过形成突触与目标连接，而突触对Ca2+缓冲和电电流需要高水平的能量。线粒体从索马到斧子的传输对于支持神经元的斧突和突触功能至关重要。空间和时空动态线粒体运动是通过快速的辅助体传输以每秒几微米的速度进行。
具体来说，运动或适配器蛋白，如激酶和dynein，参与沿着微管的快速细胞器传输，以控制线粒体2，3的运动。正常的神经元活动需要将新组装的线粒体从神经元索马正确传输到远端斧子（异端等向等同体传输），并将线粒体从远端斧子反向运输回细胞体（逆向传输）。最近的研究表明，不正确的线粒体分配与神经元缺陷和运动神经元退行性疾病4，5密切相关。因此，要剖析线粒体在神经退化中的作用，必须建立研究活文化中沿斧突运动的线粒体运动的方法。
在检查和分析线粒体的跟踪时，有两个主要挑战：（1） 从每个帧的背景识别线粒体，（2） 分析和生成每个帧之间的连接。在解决第一个挑战时，广泛使用荧光标记方法区分线粒体与背景，如MitoTracker染料或荧光融合线粒体靶向蛋白（例如mito-GFP）6、7、8的转染。为了分析帧之间的关联，在前面的研究9中描述了几种算法和软件工具。在最近的一篇论文中，研究人员比较了四种不同的自动化工具（例如，沃洛蒂、伊马里斯、wrMTrck和差异跟踪器），以量化线粒体传输。结果表明，尽管轨道长度、线粒体位移、运动持续时间和速度存在差异，但这些自动化工具适用于治疗后的运输差异。除了这些工具，一个集成插件"宏"为ImageJ（由Rietdorf和Seitz编写）已广泛用于分析线粒体传输11。此方法生成可用于分析线粒体运动（包括逆向和逆行方向的速度）的图形。
线粒体是高度动态的细胞器，在数量和形态上不断变化，以响应生理和病理条件。线粒体裂变和融合严格调节线粒体形态和平衡。线粒体裂变和融合之间的不平衡可诱发极短或长线粒体网络，从而损害线粒体功能，导致神经元异常活动和神经退化。受损的线粒体传输和形态涉及各种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症和遗传性痉挛性截瘫（HSP）12、13、14、15。HSP是一个异质的遗传性神经系统疾病组，其特征是皮质脊柱退化，随后未能控制下肢肌肉16、17。在这项研究中，iPSC衍生前脑神经元用于评估HSP中的线粒体迁移和形态。该方法为检查活培养体中神经元斧子的线粒体动力学提供了独特的范例学范式。
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Protocol
1. 从iPSC生成端脑谷氨酸神经元
注：用于维护iPSC及其分化为端脑谷氨酸神经元的详细协议与前面描述的18相似。在这里，介绍并强调了人类多能干细胞分化过程中的关键过程。
- 人类胚胎干细胞（hESC）培养基细胞（MEF）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分供器的培养iPSC，辅以成纤维细胞生长因子（bFGF，4纳克/mL）。
- 用消炎（1mg/mL）孵育3分钟后，将iPSC分离成小团块。然后，在 hESC 介质中培养 iPSC 聚集的悬浮物 4 天。参考此时间点，当 iPSC 作为挂起区域性开始时，如第 1 天 （D1）。每天更换媒体4天。
- 在 D5 中，在 200 x g离心后收集 iPSC 聚集，2 分钟，在神经诱导介质 （NIM） 中培养 3 天。通过每2天更换一半的介质，使细胞聚集在悬浮状态中聚集3天。将 DMH-1 （2 μM） 和 SB431542 （2 μM） 添加到 NIM 介质中，以提高神经诱导效率。
- 在 D8，在离心 200 x g后收集 iPSC 骨料 2 分钟，并让他们粘附在 6 孔板（每孔约 20–30 个集料）上，在 NIM 中用 10% FBS（或与层压涂层板）在 NIM 中过夜。第二天，删除旧介质，每 2 天更改为 NIM，直到 D17。
注：在此期间观察到神经皮细胞的生成，该细胞由具有玫瑰花层结构的柱状细胞的形成所指示。 - 在D17，机械地分离菌落中心的神经皮间细胞（通过向菌落中心施加小压力直接解除）或酶（用去巴治疗）。将分离的神经皮质细胞转移到未处理的组织培养T25烧瓶中，其中含有8 mL的NIM，并加入B27（1x）、cAMP（1 μM）和IGF（10纳克/mL）。
注：悬浮培养允许细胞形成神经球，这些神经球富含皮质投影神经祖子。 - D35 后，在多球体和 LDEV 上将神经球板在无生长因子基底膜基质（材料表）上涂覆 35 mm 玻璃底盘，以生成端膜谷氨酸神经元（皮质投影神经元）。在电镀之前，在37°C下用1mg/mL细胞分离溶液孵育2分钟，将神经球分离为小簇。
- 通过离心去除细胞分离溶液，并在1 mL的神经分化介质（NDM）中重新悬浮。玻璃底盘上的板状细胞（每盘100μL的介质中约5个簇），以使它们附着。然后，添加NDM（每盘1毫升）并培养含有B27（1x）、cAMP（1μM）、IGF（10纳克/mL）、hBDNF（10纳克/mL）和GDNF（10纳克/mL）的NDM中的细胞。
注：小簇被镀，因为它们能很好地存活，并产生长投影神经元。或者，细胞可以分离和镀层，密度约为每盘20，000个细胞，以更好地分离。 - 通过免疫染色Tbr1和βIII-tubulin标记物来表征端脑谷氨酸神经元。
2. 沿端脑谷氨酸神经元的斧子线粒体迁移检查
- 预热 NDM 并打开荧光显微镜的培养箱，其设置为 37°C 和 5% CO2。
- 为了沿前脑神经元的斧头可视化线粒体，用50 nM红色荧光染料孵育神经元，在NDM中染色活细胞（例如MitoTracker CMXRos）中的线粒体3分钟，在37°C下。接下来，用加热的NDM清洗细胞2倍。神经元在NDM中孵育。
- 为了记录沿着斧突的线粒体传输，使用40x物镜使用荧光显微镜拍摄线粒体运动的延时图像。
注：为了稳定培养，当细胞在培养箱中孵育20分钟后线粒体染色时，进行活细胞成像。 - 在相位场下，根据形态特征（直接从神经元细胞体中出现，恒定的细长神经质，无分枝）识别斧头。线粒体在异位（从细胞体到远端斧子）和逆行方向（从斧尾端到细胞体）中移动。要区分沿着斧突的线粒体运动方向，请清楚地识别神经元的细胞体。在此步骤中，将斧头聚焦相位场以减少光漂白。
- 区分细胞体和斧子后，调整线粒体在斧子中的暴露时间和焦点。然后，每 5 秒捕获一次在斧内内传输线粒体的传输，总持续时间为 5 分钟，产生 60 帧。随机捕获每个菜至少五个位置，每组重复3倍。
3. 皮质神经元线粒体迁移和形态的数据分析
注：使用图像分析软件（例如ImageJ或MetaMorph19）分析收集的线粒体传输数据。由于ImageJ是现成的，使用图像J使用多Kymograph、宏和分析粒子插件来分析线粒体传输和形态学。
- 使用 ImageJ 分析线粒体传输
- 在捕获线粒体运动时间的延时图像后，使用多Kymograph插件分析线粒体的速度和运动。图像保存为 .tiff 格式文件，由斐济软件按照先前报告的方法20进行分析。
- 下载斐济软件。下载分析线粒体移动速度所需的插件。下载生物格式包和Kymograph插件以及这四个.class插件，包括：多Kymograph.class，多倍Overlay.class，Stackdifference.类，和步行平均类（材料表）。将这些文件移动到斐济插件文件夹。下载"tsp050706.txt"插件到插件文件夹。当文件移动到插件文件夹时，重新启动斐济软件。
- 打开斐济软件。选择插件，然后导入.tiff系列的图像，通过生物格式导入器下生物格式。请确保在堆栈查看中选择标准图像J，选择"打开所有系列"，选中"自动缩放"，然后单击"确定"。记下图像的帧数和大小（以像素为单位）显示在图像顶部。
注：每幅图像拍摄 60 帧。 - 考虑通过调整所有 60 帧的"图像"菜单下的亮度/对比度来使图像更清晰。
- 右键单击线工具以选择分段线，并绘制一条分段线，从像元体开始，到终端斧尾结束。通过在插件下选择多Kymograph来生成Kymograph。选择多Kymograph后，将提示选择线宽。确保这是一个奇数。为行宽选择1。此步骤后将生成图形。
注： 可以从图形中读取几条重要信息。kymograph 的 y 轴是 60 帧的持续时间 （5 分钟）。x 轴表示所选轴线的位置。 - 在测速仪中使用对角线确定线粒体的运动方向（反逆、逆行或稳定）。例如，沿 y 轴向右向下移动的线表示逆向移动，沿 y 轴向左向下的线表示逆行移动。垂直线表示线粒体中没有运动。
- 使用斐济软件中的宏插件测量移动线粒体的距离、时间值和速度。转到插件 |宏 |安装 |tsp050607.txt.在图形仪上的线粒体运动轨迹上绘制一条分段线，并始终绘制从上级到下级区域（y 轴）的线。
- 绘制线条后，转到插件|宏 |从 tsp 读取速度。由于沿跟踪绘制了分段线，因此插件读取与直线对应的分段速度。
注： 所有数据的单位是像素。dy 和是从起始点消耗的时间，dx 和表示在 x 轴中移动的线粒体的距离。dy 现在和dx 分别显示每个段的周期时间和移动距离。实际速度显示每个段的速度（现在/现在 dx）。平均速度表示线粒体移动的平均速度（dx 和/dy 和）。 - 通过测量刻度条，将dx的单位从像素更改为 μm，即像素（以 μm 为单位）的比例。通过测量图像中的刻度条，将像素到 μm 的距离单位转换为像素到μm。使用直线工具沿比例尺绘制一条线，并通过在"分析 "下选择"度量"来测量线的长度。在此实验中，将时间从像素更改为秒，为 1 像素 = 5 秒。
- 在电子表格文件中，计算平均速度并相应地标记逆行或逆行运动。平均逆行或逆行运动速度。
- 确定从kymograph的固定和活动线粒体的百分比。逆向或逆行移动线粒体被定义为在整个周期21期间从原点向前或向后移动5μm。线粒体在5分钟内移动不超过5μm，则被视为静止。
- 使用图像J线粒体形态分析
注：通过使用 ImageJ 测量线粒体长度、面积和纵横比，确定线粒体形态。为此，请按照以下步骤操作。- 为了分析线粒体长度和在斧内的区域，从ImageJ网站下载Straighten_.jar插件（见材料表），并将其移动到插件的文件夹。重新启动 ImageJ 软件。
- 通过"文件"下的打开函数打开图片，并使用"图像"下的"类型"将 32 位图像转换为 8 位。
- 沿斧子绘制一条分段线。在插件下选择"拉直"，并为"丝"/宽线宽度设置 50 像素。这将生成一个拉直的斧子。
- 在"图像"下调整阈值，并通过选择"区域|周边 |拟合椭圆 |形状描述符。
- 使用线函数测量比例尺，并通过填充像素的距离、知道距离和长度单位来设置"分析"下的比例。然后，选择"全局"以设置此比例设置。
- 使用"分析"下的"分析粒子"确定区域。提示参数为大小（像素^2） = 0.20=无穷大，循环 = 0.00=1.00，并显示 = 椭圆。选择显示结果。
注： 测量将生成多个线粒体形态参数的结果，包括面积、周长、长度（主要）、宽度（次要）和纵横比 （AR）。还列出了相应的线粒体编号。 - 使用线粒体数除以斧尾长度计算每个斧子 （μm） 的线粒体数。
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Representative Results
在这里，人类iPSCs被分化为端脑谷氨酸神经元，其特征是用Tbr1和βIII图布林标记进行免疫染色（图1A）。为了检查线粒体的同线体传输，这些细胞被红色荧光染料染色，并进行了延时成像。由于ImageJ是现成的，更容易获得，线粒体传输被进一步分析与"多Kymograph"和"宏"图像J插件，如图1所示。
线粒体运动有三种各自的状态，包括静态运动、逆行运动和逆行运动（图1B，C）。单个线粒体可以保持静态或沿逆向或逆行方向在斧子内移动，在这里，沿着线粒体运动轨迹绘制一条分段线来确定速度（图1D）。沿斧尾的线粒体运动速度如图1E所示，在 ImageJ 中的"宏"读取后，对应于图 1D中的分段线。与 MetaMorph 软件类似，ImageJ 可用于根据 ImageJ 生成的图形确定线粒体速度和移动线粒体的百分比（图 1F）。使用市售的分析软件（例如，MetaMorph），以前的数据表明，与正常神经元相比，SPG3A神经元中移动线粒体的百分比显著降低，而速度没有改变19。为了评估ImageJ软件，检查了运动线粒体的百分比，并观察到SPG3A神经元中运动线粒体与控制野生型（WT）神经元的百分比相似（图1G）。
在线粒体形态分析方面，利用ImageJ中的"分析粒子"函数对线粒体面积、长度和AR进行了分析。使用"直"插件（图2A，B）拉直了斧子。线粒体是通过调整阈值来明确选择的（图2C，D）。最后，使用"分析粒子"插件（图2E，F）从拉直的斧子获得线粒体面积、长度（主要）、宽度（次要）、纵横比和周长。异常线粒体形态学在HSP iPSC衍生的端粒体神经中观察到（以前已经观察到），包括SPG15细胞（图2G，H，I）13、22。与控制WT神经元斧子相比，SPG15神经元斧子的线粒体长度和纵横比均显著降低（图2G，H，I）。
图1：使用ImageJ分析线粒体传输。（A） 免疫染色显示端脑谷氨酸神经元的生成.Tbr1（红色）、+III 图布林（绿色）和霍奇斯特（蓝色）。刻度条 = 50 μm。这个数字是从先前的研究19中修改的。（B） 神经元的斧子内的线粒体传输.安特罗级线粒体运动被定义为线粒体从细胞体移动到远端斧突，逆行线粒体运动起源于远端斧突并延伸到神经元细胞体。段线沿从神经元细胞体到远端斧道端的斧子绘制，以生成图形。（C） Kymograph 使用 ImageJ 生成;x 轴是轴线位置，y 轴是时间轴。一条连续的白线是线粒体以逆向方向（粉红色箭头）、逆行方向（蓝色箭头）或静态状态（黄色箭头）移动。（D） 使用宏插件绘制分段线来读取速度。数字 1_8 描述线路的段。安特罗级运动（1⁄4，6，8）和静态状态（5，7）可以区分这种放大的图形。（E） 每个段的时间和移动距离、实际速度和平均速度（以像素为单位）。（F） 使用 ImageJ 为 WT 和 SPG3A 皮质 PN 进行线粒体传输的测光仪。使用 ImageJ （_p < 0.05）在 WT 和 SPG3A 皮质 PN 中，缩放条 = 10 μm.（G） 斜线粒体比。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：使用ImageJ分析线粒体形态。（A） 用于拉直斧子的参数.（B） 代表拉直了斧子.（C，D）调整阈值以选择线粒体。（E，F）测量的线粒体面积、周长、长度（主要）、宽度（次要）和纵横比 （AR） 对应于 （E） 中所选线粒体。（G） WT 和 SPG15 端脑谷氨酸神经元中的线粒体代表性图片。在 WT 和 SPG15 神经元中，刻度条 = 20 μm （H） 线粒体长度。（I） WT 和 SPG15 神经元中线粒体的纵横比。•p < 0.01 vs。WT. （G）、（H）和（I）从以前的研究13中进行了修改。请点击此处查看此图的较大版本。
| 荧光工具 | 优势 | 缺点 | 引用 |
| 米托跟踪 | MitoTracker与线粒体电位无关，可用于分析线粒体与自噬体或衣索体的共定位。 | MitoTracker光稳定性不足以用于长期研究。 | 35 |
| 新人民军-TPP | 这种染料是一种新型的光稳定线粒体标记试剂。 | 这种染料的合成和纯化过程既费时又昂贵。 | 23 |
| 米托巴迪 | 这种染料可用于线粒体可视化使用拉曼显微镜高灵敏度和特异性。 | 使用这种染料需要拉曼显微镜。 | 25 |
| TMRE | 该染料是一种无毒、特异性线粒体染色剂，浓度低，无淬火效果。 | TMRE 标记线粒体取决于线粒体膜电位。 | 36, 37 |
| 线粒体靶向荧光蛋白 | 线粒体靶向荧光蛋白更特异性和稳定。 | 该方法需要转染，不同细胞类型转染效率不同。 | 38, 39 |
表1：一些荧光工具用于线粒体标记的优缺点。
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Discussion
本文介绍了一种利用红色荧光染料和ImageJ软件分析神经元斧子线粒体迁移和形态的方法，为神经退行性疾病的斧子退化和线粒体形态学研究提供了独特的平台。该协议中有几个关键步骤，包括线粒体的染色、活细胞成像和分析图像。在这种方法中，使用荧光染料染色线粒体。由于人类iPSC衍生的神经元很容易从培养皿中分离，因此在培养皿中保留一些溶液并轻轻添加神经基质介质非常重要。洗涤可以进行三或四次，以去除染料。此外，线粒体可以与其他记者一起标记，以测量其沿斧头的传输，如荧光蛋白融合线粒体靶向蛋白质6。在长期跟踪中，若干探头（即NPA-TPP、2，1，3-苯二氮二氮二氮（BTD）荧光衍生物和特定的拉曼探针）在长期线粒体跟踪和线粒体动力学分析23、24、25中显示出巨大潜力。各种探头的优点和缺点见表1。
线粒体染色后，使用装有培养箱的显微镜进行活细胞成像。为了在成像过程中有效地聚焦神经元，神经样本应保存在含有 5% CO2的 37°C 培养箱中，并在潮湿环境中保存至少 15 分钟。为了最小化失焦效果，可以采取不同 Z 位置的图像来制作 Z 堆栈，或者使用自动对焦功能。重要的是，为了识别线粒体传输的方向（反逆体或逆行），采取相位图像来区分神经元细胞体和斧子。另一个关键问题是荧光样品的光漂白，必须防止荧光样品的光漂白，以获得有效的线粒体传输延时图像。最小化光漂白的有效方法是将样品聚焦在目镜中，并将所有成像参数设置为相位通道下，曝光时间除外。此外，自动缩放模式可以减少荧光的光漂白。
线粒体是高度动态的细胞器，可以同时移动逆向和逆行方向。在神经元中，在记录过程中，斧子内的几线粒体保持静止。在移动线粒体中，运动状态可能随时间而变化。这种现象提出了一个重要问题，即线粒体类型被认为是静止的或移动的。这可以通过在线粒体等位分析期间设置阈值来解决。为了区分静态线粒体，Neumann等人使用线粒体轨迹中心，该中心被定义为其位置坐标随时间的平均值，然后将阈值设置为350nm/s，以便线粒体与其轨道中心的最大偏差距离位于第26帧中。在另一项研究中，作者将50nm/s设置为阈值，以区分静止状态和移动状态27。这里使用300nm/s阈值来区分基于微管的传输，如前几份报告28、29所述。虽然固定线粒体和移动线粒体的阈值不同，但设置阈值可以提供野生型神经元和退行神经元之间异构体运动的重要相关信息。
大多数涉及线粒体传输分析的协议都使用了kymogram，这是位置与时间的二维表示。已开发多个自动化工具，用于分析粒子跟踪26，30，31，32，33，34。这些可以准确地分隔每个帧。除了 ImageJ 可以测量的速度和移动百分比外，此方法还可以精确测量移动量事件。但是，这些不能自由使用。在这里，线粒体传输的分析是使用ImageJ与"多基图"和"宏"插件。这些插件可以有效地测量线粒体运动。这些插件的优点是它们的易用性和能够指示线粒体等向线体传输的变化，形式为kymograph和速度随着时间的推移。
在SPG3A和控制神经元中分析了线粒体。使用两种不同的分析方法观察到了活动线粒体百分比的类似减少，证实了ImageJ对分析异体传输的有用性。此外，线粒体形态学可以用同一组图像进行分析，为研究各种神经系统疾病的线粒体功能障碍提供了重要的读法。由于斧头退化和线粒体功能障碍通常发生在神经元死亡之前的早期阶段，因此此方法可用于检查早期病理变化，以帮助识别分子途径和屏幕治疗以挽救神经退化。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了痉挛性截瘫基金会、布雷泽基金会和NIH（R21NS109837）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
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