Summary
Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.
Abstract
Neuronen hebben intense eisen aan hoge energie om hun functies te ondersteunen. Verminderde mitochondriale vervoer langs axonen is waargenomen in menselijke neuronen, die kunnen bijdragen aan neurodegeneratie in verschillende ziektestaten. Hoewel het een uitdaging is om mitochondriale dynamiek in levende menselijke zenuwen te onderzoeken, zijn dergelijke paradigma's van cruciaal belang voor het bestuderen van de rol van mitochondriën in neurodegeneratie. Hier beschreven is een protocol voor het analyseren van mitochondrial eologie en mitochondriale morfologie in voorhersenen neuron axonen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De iPSCs worden gedifferentieerd in telencephalische glutamateren met behulp van gevestigde methoden. Mitochondriën van de neuronen zijn bevlekt met MitoTracker CMXRos, en mitochondriale beweging binnen de axonen worden vastgelegd met behulp van een live-cell imaging microscoop uitgerust met een incubator voor celcultuur. Time-lapse beelden worden geanalyseerd met behulp van software met "MultiKymograph", "Bioformat importeur", en "Macros" plugins. Kymografen van mitochondriaal transport worden gegenereerd, en de gemiddelde mitochondriale snelheid in de anterograde en retrograde richtingen wordt gelezen uit de kymograaf. Met betrekking tot mitochondriale morfologie analyse, mitochondriale lengte, gebied, en aspect ratio worden verkregen met behulp van de ImageJ. Samengevat, dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk om studies van neurodegeneratieve ziekten te vergemakkelijken.
Introduction
Mitochondriale beweeglijkheid en distributie spelen een cruciale rol bij het vervullen van variabele en gespecialiseerde energetische eisen in gepolariseerde neuronen. Neuronen kunnen extreem lange axonen uitbreiden om verbinding te maken met doelen door de vorming van synapsen, die hoge niveaus van energie vragen voor Ca2 + buffering en ionenstromen. Transport van mitochondriën van soma naar axon is van cruciaal belang voor de ondersteuning van axonale en synaptische functie van neuronen. Ruimtelijk en tijdelijk dynamische mitochondriale beweging wordt uitgevoerd door snel axonal transport met snelheden van enkele micrometers per seconde1.
Met name motor- of adaptoreiwitten, zoals kinesin ede en dynein, nemen deel aan het snelle organelletransport langs microtubuli om de beweging van mitochondriën2,3te controleren. Normale neuronale activiteit vereist een goed transport van nieuw geassembleerde mitochondriën van neuronaal soma tot distale axon (anterograde axonal transport) en omgekeerd transport van mitochondriën van de distale axon terug naar het cellichaam (retrograde transport). Recente studies hebben aangetoond dat onjuiste mitochondriale toewijzing sterk geassocieerd is met neuronale defecten en motorneuron degeneratieve ziekten4,5. Daarom, om de rol van mitochondriën in neurodegeneratie te ontleden, is het belangrijk om methoden vast te stellen voor het onderzoeken van mitochondriale beweging langs axonen in levende culturen.
Er zijn twee belangrijke uitdagingen bij het onderzoeken en analyseren van het volgen van mitochondriën: (1) het identificeren van mitochondriën vanaf de achtergrond in elk frame, en (2) het analyseren en genereren van de verbindingen tussen elk frame. Bij het oplossen van de eerste uitdaging wordt een fluorescentieetiketteringsbenadering op grote schaal gebruikt om mitochondriën van de achtergrond te onderscheiden, zoals MitoTracker-kleurstof of transfection van met fluorescentie gefuseerd mitochondriaal doeleiwit (bijvoorbeeld mito-GFP)6,7,8. Om de associatie tussen frames te analyseren, zijn verschillende algoritmen en softwaretools beschreven in eerdere studies9. In een recent artikel vergeleken onderzoekers vier verschillende geautomatiseerde tools (bijvoorbeeld Volocity, Imaris, wrMTrck en Difference Tracker) om mitochondriaal transport te kwantificeren. De resultaten toonden aan dat ondanks verschillen in spoorlengte, mitochondriale verplaatsing, bewegingsduur en snelheid, deze geautomatiseerde instrumenten geschikt zijn voor het evalueren van het verschil in transport na behandeling10. Naast deze tools, een geïntegreerde plugin "Macro's" voor ImageJ (geschreven door Rietdorf en Seitz) is op grote schaal gebruikt voor het analyseren van mitochondriaal vervoer11. Deze methode genereert kymografen die kunnen worden gebruikt om mitochondriale beweging te analyseren, inclusief snelheid in zowel anterograde en retrograde richtingen.
Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen die voortdurend veranderen in aantal en morfologie in reactie op zowel fysiologische als pathologische aandoeningen. Mitochondriale splitsing en fusie regelen de mitochondriale morfologie en homeostase strak. De onbalans tussen mitochondriale splitsing en fusie kan leiden tot extreem korte of lange mitochondriale netwerken, die de mitochondriale functie kunnen schaden en kunnen resulteren in abnormale neuronale activiteiten en neurodegeneratie. Verminderde mitochondriale transport en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington, en erfelijke spastische dwarslaesie (HSP)12,13,14,15. HSP is een heterogene groep van erfelijke neurologische aandoeningen gekenmerkt door de degeneratie van het corticospinale kanaal en het daaropvolgende falen om de onderste ledematen spieren te controleren16,17. In deze studie worden iPSC-afgeleide voorhersenenneuronen gebruikt om mitochondriaal transport en morfologie in HSP te beoordelen. Deze methode biedt een uniek paradigma voor het onderzoeken van mitochondriale dynamiek van neuronale axonen in levende culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van telencephalische glutamateren van iPSC's
OPMERKING: Het gedetailleerde protocol voor het handhaven van iPSCs en hun differentiatie in telencephalische glutamatergic neuronen zijn vergelijkbaar met die eerder beschreven18. Hier wordt het kritieke proces tijdens de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen geïntroduceerd en benadrukt.
- KweekiPSCs op muis embryonale fibroblast (MEF) feeders in menselijke embryonale stamcel (hESC) medium aangevuld met fibroblast groeifactor (bFGF, 4 ng/mL).
- Na incubatie met dispase (1 mg/mL) gedurende 3 min, scheiden de iPSCs in kleine klonten. Dan, cultuur van de iPSC aggregaten in schorsing in het hESC medium voor 4 dagen. Raadpleeg dit tijdsbestek, wanneer de iPSCs beginnen als de schorsingscultuur, als dag 1 (D1). Verander het medium dagelijks gedurende 4 dagen.
- Verzamel bij D5 de iPSC aggregaten na centrifugeren op 200 x g voor 2 min en cultuur in neurale inductiemedia (NIM) gedurende 3 dagen. Cultuur de cel aggregaten in schorsing voor 3 dagen door het veranderen van de helft van de media om de 2 dagen. Voeg DMH-1 (2 μM) en SB431542 (2 μM) toe aan HET NIM-medium om de neurale inductie-efficiëntie te verhogen.
- Bij D8, verzamel de iPSC aggregaten na centrifugeren op 200 x g voor 2 min en laat ze zich hechten aan 6 putplaten (ongeveer 20-30 aggregaten per put van de plaat) door 's nachts in NIM te kweken met 10% FBS (of met laminingecoate platen). Op de volgende dag, verwijder het oude medium en veranderen naar NIM om de 2 dagen tot D17.
OPMERKING: De generatie van neuroepitheelcellen, die wordt aangegeven door de vorming van zuilcellen met rozetstructuren, wordt in deze periode waargenomen. - Bij D17, mechanisch isoleren van de neuroepitheelcellen in het centrum van kolonies (het opheffen van direct door het toepassen van een kleine druk op het centrum van de kolonies) of enzymatisch (behandeld met dispase). Breng de geïsoleerde neuroepitheelcellen over naar niet-behandelde weefselkweek T25-kolf met 8 mL NIM met toevoeging van B27 (1x), cAMP (1 μM) en IGF (10 ng/mL).
OPMERKING: De suspensiecultuur laat cellen toe om neurosferen te vormen die met corticale projectie neurale voorlopers worden verrijkt. - Na D35, plaat de neurosferen op de poly-ornithine en LDEV-vrije verminderde groeifactor kelder membraan matrix(Table of Materials)-gecoate 35 mm glazen bodem schotels om telencephalic glutamatergic neuronen (corticale projectie neuronen) te genereren. Voor het platen, scheiden van de neurosferen naar kleine clusters door te broeden met 1 mg/mL cel loslating oplossing voor 2 min bij 37 °C.
- Verwijder de celloslatingsoplossing door centrifugeren en opnieuw opschorten in 1 mL van neuraal differentiatiemedium (NDM). Plaatcellen op de glazen bodemschaal (ongeveer vijf clusters in 100 μL medium per schotel) om ze te laten hechten. Voeg vervolgens NDM (1 mL per schotel) toe en kweek de cellen in NDM met B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) en GDNF (10 ng/mL).
OPMERKING: Kleine clusters zijn verguld omdat ze goed overleven en aanleiding geven tot lange projectieneuronen. Als alternatief kunnen cellen worden gescheiden en verguld met een dichtheid rond de 20.000 cellen per schotel voor een betere scheiding. - Karaktereer de telencephalische glutamateren door immunostaining de Tbr1 en βIII-tubulin markers.
2. Onderzoek van mitochondriaal transport langs axonen van telencephalische glutamaterende neuronen
- Warm de NDM op en zet de couveuse aan voor de fluorescentiemicroscoop op 37 °C en 5% CO2.
- Om mitochondriën langs de axonen van voorhersenenneuronen te visualiseren, incubeer de neuronen met 50 nM rode fluorescerende kleurstof om mitochondriën in levende cellen (b.v., MitoTracker CMXRos) in NDM voor 3 min bij 37 °C te bevlekken. Was vervolgens cellen 2x met opgewarmdndm. De neuronen zijn geïncubeerd in NDM.
- Om het mitochondriale transport langs de axonen vast te leggen, neem time-lapse beelden van mitochondriale beweging met behulp van de 40x doelstelling met een fluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: Om de cultuur te stabiliseren, voert u de live celbeeldvorming uit wanneer de cellen gedurende 20 min na mitochondriale vlekken in de couveuse worden geïncubeerd. - Identificeer onder faseveld de axonen op basis van morfologische kenmerken (kom direct voort uit neuronale cellichaam, constante dunne lange neurites zonder vertakking). Mitochondriën bewegen in anterograde (van cellichaam naar distale axon) en retrograde richtingen (van axonalterminal naar cellichaam). Om de richting van mitochondriale beweging langs axonen te onderscheiden, duidelijk identificeren van de cellichamen van neuronen. In deze stap, focus axonen in fase veld om fotobleken te verminderen.
- Na het onderscheiden van het cellichaam en de axon, pas u de belichtingstijd en focus van mitochondriën in axonen aan. Leg vervolgens het transport van mitochondriën in axonen om de 5 s vast gedurende een totale duur van 5 minuten, wat 60 frames oplevert. Plaats willekeurig ten minste vijf locaties voor elk gerecht vast en herhaal 3x voor elke groep.
3. Data-analyse van mitochondriaal transport en morfologie in corticale neuronen
OPMERKING: Analyseer de verzamelde gegevens over mitochondriaal transport met behulp van een beeldanalysesoftware (bijvoorbeeld ImageJ of MetaMorph19). Aangezien ImageJ direct beschikbaar is, voert u de analyse uit van mitochondriaal transport en morfologie met ImageJ met de MultiKymograph, Macro'sen analyseerdeeltjesplug-ins.
- Mitochondrial transport analyseren met ImageJ
- Na het vastleggen van de time-lapse beelden van mitochondriale beweeglijkheid, analyseer de snelheid en beweging van mitochondriën met behulp van de MultiKymograph plugin. De afbeeldingen worden opgeslagen als .tiff-indelingsbestanden, die worden geanalyseerd door Fiji-software volgens een eerder gerapporteerde methode20.
- Download de Fiji-software. Download plugins die nodig zijn voor het analyseren van mitochondriale bewegende snelheid van kymografen. Download de Bio-formats Package en Kymograph Plugin samen met deze vier .class plugins, waaronder: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class en WalkingAverage.class (Tabel met materialen). Verplaats deze bestanden naar de map Fiji-plug-ins. Download "tsp050706.txt" plugins naar de plugins map. Start de Fiji-software opnieuw wanneer de bestanden naar de map plug-ins worden verplaatst.
- Open Fiji software. Kies plug-ins,importeer vervolgens afbeeldingen van de .tiff-serie via Bio-Formats Importer onder Bio-Formats. Zorg ervoor dat u Standard ImageJ kiest in Stack-weergave,kies Alle reeksen openen,schakel Autoschaal inen klik op OK. Let op het framenummer en de grootte van afbeeldingen in pixels, die boven aan de afbeelding worden weergegeven.
OPMERKING: Neem 60 frames per afbeelding. - Overweeg om de afbeeldingen duidelijker te maken door de helderheid/contrast onder het menu Afbeelding aan te passen voor alle 60 frames.
- Klik met de rechtermuisknop op het lijngereedschap om gesegmenteerde lijn te kiezen en een gesegmenteerde lijn te tekenen vanaf de celbehuizing en eindigend bij de terminalaxon. Genereer de kymograaf door multiplekymograph te kiezen onder plugins. De selectie van de lijnbreedte wordt gevraagd na het kiezen van de MultipleKymograph. Zorg ervoor dat dit een oneven getal is. Kies 1 voor de lijnbreedte. Na deze stap wordt een kymograaf gegenereerd.
OPMERKING: Verschillende belangrijke stukjes informatie kunnen worden gelezen uit de kymograph. De y-as van kymograaf is de duur (5 min) voor de 60 frames. De x-as vertegenwoordigt de positie van de geselecteerde axonen. - Gebruik een diagonale lijn in de kymograaf om de bewegingsrichting van mitochondriën te bepalen (anterograde, retrograde of stabiel). Een lijn die naar rechts gaat langs de y-as geeft bijvoorbeeld anterogradebeweging aan en een lijn die naar links langs de y-as gaat, duidt op retrograde beweging. Een verticale lijn geeft aan dat er geen beweging was in de mitochondrion.
- Meet de afstand, tijdwaarden en snelheid voor de bewegende mitochondriën met behulp van de Macros plugin in Fiji-software. Ga naar Plugins | Macro's | Installatie | tsp050607.txt. Teken een gesegmenteerde lijn over het spoor van mitochondriale beweging op de kymograaf, en trek altijd de lijn van de superieure naar inferieure regio (y-as).
- Na het tekenen van de lijn, ga naar Plugins | Macro's | lees snelheden van tsp. Aangezien een gesegmenteerde lijn langs het spoor wordt getrokken, leest de plugin gesegmenteerde snelheden die overeenkomen met de lijn.
OPMERKING: Het apparaat voor alle gegevens is pixels. dy som is de tijd die vanaf het beginpunt wordt verbruikt, en dx som geeft de afstand aan van de mitochondrion die zich in de x-as beweegt. dy now en dx toont nu de periode tijd en beweging afstand voor elk segment, respectievelijk. werkelijke snelheid toont de snelheid voor elk segment (dx nu / dy nu). gemiddelde snelheid geeft de gemiddelde snelheid voor de mitochondriale bewegende (dx som / dy som). - Verander de eenheid van dx nu van pixel naar μm als de verhouding van pixel in μm door de schaalbalk te meten. Converteer het apparaat voor afstand van pixel naar μm door schaalbalken in afbeeldingen te meten. Gebruik het lijngereedschap om een lijn langs de schaalbalk te tekenen en de lengte van de lijn te meten door Meten te kiezen onder 'Analyseren. Wijzig de tijd van pixel in seconden, als 1 pixel = 5 seconden in dit experiment.
- Bereken in het spreadsheetbestand de gemiddelde snelheid en label dienovereenkomstig retrograde of anterogradebeweging. Gemiddelde van de anterograde of retrograde beweging snelheid.
- Bepaal het percentage stationaire en motile mitochondriën uit de kymograaf. De anterograde of retrograde bewegende mitochondriën worden gedefinieerd als het bewegen van 5 μm vooruit of achteruit van de oorsprong gedurende de gehele periode21. Mitochondriën worden als stationair beschouwd als ze niet meer dan 5 μm hebben verplaatst tijdens de 5 min.
- Analyse van mitochondriale morfologie met ImageJ
OPMERKING: Bepaal mitochondriale morfologie door mitochondriale lengte, gebied en beeldverhouding te meten met ImageJ. Volg hiervoor de onderstaande stappen.- Om de mitochondriale lengte en het gebied binnen axonen te analyseren, download t.v. de Straighten_.jar plugin van imagej website (zie Tabel met materialen)en verplaats deze naar de map met plug-ins. Start ImageJ-software opnieuw.
- Open de afbeelding via de open functie onder Bestand en converteer de afbeelding met 32 bits naar 8-bits met Tekst onder Afbeelding.
- Teken een gesegmenteerde lijn langs de axonen. Kies Straighten onder Plug-ins en stel 50 pixels in voor Breedte van Filament/Wide Line. Dit zal een rechtgetrokken axon genereren.
- De drempelwaarde onder Afbeelding aanpassen en de meting instellen onder Analyseren door "Gebied | Omtrek | Fit ellips | Vormbeschrijvingen.
- Meet de schaalbalk met behulp van de lijnfunctie en stel de schaal in onder Analyseren door de afstand in pixel, de lengte van de lengtete vullen . Kies vervolgens Globaal om deze schaalinstelling in te stellen.
- Gebruik Deeltjes analyseren onder Analyseren om het gebied te bepalen. De promptparameters zijn grootte (pixel^2) = 0,20-oneindigheid, circulariteit = 0,00–1,00 en tonen = ellipsen. Kies Weergaveresultaten.
OPMERKING: De meting levert de resultaten op van meerdere mitochondriale morfologieparameters, waaronder gebied, omtrek, lengte (groot), breedte (minor) en beeldverhouding (AR). Het overeenkomstige mitochondriale getal wordt ook vermeld. - Bereken het mitochondriale getal per axon (μm) met behulp van het mitochondriale getal gedeeld door axonale lengte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier werden menselijke iPSC's gedifferentieerd in telencephalische glutamaterende neuronen, die werden gekenmerkt door immunostaining met Tbr1 en βIII tubulin markers(figuur 1A). Om het axonal transport van mitochondriën te onderzoeken, werden deze cellen bevlekt met rode fluorescerende kleurstof, en time-lapse beeldvorming werd uitgevoerd. Aangezien ImageJ is direct beschikbaar en gemakkelijker te verkrijgen, mitochondriaal vervoer werd verder geanalyseerd met de "MultiKymograph" en "Macros" ImageJ plugins, weergegeven in figuur 1.
Er zijn drie respectieve toestanden van mitochondriale beweging, waaronder statische, anterograde, en retrograde beweging(Figuur 1B,C). Een enkele mitochondrion kan statisch blijven of bewegen in anterograde of retrograde richting binnen een axon, en hier, een gesegmenteerde lijn werd getrokken langs het spoor van mitochondriale beweging om de snelheid te bepalen (Figuur 1D). De snelheid van de mitochondriale beweging langs de axon wordt weergegeven in figuur 1E en komt overeen met de gesegmenteerde lijnen in figuur 1D na lezing door "Macro's" in ImageJ. Net als bij de MetaMorph-software kan ImageJ worden gebruikt om de mitochondriale snelheid en het percentage motile mitochondriën te bepalen op basis van de kymograaf gegenereerd door ImageJ (Figuur 1F). Met behulp van commercieel beschikbare analysesoftware (bijvoorbeeld MetaMorph) toonden eerdere gegevens aan dat het percentage motile mitochondriën aanzienlijk was verminderd in SPG3A-neuronen in vergelijking met normale neuronen, terwijl de snelheid niet werd gewijzigd19. Om de ImageJ-software te evalueren, werd het percentage motile mitochondriën onderzocht en werd een vergelijkbare vermindering van het percentage motile mitochondriën in SPG3A-neuronen waargenomen in vergelijking met de controle van wild-type (WT) neuronen (Figuur 1G).
Met betrekking tot de analyse van mitochondriale morfologie, het mitochondriale gebied, lengte, en AR werden geanalyseerd met behulp van de "analyseren deeltjes" functie in ImageJ. Axonen werden rechtgetrokken met behulp van de "rechttang" plugin (Figuur 2A,B). Mitochondriën werden duidelijk gekozen door de drempel aan te passen (figuur 2C,D). Ten slotte werden de mitochondriale gebied, lengte (major), breedte (mineur), aspect ratio, en perimeter verkregen uit de rechtgetrokken axon met behulp van de "Analyseer deeltjes" plugin (Figuur 2E, F). Abnormale mitochondriale morfologie werd (en is eerder waargenomen) in HSP iPSC-afgeleide telencephalische glutamateren, waaronder SPG15-cellen(figuur 2G,H,I)13,22. Zowel de mitochondriale lengte en aspect ratio werden aanzienlijk verminderd in SPG15 neuron axonen in vergelijking met controle WT neuron axonen(Figuur 2G,H,I).
Figuur 1: Analyse van mitochondriaal transport met ImageJ. (A) Immunostaining met de generatie van telencephalische glutamaterende neuronen. Tbr1 (rood), βIII tubulin (groen) en Hoechst (blauw). Schaalbalken = 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere studie19. (B) Mitochondrial transport binnen axonen van neuronen. Anterograde mitochondriale beweging wordt gedefinieerd als de mitochondriën bewegen van het cellichaam naar distale axon, en retrograde mitochondriale beweging is afkomstig van de distale axon en strekt zich uit tot het neuronale cellichaam. De segmentlijn wordt langs axonen getrokken van neuronalcellichaam aan distale axonalterminal om kymographs te produceren. (C) Kymograaf wordt gegenereerd met ImageJ; x-as is de axonale positie en y-as is tijd. Een continue witte lijn is de mitochondrion bewegen in anterograde richting (roze pijlpunt), retrograde richting (blauwe pijlpunt), of statische toestand (gele pijlpunt). (D) De gesegmenteerde lijn wordt getrokken om de snelheid te lezen met behulp van de Macros plugin. De nummers 1–8 beschrijven het segment van de lijn. Anterograde beweging (1–4, 6, 8) en statische toestand (5, 7) kunnen worden onderscheiden van deze vergrote kymograaf. (E) Tijd en bewegende afstand voor elk segment, werkelijke en gemiddelde snelheid (in pixels). (F) Kymograaf van mitochondriaal vervoer voor WT en SPG3A corticale PNs met behulp van ImageJ. Schaalbalk = 10 μm. (G) Motile mitochondriale verhouding in WT en SPG3A corticale PNs met ImageJ (*p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Mitochondriale morfologie analyseren met ImageJ. (A) Parameters voor het rechttrekken van de axon. b) De vertegenwoordiger heeft de axon rechtgetrokken. c,d) Aanpassing van de drempel om mitochondriën te kiezen. (E,F) Het gemeten mitochondriale gebied, omtrek, lengte (groot), breedte (minor) en beeldverhouding (AR) die overeenkomen met de geselecteerde mitochondriën in (E). (G) Representatieve foto's van mitochondriën in WT en SPG15 telencefalische glutamatergic neuronen. Schaalrepen = 20 μm. (H) Mitochondriale lengte in WT- en SPG15-neuronen. (I) Aspect ratio van mitochondriën in WT en SPG15 neuronen. **p < 0,01 vs. WT. (G), (H) en (I) zijn gewijzigd uit een eerdere studie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Fluorescerende tools | Voordelen | Nadelen | Verwijzingen |
| MitoTracker MitoTracker | MitoTracker is mitochondrial potentieel-onafhankelijk en kan worden gebruikt om de colokalisatie van mitochondriën te analyseren met autophagosoom of lysososoom. | MitoTracker is niet fototabel genoeg voor onderzoek op lange termijn. | 35 |
| NPA-TPP NPA-TPP | Deze kleurstof is een nieuwe fototabel mitochondriaal labelen reagens. | Het synthese- en zuiveringsproces van deze kleurstof is tijdrovend en kostbaar. | 23 |
| MitoBADY MitoBADY | Deze kleurstof kan worden gebruikt voor mitochondriale visualisatie met behulp van Raman microscopie met hoge gevoeligheid en specificiteit. | Met behulp van deze kleurstof vereist Raman microscoop. | 25 |
| TMRE TMRE | Deze kleurstof is een niet-toxische, specifieke mitochondriale kleuring kleurstof met een lage concentratie en geen bluseffect. | TMRE labelen mitochondriën is afhankelijk van de mitochondriale membraan potentieel. | 36, 37 |
| Mitochondriën gerichte fluorescerende eiwitten | Mitochondriën-gerichte fluorescerende eiwitten zijn specifieker en stabieler. | Deze methode moet transfection en transfection efficiëntie is verschillend voor verschillende celtypen. | 38, 39 |
Tabel 1: Voor- en nadelen van sommige fluorescerende gereedschappen voor mitochondriale etikettering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode om mitochondrial eerherstel en morfologie in neuronale axonen te analyseren met behulp van rode fluorescerende kleurstof en ImageJ-software, die beide een uniek platform bieden om axonale degeneratie en mitochondriale morfologie bij neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol, waaronder vlekken van mitochondriën, live celbeeldvorming en het analyseren van de beelden. In deze methode werd een fluorescerende kleurstof gebruikt om mitochondriën te bevlekken. Aangezien menselijke iPSC-afgeleide neuronen gemakkelijk los komen van de schotel, is het belangrijk om een oplossing in de schotel achter te laten en voorzichtig neurobasaal medium toe te voegen. Het wassen kan drie of vier keer worden uitgevoerd om de kleurstof te verwijderen. Bovendien kunnen mitochondriën worden gelabeld met andere verslaggevers om hun transport langs axonen te meten, zoals fluorescerende eiwit gesmolten mitochondriën gericht eiwitten6. Bij het volgen op lange termijn toonden verschillende sondes (d.w.z. NPA-TPP, 2,1,3-benzothiadiazole [BTD] fluorescerende derivaten en een specifieke Raman-sonde) een groot potentieel in langdurige mitochondriale tracking en mitochondriale dynamicaanalyse23,24,25. De voor- en nadelen van verschillende sondes zijn terug te vinden in tabel 1.
Na mitochondriale vlekken wordt live celbeeldvorming uitgevoerd met behulp van een microscoop die is uitgerust met een incubator. Om de neuronen effectief te concentreren tijdens beeldvorming, moeten neurale monsters worden bewaard in de 37 °C incubator met 5% CO2 en in een vochtige omgeving gedurende ten minste 15 min. Om de out-of-focus-effecten te minimaliseren, kunnen afbeeldingen op verschillende Z-posities worden gemaakt om een Z-stack te maken, of kan de autofocusfunctie worden gebruikt. Belangrijk is dat om de richting van mitochondriaal transport (anterograde of retrograde) te identificeren, fasebeelden worden genomen om het neuronale cellichaam en axonen te onderscheiden. Een ander belangrijk probleem is het photobleaching van fluorescerende monsters, die moeten worden voorkomen om efficiënte mitochondriale transport time-lapse beelden te verkrijgen. Een effectieve methode om fotobleken te minimaliseren is om monsters scherp te stellen door het oculair en stel alle imaging parameters onder het fasekanaal, met uitzondering van belichtingstijd. Bovendien kan het automatische schalingspatroon het bleken van foto's van fluorescentie verminderen.
Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen en kunnen bewegen in zowel anterograde en retrograde richtingen. In neuronen, een paar mitochondriën binnen axonen blijven stationair tijdens de opname. Onder de bewegende mitochondriën, beweging status kan variëren in de tijd. Dit fenomeen roept de belangrijke vraag op welk mitochondriaal type als stationair of bewegend wordt beschouwd. Dit kan worden opgelost door de drempel in te stellen tijdens mitochondriale axonale transportanalyse. Om de statische mitochondriën te onderscheiden, gebruikten Neumann et al. het mitochondriale spoorcentrum, dat in de loop van de tijd wordt gedefinieerd als het gemiddelde van zijn positiecoördinaten, en stelde vervolgens de drempel in op 350 nm/s, zodat de maximale afwijkingsafstand van de mitochondrion van het spoorcentrum zich in het eerste frame26bevindt. In een andere studie stelden de auteurs 50 nm/s vast als drempel om de stationaire status te onderscheiden van de bewegende status27. Hier werd een drempel van 300 nm/s gebruikt om het op microtubuli gebaseerde vervoer te onderscheiden, zoals in eerdere rapporten28,29. Hoewel de drempel voor stationaire en bewegende mitochondriën is anders, het instellen van de drempel kan belangrijke relatieve informatie over mitochondriale beweging binnen axonen tussen wild-type en degeneratieve neuronen.
De meeste protocollen met mitochondriale transportanalyse hebben kymogrammen gebruikt, die tweedimensionale weergave van posities versus tijd zijn. Er zijn meerdere geautomatiseerde tools ontwikkeld voor de analyse van deeltjestracking26,30,31,32,33,34. Deze kunnen elk frame nauwkeurig scheiden. Naast de snelheid en het motile percentage dat ImageJ kan meten, kan deze methode motile gebeurtenissen nauwkeurig meten. Deze zijn echter niet gratis te gebruiken. Hier werd de analyse van mitochondriaal transport uitgevoerd met behulp van ImageJ met de "Multikymograph" en "Macros" plugins. Deze plugins kunnen effectief mitochondriale beweging meten. Het voordeel van deze plugins is hun gebruiksgemak en het vermogen om veranderingen in mitochondriaal axonal transport in de vorm van kymografen en snelheid na verloop van tijd aan te geven.
Motile mitochondriën werden geanalyseerd in SPG3A en controle neuronen. Een vergelijkbare vermindering van het percentage motile mitochondriën werd waargenomen met behulp van twee verschillende analysemethoden, die het nut van ImageJ bevestigen om axonal transport te analyseren. Bovendien kan mitochondriale morfologie worden geanalyseerd met behulp van dezelfde set beelden, die belangrijke uitlezingen biedt voor het bestuderen van mitochondriale disfunctie bij verschillende neurologische ziekten. Aangezien axonale degeneratie en mitochondriale disfunctie meestal optreden in eerdere stadia, voordat neuronen sterven, kan deze methode worden gebruikt om vroege pathologische veranderingen te onderzoeken om moleculaire paden te identificeren en therapieën te screenen om te redden neurodegeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Spastic Paraplegia Foundation, de Blazer Foundation en de NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
