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Neuroscience

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

Published: February 9, 2020 doi: 10.3791/60548

Summary

Le transport mitochondrial altéré et la morphologie sont impliqués dans diverses maladies neurodegenerative. Le protocole présenté utilise des neurones de cerveaux avant dérivés de cellules souches pluripotentes induits pour évaluer le transport mitochondrial et la morphologie dans la paraplégie spastique héréditaire. Ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie, ce qui facilitera l’étude des maladies neurodégénératives.

Abstract

Les neurones ont des exigences intenses pour la haute énergie afin de soutenir leurs fonctions. Le transport mitochondrial altéré le long des axones a été observé dans les neurones humains, qui peuvent contribuer à la neurodégénérescence dans divers états de la maladie. Bien qu’il soit difficile d’examiner la dynamique mitochondriale dans les nerfs humains vivants, de tels paradigmes sont essentiels pour étudier le rôle des mitochondries dans la neurodégénérescence. Décrit ici est un protocole pour analyser le transport mitochondrial et la morphologie mitochondriale dans les axones de neurone de forebrain dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs). Les iPSC sont différenciés en neurones glutamatergiques telencéphaliques utilisant des méthodes bien établies. Les mitochondries des neurones sont tachées avec MitoTracker CMXRos, et le mouvement mitochondrial dans les axones sont capturés à l’aide d’un microscope d’imagerie à cellules vivantes équipé d’un incubateur pour la culture cellulaire. Les images en accéléré sont analysées à l’aide d’un logiciel avec des plugins "MultiKymograph", "Bioformat importateur" et "Macros". Des kymographes du transport mitochondrial sont produits, et la vitesse mitochondriale moyenne dans les directions antérogrades et rétrogrades est lue du kymographe. En ce qui concerne l’analyse de la morphologie mitochondriale, la longueur mitochondriale, la zone et le rapport d’aspect sont obtenus à l’aide de l’ImageJ. En résumé, ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie pour faciliter les études des maladies neurodégénératives.

Introduction

La motilité et la distribution mitochondriales jouent un rôle vital dans l’accomplissement des exigences énergétiques variables et spécialisées dans les neurones polarisés. Les neurones peuvent étendre les axones extrêmement longs pour se connecter avec les cibles grâce à la formation de synapses, qui exigent des niveaux élevés d’énergie pour la mise en mémoire tampon Ca2 et les courants ioniques. Le transport des mitochondries de soma à l’axone est essentiel pour soutenir la fonction axonale et synaptique des neurones. Le mouvement mitochondrial dynamique spatialement et temporellement est effectué par le transport axonal rapide à des taux de plusieurs micromètres par seconde1.

Plus précisément, les protéines motrices ou adaptatrices, telles que la kinésie et la dyneine, participent au transport rapide d’organelle le long des microtubules pour contrôler le mouvement des mitochondries2,3. L’activité neuronale normale exige le transport approprié des mitochondries nouvellement assemblées du soma neuronal à l’axone distal (transport axonal antérograde) et au transport inverse des mitochondries de l’axone distal de nouveau au corps cellulaire (transport rétrograde). Des études récentes ont indiqué que l’allocation mitochondriale incorrecte est fortement associée aux défauts neuronaux et aux maladies dégénératives de neurone moteur4,5. Par conséquent, pour disséquer le rôle des mitochondries dans la neurodégénérescence, il est important d’établir des méthodes pour examiner le mouvement mitochondrial le long des axones dans les cultures vivantes.

Il y a deux principaux défis dans l’examen et l’analyse du suivi des mitochondries : (1) identifier les mitochondries à partir de l’arrière-plan dans chaque image, et (2) analyser et générer les connexions entre chaque image. Pour résoudre le premier défi, une approche d’étiquetage de la fluorescence est largement utilisée pour distinguer les mitochondries de l’arrière-plan, comme le colorant MitoTracker ou la transfection de la protéine de ciblage mitochondrial fusionnée à la fluorescence (p. ex. mito-GFP)6,7,8. Pour analyser l’association entre les cadres, plusieurs algorithmes et outils logiciels ont été décrits dans des études antérieures9. Dans un article récent, les chercheurs ont comparé quatre outils automatisés différents (p. ex. Volocity, Imaris, wrMTrck et Difference Tracker) pour quantifier le transport mitochondrial. Les résultats ont montré que, malgré les écarts dans la longueur de la voie, le déplacement mitochondrial, la durée du mouvement et la vitesse, ces outils automatisés sont adaptés pour évaluer la différence de transport après le traitement10. En plus de ces outils, un plugin intégré "Macros" pour ImageJ (écrit par Rietdorf et Seitz) a été largement utilisé pour analyser le transport mitochondrial11. Cette méthode génère des kymographes qui peuvent être utilisés pour analyser le mouvement mitochondrial, y compris la vitesse dans les deux directions antérogrades et rétrogrades.

Les mitochondries sont des organites très dynamiques qui changent constamment de nombre et de morphologie en réponse à des conditions physiologiques et pathologiques. La fission mitochondriale et la fusion régulent étroitement la morphologie mitochondriale et l’homéostasie. Le déséquilibre entre la fission mitochondriale et la fusion peut induire des réseaux mitochondriaux extrêmement courts ou longs, ce qui peut altérer la fonction mitochondriale et entraîner des activités neuronales anormales et la neurodégénérescence. Le transport mitochondrial et la morphologie altérés sont impliqués dans diverses maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, et la paraplégie spastique héréditaire (HSP)12,13,14,15. HSP est un groupe hétérogène de troubles neurologiques héréditaires caractérisés par la dégénérescence de la région corticospinal et l’échec ultérieur de contrôler les muscles des membres inférieurs16,17. Dans cette étude, les neurones de cerveau xavant iPSC-dérivés sont employés pour évaluer le transport mitochondrique et la morphologie dans HSP. Cette méthode fournit un paradigme unique pour examiner la dynamique mitochondriale des axones neuronaux dans les cultures vivantes.

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Protocol

1. Génération de neurones glutamatergiques téencéphaliques à partir d’iPSC

REMARQUE : Le protocole détaillé pour maintenir des iPSC s’est différencié dans les neurones glutamatergiques telencephalic sont semblables à ceux décrits précédemment18. Ici, le processus critique lors de la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines est introduit et mis en évidence.

  1. IPSCs de culture sur les mangeurs embryonnaires de fibroblaste de souris (MEF) dans le milieu humain de cellules souches embryonnaires (hESC) complétés avec le facteur de croissance de fibroblaste (bFGF, 4 ng/mL).
  2. Après l’incubation avec la dispase (1 mg/mL) pendant 3 min, dissocier les iPSC en petits touffes. Ensuite, la culture des agrégats iPSC en suspension dans le milieu hESC pendant 4 jours. Reportez-vous à ce point de temps, lorsque les iPSC commencent comme la culture de suspension, comme le jour 1 (D1). Changer le milieu tous les jours pendant 4 jours.
  3. À D5, recueillir les agrégats iPSC après centrifugation à 200 x g pendant 2 min et la culture dans les supports d’induction neuronale (NIM) pendant 3 jours. Culture les agrégats cellulaires en suspension pendant 3 jours en changeant la moitié des médias tous les 2 jours. Ajouter Le dMH-1 (2 M) et le SB431542 (2 M) au milieu NIM pour augmenter l’efficacité de l’induction neuronale.
  4. À D8, recueillir les agrégats iPSC après centrifugation à 200 x g pendant 2 min et les laisser adhérer à 6 plaques de puits (environ 20 à 30 agrégats par puits de la plaque) en faisant la culture dans LE NIM avec 10% de FBS (ou avec des plaques enduites de laminin) pendant la nuit. Le lendemain, retirez l’ancien médium et changez de NIM tous les 2 jours jusqu’à D17.
    REMARQUE : La génération des cellules neuroépithéliales, qui est indiquée par la formation des cellules colonneaires avec des structures de rosette, est observée dans cette période.
  5. À D17, isoler mécaniquement les cellules neuroépithéliales au centre des colonies (se soulevant directement en appliquant une petite pression au centre des colonies) ou enzymatiquement (traitées avec dispase). Transférer les cellules neuroépithéliales isolées sur un flacon T25 de culture tissulaire non traité contenant 8 ml de NIM avec l’ajout de B27 (1x), de cAMP (1 M) et d’IGF (10 ng/mL).
    REMARQUE : La culture de suspension permet aux cellules de former des neurosphères qui sont enrichies avec des progéniteurs neuronaux de projection corticale.
  6. Après D35, plaquez les neurosphères sur la matrice de membrane de membrane de sous-sol de facteur de croissance réduite de facteur de poly-ornithine et de Facteur de LDEV(Table of Materials)-enduit 35 mm des plats de fond en verre pour produire des neurones glutamatergiques telencéphaliques (neurones de projection corticale). Avant le placage, dissocier les neurosphères en petits groupes en couve avec une solution de détachement cellulaire de 1 mg/mL pendant 2 min à 37 oC.
  7. Retirez la solution de détachement cellulaire par centrifugation et suspendez-la en 1 ml de milieu de différenciation neuronale (NDM). Plaques de cellules sur le plat en verre (environ cinq grappes dans 100 'L de milieu par plat) pour les laisser attacher. Ensuite, ajouter NDM (1 mL par plat) et la culture des cellules dans NDM contenant B27 (1x), cAMP (1 M), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL), et GDNF (10 ng/mL).
    REMARQUE : Les petits amas sont plaqués parce qu’ils survivent bien et donnent lieu à de longs neurones de projection. Alternativement, les cellules peuvent être dissociées et plaquées à une densité d’environ 20.000 cellules par plat pour une meilleure séparation.
  8. Caractériser les neurones glutamatergiques telencéphaliques en immunostaining les marqueurs Tbr1 et III-tubulin.

2. Examen du transport mitochondrial le long des axones des neurones glutamatergiques telencéphaliques

  1. Réchauffer le NDM et allumer l’incubateur pour le microscope à fluorescence fixé à 37 oC et 5 % de CO2.
  2. Pour visualiser les mitochondries le long des axones des neurones du cerveau, incubez les neurones avec un colorant fluorescent rouge de 50 nM pour tacher les mitochondries dans les cellules vivantes (p. ex. MitoTracker CMXRos) en NDM pendant 3 min à 37 oC. Ensuite, lavez les cellules 2x avec NDM réchauffé. Les neurones sont incubés dans NDM.
  3. Afin d’enregistrer le transport mitochondrial le long des axones, prenez des images en time-lapse du mouvement mitochondrial en utilisant l’objectif 40x avec un microscope à fluorescence.
    REMARQUE : Pour stabiliser la culture, effectuez l’imagerie cellulaire vivante lorsque les cellules sont incubées dans l’incubateur pendant 20 min après coloration mitochondriale.
  4. Sous le champ de phase, identifier les axones en fonction des caractéristiques morphologiques (émergent directement du corps neuronal de cellules, longues neurites minces constantes sans ramification). Les mitochondries se déplacent dans les sens antérogrades (du corps cellulaire à l’axone distal) et les directions rétrogrades (du terminal axonal au corps cellulaire). Pour distinguer la direction du mouvement mitochondrial le long des axones, identifiez clairement les corps cellulaires des neurones. Dans cette étape, concentrer les axones sous le champ de phase pour réduire le photoblanchiment.
  5. Après avoir distingué le corps cellulaire et l’axone, ajuster le temps d’exposition et la mise au point des mitochondries dans les axones. Ensuite, capturez le transport des mitochondries dans les axones tous les 5 s pour une durée totale de 5 min, donnant 60 images. Capturez au hasard au moins cinq emplacements pour chaque plat et répétez 3x pour chaque groupe.

3. Analyse des données du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones corticaux

REMARQUE : Analyser les données recueillies sur le transport mitochondrial à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (p. ex., ImageJ ou MetaMorph19). Étant donné que ImageJ est facilement disponible, effectuez l’analyse du transport mitochondrial et de la morphologie à l’aide d’ImageJ avec le MultiKymograph, Macros, et Analyze particules plugins.

  1. Analyse du transport mitochondrial à l’aide d’ImageJ
    1. Après avoir capturé les images en time-lapse de la motilité mitochondriale, analyser la vitesse et le mouvement des mitochondries à l’aide du plugin MultiKymograph. Les images sont enregistrées sous forme de fichiers format .tiff, qui sont analysés par le logiciel Fidji suivant une méthode précédemmentrapportée 20.
    2. Téléchargez le logiciel Fidji. Téléchargez des plugins qui seront nécessaires pour analyser la vitesse de déplacement mitochondriale des kymographes. Téléchargez le forfait Bio-formats et Kymograph Plugin avec ces quatre plugins .class, y compris: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class, et WalkingAverage.class (Table of Materials). Déplacez ces fichiers vers le dossier de plugins Fidji. Téléchargez des plugins "tsp050706.txt" dans le dossier des plugins. Redémarrez le logiciel Fidji lorsque les fichiers sont déplacés vers le dossier plugins.
    3. Logiciel Open Fiji. Choisissez des plugins, puis importer des images de la série .tiff par Bio-Formats Importer sous Bio-Formats. Assurez-vous de choisir Standard ImageJ dans Stack visualisation, choisissez Ouvrez toutes les séries, vérifier Autoscale, puis cliquez sur OK. Prenez note du nombre d’images et de la taille des images en pixels, qui sont affichées en haut de l’image.
      REMARQUE: Prenez 60 images par image.
    4. Envisagez de rendre les images plus claires en ajustant la luminosité/contraste sous le menu Image pour les 60 images.
    5. Cliquez à droite sur l’outil de ligne pour choisir la ligne segmentée et dessiner une ligne segmentée à partir du corps cellulaire et se terminant à l’axone terminal. Générer le kymographe en choisissant MultipleKymograph sous Plugins. Le choix de la largeur de la ligne est invité après avoir choisi le MultipleKymograph. Assurez-vous qu’il s’agit d’un nombre impair. Choisissez 1 pour la largeur de la ligne. Un kymographe est généré après cette étape.
      REMARQUE : Plusieurs éléments d’information importants peuvent être lus à partir du kymographe. L’axe y du kymographe est le temps de durée (5 min) pour les 60 images. L’axe X représente la position des axones sélectionnés.
    6. Utilisez une ligne diagonale dans le kymographe pour déterminer la direction de mouvement des mitochondries (antérogrades, rétrogrades ou stables). Par exemple, une ligne descendant vers la droite le long de l’axe y indique un mouvement antérograde, et une ligne descendant vers la gauche le long de l’axe y indique un mouvement rétrograde. Une ligne verticale indique qu’il n’y avait aucun mouvement dans la mitochondrie.
    7. Mesurez la distance, les valeurs temporelles et la vitesse des mitochondries en mouvement à l’aide du logiciel Macros plugin in Fiji. Aller à Plugins (fr) Macros - France Installation de l’ire du monde tsp050607.txt. Dessiner une ligne segmentée sur la trace du mouvement mitochondrial sur le kymographe, et toujours tracer la ligne de la région supérieure à inférieure (y-axe).
    8. Après avoir tracé la ligne, rendez-vous chez Plugins. Macros - France lire les vitesses des c. à thé. Étant donné qu’une ligne segmentée le long de la trace est tracée, le plugin indique des vitesses segmentées correspondant à la ligne.
      REMARQUE : L’unité pour toutes les données est pixels. dy sum est le temps consommé à partir du point de départ, et dx sum indique la distance de la mitochondrie se déplaçant dans l’axe x. dy now et dx affiche maintenant la distance de temps et de mouvement de période pour chaque segment, respectivement. vitesse réelle montre la vitesse pour chaque segment (dx maintenant / dy maintenant). la vitesse moyenne indique la vitesse moyenne pour le déplacement mitochondrial (dx sum/dy sum).
    9. Changez l’unité de dx maintenant de pixel à 'm comme le rapport de pixel en 'm en mesurant la barre d’échelle. Convertissez l’appareil pour la distance de pixel à 'm en mesurant les barres d’échelle dans les images. Utilisez l’outil de ligne pour tracer une ligne le long de la barre d’échelle et mesurer la longueur de la ligne en choisissant Mesure » sous « Analyser. Changez l’heure de pixel en secondes, en tant que 1 pixel et 5 secondes dans cette expérience.
    10. Dans le fichier de feuille de calcul, calculez la vitesse moyenne et étiquetez en conséquence le mouvement rétrograde ou antérograde. Moyenne de la vitesse de mouvement antérograde ou rétrograde.
    11. Déterminez le pourcentage de mitochondries fixes et motiles du kymographe. Les mitochondries en mouvement antérogrades ou rétrogrades sont définies comme se déplaçant à 5 m vers l’avant ou vers l’arrière de l’origine pendant toute la période21. Les mitochondries sont considérées comme stationnaires si elles ne se sont pas déplacent de plus de 5 m pendant les 5 min.
  2. Analyse de la morphologie mitochondriale à l’aide d’ImageJ
    REMARQUE : Déterminer la morphologie mitochondriale en mesurant la longueur, la surface et le rapport d’aspect mitochondriaux à l’aide d’ImageJ. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Afin d’analyser la longueur et la zone mitochondriales dans les axones, téléchargez le plugin Straighten_.jar à partir du site Web d’ImageJ (voir Tableau des matériaux) et déplacez-le vers le dossier des plugins. Redémarrer le logiciel ImageJ.
    2. Ouvrez l’image à travers la fonction ouverte sous Fichier et convertissez l’image 32 bits en 8 bits en utilisant Type sous Image.
    3. Tracez une ligne segmentée le long des axones. Choisissez Straighten sous Plugins et définir 50 pixels pour largeur de Filament / Wide Line. Cela générera un axone redressé.
    4. Ajuster le seuil sous Image et définir la mesure sous Analyse en choisissant "Zone Périmètre de l’année Fit ellipse Descripteursde forme .
    5. Mesurez la barre d’échelle à l’aide de la fonction de ligne et définir l’échelle sous Analyze en remplissant la distance en pixel, connaître la distance, et l’unité de longueur. Ensuite, choisissez Global pour définir ce paramètre d’échelle.
    6. Utilisez Analyze Particles under Analyze pour déterminer la zone. Les paramètres rapides sont la taille (pixel 2) ' 0.20'infini, la circularité '0.00'1.00, et le spectacle 'ellipses' . Choisissez les résultats d’affichage.
      REMARQUE : La mesure donnera les résultats de plusieurs paramètres de morphologie mitochondriale, y compris la zone, les périmètres, la longueur (majeur), la largeur (mineur) et le rapport d’aspect (AR). Le nombre mitochondrial correspondant est également répertorié.
    7. Calculer le nombre mitochondrial par axone (m) à l’aide du nombre mitochondrial divisé par longueur axonale.

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Representative Results

Ici, les iPSC humains ont été différenciés en neurones glutamatergiques telencéphaliques, qui ont été caractérisés par l’immunostaining avec des marqueurs de tubuline de Tbr1 et iii (figure 1A). Pour examiner le transport axonal des mitochondries, ces cellules ont été souillées avec le colorant fluorescent rouge, et la formation image de time-lapse a été exécutée. Étant donné que L’ImageJ est facilement disponible et plus facile à obtenir, le transport mitochondrial a été analysé plus en détail avec les plugins ImageJ « MultiKymograph » et « Macros », représentés à la figure 1.

Il y a trois états respectifs de mouvement mitochondrial, y compris le mouvement statique, antérograde, et rétrograde (figure 1B,C). Une seule mitochondrie peut rester statique ou se déplacer dans une direction antérograde ou rétrograde à l’intérieur d’un axone, et ici, une ligne segmentée a été tracée le long de la trajectoire du mouvement mitochondrial pour déterminer la vitesse (Figure 1D). La vitesse du mouvement mitochondrial le long de l’axone est indiquée dans la figure 1E et correspond aux lignes segmentées de la figure 1D après lecture par "Macros" dans ImageJ. Semblable au logiciel MetaMorph, ImageJ peut être utilisé pour déterminer la vitesse mitochondriale et le pourcentage de mitochondries motiles basées sur le kymographe généré par ImageJ (Figure 1F). À l’aide d’un logiciel d’analyse disponible dans le commerce (p. ex. MetaMorph), des données antérieures ont montré que le pourcentage de mitochondries motiles avait été considérablement réduit dans les neurones SPG3A par rapport aux neurones normaux, tandis que la vitesse n’était pas modifiée19. Pour évaluer le logiciel ImageJ, le pourcentage de mitochondries motiles a été examiné, et une réduction similaire du pourcentage de mitochondries motiles dans les neurones SPG3A par rapport aux neurones de type sauvage (WT) a été observée (Figure 1G).

En ce qui concerne l’analyse de la morphologie mitochondriale, la zone mitochondriale, la longueur et l’AR ont été analysées à l’aide de la fonction « particules d’analyse » dans ImageJ. Les axones ont été redressés à l’aide du plugin « straighten »(figure 2A,B). Les mitochondries ont été choisies clairement en ajustant le seuil (figure 2C,D). Enfin, la zone mitochondriale, la longueur (majeure), la largeur (mineur), le rapport d’aspect et le périmètre ont été obtenus à partir de l’axone redressé à l’aide du plugin « Particules d’analyse »(figure 2E,F). La morphologie mitochondriale anormale a été (et a déjà été) observée dans les neurones glutamatergiques glutamatergiques tencéphaliques dérivés de HSPC, y compris les cellules SPG15(figure 2G,H,I)13,22. La longueur mitochondriale et le rapport d’aspect ont été sensiblement réduits dans les axones de neurone de SPG15 comparés aux axones de neurone de WT de contrôle (figure 2G, H, I).

Figure 1
Figure 1 : Analyse du transport mitochondrial à l’aide d’ImageJ. (A) Immunostaining montrant la génération des neurones glutamatergiques telencéphaliques. Tbr1 (rouge), tubulin III (vert) et Hoechst (bleu). Barres d’échelle de 50 m. Ce chiffre a été modifié par rapport à une étude précédente19. (B) Transport mitochondrial dans les axones des neurones. Le mouvement mitochondrial antérograde est défini comme les mitochondries se déplaçant du corps cellulaire à l’axone distal, et le mouvement mitochondrial rétrograde provient de l’axone distal et s’étend au corps neuronal de cellules. La ligne de segment est tracée le long des axones du corps neuronal de cellules au terminal axonal distal afin de produire des kymographes. (C) Kymograph est généré à l’aide d’ImageJ; x-axe est la position axonale et y-axe est le temps. Une ligne blanche continue est le mitochondrion se déplaçant dans la direction antérograde (tête de flèche rose), la direction rétrograde (tête de flèche bleue), ou l’état statique (tête de flèche jaune). (D) La ligne segmentée est dessinée pour lire la vitesse à l’aide du plugin Macros. Les nombres 1 à 8 décrivent le segment de la ligne. Le mouvement antérograde (1-4, 6, 8) et l’état statique (5, 7) peuvent être distingués de ce kymographe amplifié. (E) Temps et distance mobile pour chaque segment, vitesse réelle et moyenne (en pixels). (F) Kymograph of mitochondrial transport for WT and SPG3A cortical PNs using ImageJ. Barre d’échelle de 10 m. (G) Ratio mitochondrial motile dans les PN corticales WT et SPG3A à l’aide d’ImageJ (lt; 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Analyser la morphologie mitochondriale à l’aide d’ImageJ. (A) Paramètres pour redresser l’axone. (B) Le représentant a redressé axone. (C,D) Ajustement du seuil pour choisir les mitochondries. (E,F) La zone mitochondriale mesurée, le périmètre, la longueur (majeur), la largeur (mineur) et le rapport d’aspect (AR) correspondant aux mitochondries sélectionnées dans (E). (G) Images représentatives des mitochondries dans les neurones glutamatergiques tencéphaliques WT et SPG15. Barres d’échelle de 20 m. (H) Longueur mitochondriale dans les neurones WT et SPG15. (I) Rapport d’aspect des mitochondries dans les neurones WT et SPG15. p 'lt; 0.01 vs. WT. (G), (H), et (I) sont modifiés à partir d’une étude précédente13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Outils fluorescents Avantages Inconvénients Références
MitoTracker MitoTracker MitoTracker est mitochondrial potentiel-indépendant et peut être employé pour analyser la colocalisation des mitochondries avec l’autophagosome ou le lysosome. MitoTracker n’est pas assez phototable pour la recherche à long terme. 35
NPA-TPP Ce colorant est un nouveau réactif d’étiquetage mitochondrial photostable. Le processus de synthèse et de purification de ce colorant est long et coûteux. 23
MitoBADY MitoBADY Ce colorant peut être utilisé pour la visualisation mitochondriale à l’aide de la microscopie Raman avec une sensibilité et une spécificité élevées. L’utilisation de ce colorant nécessite un microscope Raman. 25
TMRE (en) Ce colorant est un colorant mitochondrial non toxique et spécifique avec une faible concentration et aucun effet d’étanchéité. Les mitochondries d’étiquetage TMRE dépendent du potentiel de membrane mitochondriale. 36, 37
Protéines fluorescentes ciblées par les mitochondries Les protéines fluorescentes ciblées par les mitochondries sont plus spécifiques et plus stables. Cette méthode nécessite la transfection et l’efficacité de la transfection est différente selon les types de cellules. 38, 39

Tableau 1 : Avantages et inconvénients de certains outils fluorescents pour l’étiquetage mitochondrial.

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Discussion

Cet article décrit une méthode pour analyser le transport mitochondrial et la morphologie dans les axones neuronaux utilisant le colorant fluorescent rouge et le logiciel d’ImageJ, qui fournissent tous deux une plate-forme unique pour étudier la dégénérescence axonale et la morphologie mitochondriale dans la maladie neurodegenerative. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, y compris la coloration des mitochondries, l’imagerie cellulaire vivante, et l’analyse des images. Dans cette méthode, un colorant fluorescent a été utilisé pour tacher les mitochondries. Étant donné que les neurones humains dérivés de l’iPSC sont facilement détachés du plat, il est important de laisser une solution dans le plat et d’ajouter doucement le milieu neurobasal. Le lavage peut être effectué trois ou quatre fois pour enlever le colorant. En outre, les mitochondries peuvent être étiquetées avec d’autres journalistes pour mesurer leur transport le long des axones, tels que les mitochondries fusionnées de protéines fluorescentes ciblant les protéines6. Dans le suivi à long terme, plusieurs sondes (c.-à-d., NPA-TPP, 2,1,3-benzothiadiazole [BTD] dérivés fluorescents, et une sonde Raman spécifique) ont montré un grand potentiel dans le suivi mitochondrial à long terme et l’analyse de dynamique mitochondriale23,24,25. Les avantages et les inconvénients des différentes sondes se trouvent dans le tableau 1.

Après la coloration mitochondriale, l’imagerie cellulaire vivante est réalisée à l’aide d’un microscope équipé d’un incubateur. Pour concentrer efficacement les neurones pendant l’imagerie, les échantillons neuronaux doivent être conservés dans l’incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 et dans un environnement humide pendant au moins 15 min. Pour minimiser les effets hors-focus, des images à différentes positions Z peuvent être prises pour faire une pile Z, ou la fonction de mise au point automatique peut être utilisée. Il est important d’identifier la direction du transport mitochondrial (antérograde ou rétrograde), des images de phase sont prises pour distinguer le corps des cellules neuronales et les axones. Un autre problème critique est le photoblanchiment des échantillons fluorescents, qui doivent être évités pour obtenir des images efficaces de transport mitochondrial time-lapse. Une méthode efficace pour minimiser le photoblanchiment consiste à concentrer les échantillons à travers l’oculaire et à définir tous les paramètres d’imagerie sous le canal de phase, sauf pour le temps d’exposition. En outre, le modèle de mise à l’échelle automatique peut diminuer le photoblanchiment de la fluorescence.

Les mitochondries sont des organites très dynamiques et peuvent se déplacer dans des directions antérogrades et rétrogrades. Dans les neurones, quelques mitochondries dans les axones restent stationnaires pendant l’enregistrement. Parmi les mitochondries mobiles, l’état du mouvement peut varier au fil du temps. Ce phénomène soulève la question importante de savoir quel type de mitochondries est considéré comme stationnaire ou en mouvement. Cela peut être résolu en fixant le seuil lors de l’analyse du transport axonal mitochondrial. Pour distinguer les mitochondries statiques, Neumann et coll. ont utilisé le centre de voie mitochondriale, qui est défini comme la moyenne de ses coordonnées de position au fil du temps, puis a fixé le seuil à 350 nm/s de sorte que la distance d’écart maximale de la mitochondrie de son centre de voie est dans le premier cadre26. Dans une autre étude, les auteurs ont fixé 50 nm/s comme seuil pour distinguer le statut stationnaire du statut mobile27. Un seuil de 300 nm/s a été utilisé ici pour distinguer le transport à base de microtubules comme cela a été fait dans les rapports précédents28,29. Bien que le seuil pour les mitochondries stationnaires et en mouvement soit différent, le réglage du seuil peut fournir des informations relatives importantes sur le mouvement mitochondrial dans les axones entre les neurones sauvages et dégénératifs.

La plupart des protocoles impliquant l’analyse du transport mitochondrial ont utilisé des kymogrammes, qui sont une représentation bidimensionnelle des positions par rapport au temps. Plusieurs outils automatisés ont été développés pour l’analyse du suivi des particules26,30,31,32,33,34. Ceux-ci peuvent séparer avec précision chaque image. En plus de la vitesse et du pourcentage motile que ImageJ peut mesurer, cette méthode peut mesurer les événements motiles avec précision. Cependant, ceux-ci ne sont pas libres d’utiliser. Ici, l’analyse du transport mitochondrial a été effectuée à l’aide d’ImageJ avec les plugins "Multikymograph" et "Macros". Ces plugins peuvent mesurer efficacement le mouvement mitochondrial. L’avantage de ces plugins est leur facilité d’utilisation et leur capacité à indiquer des altérations dans le transport axonal mitochondrial sous forme de kymographes et de vitesse au fil du temps.

Les mitochondries motiles ont été analysées dans SPG3A et les neurones de contrôle. Une réduction similaire du pourcentage de mitochondries motiles a été observée à l’aide de deux méthodes d’analyse différentes, confirmant l’utilité d’ImageJ pour analyser le transport axonal. En outre, la morphologie mitochondriale peut être analysée en utilisant le même ensemble d’images, ce qui fournit des conseils importants pour l’étude du dysfonctionnement mitochondrial dans diverses maladies neurologiques. Puisque la dégénérescence axonale et le dysfonctionnement mitochondrial se produisent habituellement pendant les étapes plus tôt, avant que les neurones meurent, cette méthode peut être employée pour examiner les changements pathologiques tôt pour aider à identifier des voies moléculaires et à la thérapie d’écran pour sauver Neurodégénérescence.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fondation Spastic Paraplegia, la Fondation Blazer et les NIH (R21NS109837).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Cell Detachment Solution Innovative Cell Technologies AT104
Biosafety hood Thermo Scientific 1300 SERIES A2
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R/ 75004261
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
Cyclic AMP (cAMP) Sigma-Aldrich D0627
Dispase Gibco 17105-041
Dorsomorphin Selleckchem S7146
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Corning 10-092-CV
FBS Gibco 16141-002
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Peprotech 100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Gibco A1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement Gemini 400-160
Glass Bottom Dishes MatTek P35G-0.170-14-C
9'' glass pipetes VWR 14673-043
Glial derived neurotrophic factor (BDNF) Sigma-Aldrich D0627
GlutaMAX-I Gibco 35050-061
Heparin Sigma H3149
Insulin growth factor 1 (IGF1) Invitrogen M7512
Knockout Serum Replacer Gibco A31815
Laminin Sigma L-6274
2-Mercaptoethanol Sigma M3148-100ML
MitoTracker CMXRos Invitrogen M7512
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Non Essential Amino Acids Gibco 11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free Supplement Gemini 400-163
Olympus microscope IX83 Olympus IX83-ZDC2
PBS Corning 21-031-CV
Phase contrast microscope Olympus CKX41/ IX2-SLP
6 well plates Corning 353046
24 well plates Corning 353047
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) Sigma-Aldrich P3655
SB431542 Stemgent 04-0010
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane Millipore SCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF Millipore SCGVU10RE
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
Trypsin inhibitor Gibco 17075029
50 ml tubes Phenix SS-PH50R
15 ml tubes Phenix SS-PH15R
T25 flasks (untreated) VWR 10861-572
Plugins for softwares
Bio-formats Package http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji software https://fiji.sc/
Kymograph Plugin https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jar https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txt https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html

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Neurosciences Numéro 156 transport mitochondrial morphologie mitochondriale neurones du cerveau cellules souches pluripotentes induites dégénérescence axonale paraplégie spastique héréditaire
Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire
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Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein,More

Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. J. Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia. J. Vis. Exp. (156), e60548, doi:10.3791/60548 (2020).

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