Summary
Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das vorgestellte Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Vorhirn-Neuronen, um mitochondrialen Transport und Morphologie bei erblicher spastischer Paraplegie zu bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie, die das Studium neurodegenerativer Erkrankungen erleichtern wird.
Abstract
Neuronen haben intensive Anforderungen an hohe Energie, um ihre Funktionen zu unterstützen. Beeinträchtigter mitochondrialer Transport entlang von Axonen wurde bei menschlichen Neuronen beobachtet, die zur Neurodegeneration in verschiedenen Krankheitszuständen beitragen können. Obwohl es schwierig ist, die mitochondriale Dynamik in lebenden menschlichen Nerven zu untersuchen, sind solche Paradigmen entscheidend für die Untersuchung der Rolle von Mitochondrien bei der Neurodegeneration. Beschrieben hier ist ein Protokoll zur Analyse des mitochondrialen Transports und der mitochondrialen Morphologie in Vorhirn-Neuronaxonen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitet wurden. Die iPSCs werden mit etablierten Methoden in telencephalische Glutamatergen-Neuronen unterschieden. Mitochondrien der Neuronen werden mit MitoTracker CMXRos gefärbt, und die mitochondriale Bewegung innerhalb der Axone wird mit einem Live-Zell-Bildgebungsmikroskop erfasst, das mit einem Inkubator für die Zellkultur ausgestattet ist. Zeitrafferbilder werden mit Software mit den Plugins "MultiKymograph", "Bioformat importer" und "Macros" analysiert. Kymographen des mitochondrialen Transports werden erzeugt, und die durchschnittliche mitochondriale Geschwindigkeit in anterograde und retrograde Richtungen wird aus dem Kymographen gelesen. In Bezug auf die mitochondriale Morphologieanalyse werden mit der Bildj die mitochondriale Länge, Fläche und das Seitenverhältnis ermittelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie ermöglicht, um Studien zu neurodegenerativen Erkrankungen zu erleichtern.
Introduction
Mitochondriale Beweglichkeit und Verteilung spielen eine entscheidende Rolle bei der Erfüllung variabler und spezialisierter energetischer Anforderungen in polarisierten Neuronen. Neuronen können extrem lange Axone verlängern, um sich durch die Bildung von Synapsen mit Zielen zu verbinden, die ein hohes Maß an Energie für Ca2+-Puffer- und Ionenströme erfordern. Der Transport von Mitochondrien von Soma zu Axon ist entscheidend für die Unterstützung der axonalen und synaptischen Funktion von Neuronen. Die räumlich und zeitlich dynamische mitochondriale Bewegung wird durch schnellen axonalen Transport mit Geschwindigkeiten von mehreren Mikrometern pro Sekunde1durchgeführt.
Insbesondere nehmen Motor- oder Adapterproteine wie Kinesin und Dynein am schnellen Organellentransport entlang von Mikrotubuli teil, um die Bewegung von Mitochondrien2,3zu steuern. Normale neuronale Aktivität erfordert einen ordnungsgemäßen Transport von neu zusammengesetzten Mitochondrien vom neuronalen Soma zum distalen Axon (anterograde axonaler Transport) und umgekehrten Transport von Mitochondrien vom distalen Axon zurück zum Zellkörper (retrograde Transport). Jüngste Studien haben gezeigt, dass unsachgemäße mitochondriale Zuordnung stark mit neuronalen Defekten und motorischen neuronen degenerativen Erkrankungen4,5verbunden ist. Daher ist es wichtig, Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bewegung entlang von Axonen in lebenden Kulturen zu etablieren, um die Rolle der Mitochondrien bei der Neurodegeneration zu sezieren.
Es gibt zwei Hauptherausforderungen bei der Untersuchung und Analyse der Verfolgung von Mitochondrien: (1) Identifizierung von Mitochondrien aus dem Hintergrund in jedem Frame und (2) Analyse und Generierung der Verbindungen zwischen jedem Frame. Bei der Lösung der ersten Herausforderung wird ein Fluoreszenz-Etikettierungsansatz häufig verwendet, um Mitochondrien vom Hintergrund zu unterscheiden, wie MitoTracker-Farbstoff oder Transfektion von fluoreszenzgebundenem mitochondrialem Targeting-Protein (z. B. Mito-GFP)6,7,8. Um die Zuordnung zwischen Frames zu analysieren, wurden in früheren Studien9mehrere Algorithmen und Softwaretools beschrieben. In einem kürzlich erschienenen Papier verglichen die Forscher vier verschiedene automatisierte Werkzeuge (z. B. Volocity, Imaris, wrMTrck und Difference Tracker), um den mitochondrialen Transport zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass trotz Diskrepanzen in Gleislänge, mitochondrialer Verdrängung, Bewegungsdauer und Geschwindigkeit diese automatisierten Werkzeuge für die Bewertung der Transportdifferenz nach behandlung10geeignet sind. Zusätzlich zu diesen Tools wurde ein integriertes Plugin "Macros" für ImageJ (geschrieben von Rietdorf und Seitz) weit verbreitet für die Analyse des mitochondrialen Transports11verwendet. Diese Methode erzeugt Kymographen, die verwendet werden können, um mitochondriale Bewegungen zu analysieren, einschließlich der Geschwindigkeit sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen.
Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die sich ständig in Anzahl und Morphologie als Reaktion auf physiologische und pathologische Bedingungen verändern. Mitochondriale Spaltspaltung und Fusion regulieren die mitochondriale Morphologie und Homöostase streng. Das Ungleichgewicht zwischen mitochondrialer Spaltspaltung und Fusion kann extrem kurze oder lange mitochondriale Netzwerke induzieren, die die mitochondriale Funktion beeinträchtigen und zu abnormalen neuronalen Aktivitäten und Neurodegeneration führen können. Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt, wie Alzheimer, Parkinson, Huntington und erbliche spastische Paraplegie (HSP)12,13,14,15. HSP ist eine heterogene Gruppe von vererbten neurologischen Erkrankungen, die durch die Degeneration des Kortikospinaltraktes und das anschließende Versagen bei der Kontrolle der unteren Gliedmaßenmuskulatur16,17gekennzeichnet sind. In dieser Studie werden iPSC-abgeleitete Vorhirn-Neuronen verwendet, um mitochondrialen Transport und Morphologie in HSP zu bewerten. Diese Methode bietet ein einzigartiges Paradigma für die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik neuronaler Axone in lebenden Kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Erzeugung von telenzephalen glutamatergen Neuronen aus iPSCs
HINWEIS: Das detaillierte Protokoll zur Aufrechterhaltung von iPSCs und ihre Differenzierung in telenzephalische Glutamatergenneuronen ähneln denen, die zuvor18beschrieben wurden. Hierwird der kritische Prozess bei der Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen eingeführt und hervorgehoben.
- Kultur iPSCs auf Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Feedern in menschlichen embryonalen Stammzell (hESC) Medium ergänzt mit Fibroblast wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng/ml).
- Nach der Inkubation mit Dispase (1 mg/ml) für 3 min, dissoziieren Sie die iPSCs in kleine Klumpen. Dann kultur die iPSC-Aggregate in Suspension im hESC Medium für 4 Tage. Beziehen Sie sich auf diesen Zeitpunkt, wenn die iPSCs als Suspensionskultur beginnen, als Tag 1 (D1). Ändern Sie das Medium täglich für 4 Tage.
- Sammeln Sie bei D5 die iPSC-Aggregate nach Zentrifugation bei 200 x g für 2 min und Kultur in neuronalen Induktionsmedien (NIM) für 3 Tage. Kultur die Zelle aggregate in Suspension für 3 Tage durch den Wechsel der Hälfte der Medien alle 2 Tage. Fügen Sie DMH-1 (2 M) und SB431542 (2 M) zu NIM-Medium hinzu, um die innuktale Induktionseffizienz zu erhöhen.
- Bei D8 die iPSC-Aggregate nach Zentrifugation bei 200 x g für 2 min sammeln und auf 6 Wellplatten (ca. 20–30 Aggregate pro Bohrkörper der Platte) kleben lassen, indem sie in NIM mit 10% FBS (oder mit laminierten Platten) über Nacht kultivieren. Entfernen Sie am nächsten Tag das alte Medium und wechseln Sie alle 2 Tage bis D17 in NIM.
HINWEIS: Die Bildung von Neuroepithelzellen, die durch die Bildung von Säulenzellen mit Rosettenstrukturen angezeigt wird, wird in diesem Zeitraum beobachtet. - Bei D17, mechanisch isolieren die neuroepitheliale Zellen in der Mitte der Kolonien (Heben direkt durch Anlegen eines kleinen Drucks auf die Mitte der Kolonien) oder enzymatisch (mit Dispase behandelt). Übertragen Sie die isolierten neuroepithelialen Zellen in den nicht behandelten Gewebekultur-T25-Kolben mit 8 ml NIM mit Zusatz von B27 (1x), cAMP (1 M) und IGF (10 ng/ml).
HINWEIS: Die Suspensionskultur ermöglicht es Zellen, Neurosphären zu bilden, die mit kortikalen Projektionsneuralvorläufern angereichert sind. - Nach D35, Platte die Neurosphären auf dem Poly-Ornithin und LDEV-freien reduzierten Wachstumsfaktor Kellermembran Matrix (Tabelle der Materialien) beschichtet 35 mm Glasbodenschalen, um telencephalische glutamaterge Neuronen (kortikale Projektion Neuronen) zu erzeugen. Dissoziieren Sie vor der Beschichtung die Neurosphären mit kleinen Clustern, indem Sie mit 1 mg/ml Zellablösung für 2 min bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die Zellablösung durch Zentrifugation und setzen Sie sie in 1 ml neuronalen Differenzierungsmediums (NDM) wieder auf. Plattenzellen auf der Glasbodenschale (etwa fünf Cluster in 100 L Medium pro Schale), um sie befestigen zu lassen. Fügen Sie dann NDM (1 ml pro Schale) hinzu und kulturieren Sie die Zellen in NDM, die B27 (1x), cAMP (1 m), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) und GDNF (10 ng/ml) enthalten.
HINWEIS: Kleine Cluster sind plattiert, weil sie gut überleben und zu langen Projektionsneuronen führen. Alternativ können Zellen dissoziiert und mit einer Dichte von etwa 20.000 Zellen pro Schale für eine bessere Trennung plattiert werden. - Charakterisieren Sie die telenzephalen glutamatergen Neuronen, indem Sie die Tbr1- und III-Tubulin-Marker immunstainieren.
2. Untersuchung des mitochondrialen Transports entlang von Axonen telenzephaler glutamatergen Neuronen
- Erwärmen Sie den NDM und schalten Sie den Inkubator für das Fluoreszenzmikroskop auf 37 °C und 5%CO2ein.
- Um Mitochondrien entlang der Axone von Vorhirn-Neuronen zu visualisieren, inkubieren Sie die Neuronen mit 50 nM rotem Fluoreszenzfarbstoff, um Mitochondrien in lebenden Zellen (z. B. MitoTracker CMXRos) in NDM für 3 min bei 37 °C zu färben. Als nächstes waschen Zellen 2x mit erwärmtem NDM. Die Neuronen werden in NDM inkubiert.
- Um den mitochondrialen Transport entlang der Axone aufzuzeichnen, nehmen Sie Zeitrafferbilder der mitochondrialen Bewegung mit dem 40-fachen Objektiv mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.
HINWEIS: Um die Kultur zu stabilisieren, führen Sie die Live-Zell-Bildgebung durch, wenn die Zellen im Inkubator für 20 min nach mitochondrialer Färbung inkubiert werden. - Identifizieren Sie unter Phasenfeld die Axone anhand morphologischer Eigenschaften (direkt aus dem neuronalen Zellkörper, konstant dünne lange Neuriten ohne Verzweigung). Mitochondrien bewegen sich in anterograde (vom Zellkörper zum distalen Axon) und retrograde Richtungen (vom axonalen Terminal zum Zellkörper). Um die Richtung der mitochondrialen Bewegung entlang von Axonen zu unterscheiden, identifizieren Sie die Zellkörper von Neuronen eindeutig. Konzentrieren Sie in diesem Schritt Axone unter Phasenfeld, um Photobleichungen zu reduzieren.
- Nach der Unterscheidung des Zellkörpers und des Axons passen Sie die Belichtungszeit und den Fokus von Mitochondrien in Axonen an. Dann erfassen Sie den Transport von Mitochondrien innerhalb von Axonen alle 5 s für eine Gesamtdauer von 5 min, was 60 Rahmen ergibt. Erfassen Sie zufällig mindestens fünf Positionen für jedes Gericht und wiederholen Sie 3x für jede Gruppe.
3. Datenanalyse des mitochondrialen Transports und der Morphologie in kortikalen Neuronen
HINWEIS: Analysieren Sie die gesammelten Daten über den mitochondrialen Transport mit einer Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ oder MetaMorph19). Da ImageJ leicht verfügbar ist, führen Sie die Analyse des mitochondrialen Transports und der Morphologie mit ImageJ mit den Plugins MultiKymograph, Macrosund Analyze particles durch.
- Analysieren des mitochondrialen Transports mit ImageJ
- Nach der Erfassung der Zeitrafferbilder der mitochondrialen Motilität, analysieren Sie die Geschwindigkeit und Bewegung von Mitochondrien mit dem MultiKymograph Plugin. Die Bilder werden als .tiff-Format-Dateien gespeichert, die von Fidschi-Software nach einer zuvor gemeldeten Methode20analysiert werden.
- Laden Sie die Fidschi-Software herunter. Laden Sie Plugins herunter, die für die Analyse der mitochondrialen Bewegungsgeschwindigkeit von Kymographen benötigt werden. Laden Sie das Bio-Formats Package und Kymograph Plugin zusammen mit diesen vier .class Plugins herunter, einschließlich: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class und WalkingAverage.class (Table of Materials). Verschieben Sie diese Dateien in den Fidschi-Plugin-Ordner. Laden Sie die Plugins "tsp050706.txt" in den Plugins-Ordner herunter. Starten Sie die Fidschi-Software neu, wenn die Dateien in den Plugin-Ordner verschoben werden.
- Öffnen Sie Fidschi-Software. Wählen Sie Pluginsund importieren Sie dann Bilder der .tiff Serie über Bio-Formats Importer unter Bio-Formats. Stellen Sie sicher, dass Sie Standard ImageJ in der Stapelanzeigeauswählen, alle Serien öffnenauswählen, Autoskalierenaktivieren und dann auf OKklicken. Beachten Sie die Framenummer und -größe der Bilder in Pixeln, die oben im Bild angezeigt werden.
HINWEIS: Nehmen Sie 60 Bilder pro Bild. - Erwägen Sie, die Bilder klarer zu machen, indem Sie Helligkeit/Kontrast unter dem Menü Bild für alle 60 Frames anpassen.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Linienwerkzeug, um die segmentierte Linie auszuwählen und eine segmentierte Linie zu zeichnen, die vom Zellkörper aus beginnt und am Terminalaxon endet. Generieren Sie den Kymographen, indem Sie MultipleKymograph unter Pluginsauswählen. Die Auswahl der Linienbreite wird nach Auswahl des MultipleKymographsveranlasst. Stellen Sie sicher, dass es sich um eine ungerade Zahl handelt. Wählen Sie 1 für die Linienbreite aus. Nach diesem Schritt wird ein Kymograph erzeugt.
HINWEIS: Mehrere wichtige Informationen können aus dem Kymographgelesen gelesen werden. Die y-Achse des Kymographen ist die Dauerzeit (5 min) für die 60 Frames. Die x-Achse stellt die Position der ausgewählten Axone dar. - Verwenden Sie eine diagonale Linie im Kymographen, um die Bewegungsrichtung von Mitochondrien (anterograde, retrograde oder stable) zu bestimmen. Beispielsweise zeigt eine Linie, die nach rechts entlang der y-Achse geht, anterograde Bewegung an, und eine Linie, die nach links entlang der y-Achse geht, zeigt retrograde Bewegung an. Eine vertikale Linie zeigt an, dass es keine Bewegung im Mitochondrion gab.
- Messen Sie die Entfernung, Zeitwerte und Geschwindigkeit für die sich bewegenden Mitochondrien mit dem Macros-Plugin in Fidschi-Software. Gehen Sie zu Plugins | Makros | Installieren | tsp050607.txt. Zeichnen Sie eine segmentierte Linie über die Spur der mitochondrialen Bewegung auf dem Kymographen und zeichnen Sie immer die Linie vom übergeordneten zum unteren Bereich (y-Achse).
- Nachdem Sie die Linie gezeichnet haben, gehen Sie zu Plugins | Makros | Lesegeschwindigkeiten aus TL. Da eine segmentierte Linie entlang der Ablaufverfolgung gezeichnet wird, liest das Plugin segmentierte Geschwindigkeiten, die der Linie entsprechen.
HINWEIS: Die Einheit für alle Daten ist Pixel. dy sum ist die vom Startpunkt verbrauchte Zeit, und dx sum gibt den Abstand des Mitochondrions an, der sich in der x-Achse bewegt. dy now und dx zeigt nun die Periodenzeit bzw. Bewegungsabstand für jedes Segment an. Die tatsächliche Geschwindigkeit zeigt die Geschwindigkeit für jedes Segment an (jetzt dx/dy). Die durchschnittsgeschwindigkeit gibt die Durchschnittsgeschwindigkeit für die mitochondriale Bewegung an (dx summe/dy summe). - Ändern Sie nun die Einheit von dx von Pixel zu 'm als Verhältnis von Pixel in 'm, indem Sie die Skalenleiste messen. Konvertieren Sie die Einheit für den Abstand von Pixel zu 'm, indem Sie Maßstabsbalken in Bildern messen. Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie entlang der Maßstabsleiste zu zeichnen und die Länge der Linie zu messen, indem Sie Unter "Analysieren " dieOption Messen auswählen. Ändern Sie die Zeit von Pixel in Sekunden, als 1 Pixel = 5 Sekunden in diesem Experiment.
- Berechnen Sie in der Tabellenkalkulationsdatei die durchschnittliche Geschwindigkeit und beschriften Sie entsprechend retrograde oder anterograde Bewegung. Durchschnittlich die anterograde oder retrograde Bewegungsgeschwindigkeit.
- Bestimmen Sie den Prozentsatz der stationären und motilen Mitochondrien aus dem Kymographen. Die anterograde oder retrograde beweglichen Mitochondrien sind definiert als die Bewegung von 5 m vorwärts oder rückwärts vom Ursprung während des gesamten Zeitraums21. Mitochondrien gelten als stationär, wenn sie sich während der 5 min nicht mehr als 5 m bewegt haben.
- Analyse der mitochondrialen Morphologie mit ImageJ
HINWEIS: Bestimmen Sie die mitochondriale Morphologie, indem Sie die mitochondriale Länge, Fläche und das Seitenverhältnis mit ImageJ messen. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.- Um die mitochondriale Länge und Fläche innerhalb von Axonen zu analysieren, laden Sie das Straighten_.jar Plugin von der ImageJ-Website herunter (siehe Tabelle der Materialien) und verschieben Sie es in den Ordner der Plugins. Starten Sie die ImageJ-Software neu.
- Öffnen Sie das Bild über die Funktion "Öffnen" unter Datei und konvertieren Sie das 32-Bit-Bild mit Type unter Bildin 8 Bit.
- Zeichnen Sie eine segmentierte Linie entlang der Axone. Wählen Sie Richten unter Plugins und legen Sie 50 Pixel für Width of Filament/Wide Linefest. Dadurch wird ein begradigtes Axon erzeugt.
- Passen Sie den Schwellenwert unter Bild an, und legen Sie die Messung unter Analysieren fest, indem Sie "Bereich | Umfang | Fit Ellipse | Shape-Deskriptoren.
- Messen Sie die Skalenleiste mithilfe der Linienfunktion, und legen Sie die Skalierung unter Analysieren fest, indem Sie den Abstand in Pixel, den Abstandund die Längeneinheitausfüllen. Wählen Sie dann Global aus, um diese Skalierungseinstellung festzulegen.
- Verwenden Sie Partikel unter Analysieren analysieren, um den Bereich zu bestimmen. Die Eingabeaufforderungsparameter sind größe (Pixel 2) = 0,20 – unendlich, Zirkularität = 0,00–1,00 und anzeigen = Ellipsen. Wählen Sie Ergebnisse anzeigen.
HINWEIS: Die Messung liefert die Ergebnisse mehrerer mitochondrialer Morphologieparameter, einschließlich Fläche, Umfang, Länge (Haupt), Breite (geringfügig) und Seitenverhältnis (AR). Die entsprechende mitochondriale Zahl wird ebenfalls aufgeführt. - Berechnen Sie die mitochondriale Zahl pro Axon (m) mit der mitochondrialen Zahl geteilt durch die Axonallänge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier wurden menschliche iPSCs in telencephalische Glutamaterge Neuronen unterschieden, die sich durch Immunfärbung mit Tbr1- und III-Tubulin-Markern auszeichneten (Abbildung 1A). Um den axonalen Transport von Mitochondrien zu untersuchen, wurden diese Zellen mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, und es wurde eine Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt. Da ImageJ leicht verfügbar und leichter zu erhalten ist, wurde der mitochondriale Transport mit den "MultiKymograph" und "Macros" ImageJ Plugins, dargestellt in Abbildung 1,weiter analysiert.
Es gibt drei jeweilige Zustände der mitochondrialen Bewegung, einschließlich statischer, anterograder und retrogradeBewegung (Abbildung 1B,C). Ein einzelnes Mitochondrion kann statisch bleiben oder sich in anterograder oder retrograder Richtung innerhalb eines Axons bewegen, und hier wurde eine segmentierte Linie entlang der Spur der mitochondrialen Bewegung gezeichnet, um die Geschwindigkeit zu bestimmen (Abbildung 1D). Die Geschwindigkeit der mitochondrialen Bewegung entlang des Axons ist in Abbildung 1E dargestellt und entspricht den segmentierten Linien in Abbildung 1D nach dem Lesen von "Macros" in ImageJ. Ähnlich wie die MetaMorph-Software kann ImageJ verwendet werden, um die mitochondriale Geschwindigkeit und den Prozentsatz der motilen Mitochondrien auf der Grundlage des von ImageJ erzeugten Kymographen zu bestimmen (Abbildung 1F). Mit hilfe einer kommerziell verfügbaren Analysesoftware (z. B. MetaMorph) zeigten frühere Daten, dass der Anteil der motilen Mitochondrien in SPG3A-Neuronen im Vergleich zu normalen Neuronen signifikant reduziert wurde, während die Geschwindigkeit nicht verändert wurde19. Um die ImageJ-Software zu bewerten, wurde der Prozentsatz der motilen Mitochondrien untersucht, und eine ähnliche Verringerung des Prozentsatzes der motilen Mitochondrien in SPG3A-Neuronen im Vergleich zu Kontroll-Wildtyp (WT) Neuronen wurde beobachtet (Abbildung 1G).
Hinsichtlich der Analyse der mitochondrialen Morphologie wurden der mitochondriale Bereich, die Länge und ar mit der Funktion "Analyseteilchen" in ImageJ analysiert. Axons wurden mit dem "straighten" Plugin begradigt (Abbildung 2A,B). Mitochondrien wurden klar durch Anpassung des Schwellenwerts gewählt (Abbildung 2C,D). Schließlich wurden der mitochondriale Bereich, die Länge (Dur), die Breite (geringfügig), das Seitenverhältnis und der Umfang aus dem begradigten Axon mit dem Plugin "Partikel analysieren"(Abbildung 2E,F) erhalten. Abnormale mitochondriale Morphologie wurde (und wurde zuvor) in HSP iPSC-abgeleiteten telencephalischen glutamatergen Neuronen beobachtet, einschließlich SPG15-Zellen (Abbildung 2G,H,I)13,22. Sowohl die mitochondriale Länge und das Seitenverhältnis wurden bei SPG15 Neuronaxonen im Vergleich zu Denk-WT-Neuronaxonen signifikant reduziert (Abbildung 2G,H,I).
Abbildung 1: Analyse des mitochondrialen Transports mit ImageJ. (A) Immunostainierung zeigt die Erzeugung von telenzephalen glutamatergen Neuronen. Tbr1 (rot), Iii Tubulin (grün) und Hoechst (blau). Skalenbalken = 50 m. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Studie19geändert. (B) Mitochondrialer Transport innerhalb von Axonen von Neuronen. Anterograde mitochondriale Bewegung ist definiert als die Mitochondrien, die sich vom Zellkörper zum distalen Axon bewegen, und retrograde mitochondriale Bewegung stammt aus dem distalen Axon und erstreckt sich auf den neuronalen Zellkörper. Die Segmentlinie wird entlang von Axonen vom neuronalen Zellkörper zum distalen axonalen Terminal gezogen, um Kymographen zu erzeugen. (C) Kymograph wird mit ImageJ erzeugt; x-Achse ist die axonale Position und y-Achse ist Zeit. Eine durchgehende weiße Linie ist das Mitochondrion, das sich in anterograde Richtung (rosa Pfeilspitze), retrograde Richtung (blaue Pfeilspitze) oder statisch (gelbe Pfeilspitze) bewegt. (D) Die segmentierte Linie wird gezeichnet, um die Geschwindigkeit mit dem Macros-Plugin zu lesen. Die Zahlen 1–8 beschreiben das Segment der Zeile. Anterograde-Bewegung (1–4, 6, 8) und statischer Zustand (5, 7) können von diesem vergrößerten Kymographen unterschieden werden. (E) Zeit und Bewegungsabstand für jedes Segment, tatsächliche und durchschnittliche Geschwindigkeit (in Pixel). (F) Kymograph des mitochondrialen Transports für WT und SPG3A kortikale PNs mit ImageJ. Skala bar = 10 m. (G) Motile mitochondriale Verhältnis in WT und SPG3A kortikale PNs mit ImageJ (*p < 0.05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Analysieren der mitochondrialen Morphologie mit ImageJ. (A) Parameter zum Richten des Axons. (B) Der Vertreter begradigte Axon. (C,D) Anpassung der Schwelle zur Wahl mitochondrien. (E,F) Die gemessene mitochondriale Fläche, Umfang, Länge (Dur), Breite (geringfügig) und Seitenverhältnis (AR) entsprechend den ausgewählten Mitochondrien in (E). (G) Repräsentative Bilder von Mitochondrien in WT und SPG15 telencephalic glutamatergen Neuronen. Skalenstäbe = 20 m (H) Mitochondriale Länge in WT und SPG15 Neuronen. (I) Seitenverhältnis von Mitochondrien in WT und SPG15 Neuronen. **p < 0,01 vs. WT. (G), (H) und (I) werden aus einer früheren Studie13geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Fluoreszierende Werkzeuge | Vorteile | Nachteile | Verweise |
| MitoTracker | MitoTracker ist mitochondrial potenzialunabhängig und kann verwendet werden, um die Kolokalisierung von Mitochondrien mit Autophagosom oder Lysosom zu analysieren. | MitoTracker ist nicht fotoierbar genug für langfristige Forschung. | 35 |
| NPA-TPP | Dieser Farbstoff ist ein neuartiges fotoattables mitochondriales Etikettierungsreagenz. | Der Synthese- und Reinigungsprozess dieses Farbstoffs ist zeitaufwändig und kostspielig. | 23 |
| MitoBADY | Dieser Farbstoff kann für die mitochondriale Visualisierung mit Raman-Mikroskopie mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität verwendet werden. | Für die Verwendung dieses Farbstoffs ist ein Raman-Mikroskop erforderlich. | 25 |
| TMRE | Dieser Farbstoff ist ein ungiftiger, spezifischer mitochondrialer Färbefarbstoff mit geringer Konzentration und ohne Abschrecken. | Die TMRE-Etikettierung mitochondrien hängt vom mitochondrialen Membranpotenzial ab. | 36, 37 |
| Mitochondrien-gezielte fluoreszierende Proteine | Mitochondrien-gezielte fluoreszierende Proteine sind spezifischer und stabiler. | Diese Methode erfordert Transfektion und Transfektion Effizienz ist für verschiedene Zelltypen unterschiedlich. | 38, 39 |
Tabelle 1: Vor- und Nachteile einiger fluoreszierender Werkzeuge für die mitochondriale Etikettierung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Analyse des mitochondrialen Transports und der Morphologie in neuronalen Axonen mit rotem Fluoreszenzfarbstoff und ImageJ-Software, die beide eine einzigartige Plattform zur Untersuchung der axonalen Degeneration und der mitochondrialen Morphologie bei neurodegenerativen Erkrankungen bieten. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll, einschließlich der Färbung von Mitochondrien, Live-Zell-Bildgebung, und die Analyse der Bilder. Bei dieser Methode wurde ein fluoreszierender Farbstoff verwendet, um Mitochondrien zu färben. Da menschliche iPSC-abgeleitete Neuronen leicht von der Schale gelöst werden können, ist es wichtig, eine Lösung in der Schale zu lassen und sanft neurobasales Medium hinzuzufügen. Die Wäsche kann drei- oder viermal durchgeführt werden, um den Farbstoff zu entfernen. Darüber hinaus können Mitochondrien mit anderen Reportern gekennzeichnet werden, um ihren Transport entlang von Axonen zu messen, wie z. B. fluoreszierendes Protein, das mitochondrien für Proteine6kodiert. Bei der Langzeitverfolgung zeigten mehrere Sonden (d.h. NPA-TPP, 2,1,3-Benzothiadiazol [BTD] fluoreszierende Derivate und eine spezifische Raman-Sonde) ein großes Potenzial in der langzeit-mitochondrialen Tracking- und mitochondrialen Dynamikanalyse23,24,25. Die Vor- und Nachteile verschiedener Sonden finden sich in tabelle 1.
Nach der mitochondrialen Färbung wird die Live-Zell-Bildgebung mit einem Mikroskop durchgeführt, das mit einem Inkubator ausgestattet ist. Um die Neuronen während der Bildgebung effektiv zu fokussieren, sollten neuronale Proben im 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 und in einer feuchten Umgebung für mindestens 15 min aufbewahrt werden. Um die Out-of-Fokus-Effekte zu minimieren, können Bilder an verschiedenen Z-Positionen zu einem Z-Stack oder zur Autofokusfunktion verwendet werden. Wichtig ist, um die Richtung des mitochondrialen Transports (anterograde oder retrograde) zu identifizieren, werden Phasenbilder genommen, um den neuronalen Zellkörper und Axone zu unterscheiden. Ein weiteres kritisches Problem ist das Photobleichen von fluoreszierenden Proben, die verhindert werden müssen, um effiziente zeitraffische Zeitrafferbilder für den mitochondrialen Transport zu erhalten. Eine effektive Methode zur Minimierung der Photobleaching besteht darin, Proben durch das Okular zu fokussieren und alle bildgebenden Parameter unter dem Phasenkanal einzustellen, mit Ausnahme der Belichtungszeit. Darüber hinaus kann das automatische Skalierungsmuster die Photoebleiche der Fluoreszenz verringern.
Mitochondrien sind hochdynamische Organellen und können sich sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen bewegen. In Neuronen bleiben einige Mitochondrien innerhalb von Axonen während der Aufnahme stationär. Unter den sich bewegenden Mitochondrien kann der Bewegungsstatus im Laufe der Zeit variieren. Dieses Phänomen wirft die wichtige Frage auf, welcher Mitochondrientyp als stationär oder bewegend gilt. Dies kann durch Festlegen des Schwellenwerts während der mitochondrialen axonalen Transportanalyse behoben werden. Um die statischen Mitochondrien zu unterscheiden, verwendeten Neumann et al. das mitochondriale Gleiszentrum, das als Mittelwert seiner Positionskoordinaten im Laufe der Zeit definiert ist, und setzten dann den Schwellenwert auf 350 nm/s, so dass der maximale Abweichungsabstand des Mitochondrions von seinem Gleiszentrum im ersten Frame26liegt. In einer anderen Studie setzten die Autoren 50 nm/s als Schwelle fest, um den stationären Status vom bewegungsweichen Status27zu unterscheiden. Hier wurde ein Schwellenwert von 300 nm/s verwendet, um den mikrotubulierbasierten Transport wie in früheren Berichten28,29zu unterscheiden. Obwohl die Schwelle für stationäre und bewegliche Mitochondrien unterschiedlich ist, kann die Festlegung der Schwelle wichtige relative Informationen über die mitochondriale Bewegung innerhalb von Axonen zwischen wildtypen und degenerativen Neuronen liefern.
Die meisten Protokolle, die mitochondriale Transportanalyse haben Kymogramme verwendet, die zweidimensionale Darstellung von Positionen im Vergleich zur Zeit sind. Für die Analyse der Partikelverfolgung wurden mehrere automatisierte Werkzeuge entwickelt26,30,31,32,33,34. Diese können jeden Rahmen genau trennen. Zusätzlich zu der Geschwindigkeit und dem Motilprozentsatz, den ImageJ messen kann, kann diese Methode motile Ereignisse genau messen. Diese sind jedoch nicht kostenlos zu verwenden. Hier wurde die Analyse des mitochondrialen Transports mit ImageJ mit den Plugins "Multikymograph" und "Macros" durchgeführt. Diese Plugins können effektiv mitochondriale Bewegung messen. Der Vorteil dieser Plugins ist ihre Benutzerfreundlichkeit und die Fähigkeit, Veränderungen im mitochondrialen axonalen Transport in Form von Kymographen und Geschwindigkeit im Laufe der Zeit anzuzeigen.
Motile Mitochondrien wurden in SPG3A und Kontrollneuronen analysiert. Eine ähnliche Verringerung des Prozentsatzes der motilen Mitochondrien wurde mit zwei verschiedenen Analysemethoden beobachtet, was die Nützlichkeit von ImageJ zur Analyse des axonalen Transports bestätigte. Darüber hinaus kann die mitochondriale Morphologie mit dem gleichen Satz von Bildern analysiert werden, was wichtige Auslesungen für das Studium der mitochondrialen Dysfunktion bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen bietet. Da axonale Degeneration und mitochondriale Dysfunktion in der Regel in früheren Stadien auftreten, bevor Neuronen sterben, kann diese Methode verwendet werden, um frühe pathologische Veränderungen zu untersuchen, um molekulare Pfade und Siebtherapeutika zu identifizieren, um zu retten Neurodegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Spastic Paraplegia Foundation, der Blazer Foundation und der NIH (R21NS109837) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
