Summary
הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.
Abstract
נוירונים יש דרישות אינטנסיבי לאנרגיה גבוהה על מנת לתמוך בתפקודים שלהם. לקויי הובלה מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים נצפתה בנוירונים אנושיים, אשר עשויים לתרום נוירוניוון במצבי מחלה שונים. למרות שהוא מאתגר לבחון דינמיקה מיטוכונדריאלי בעצבים אנושיים חיים, תפיסות כאלה הן קריטיות ללימוד התפקיד של המיטו, בניוון שחור. המתואר כאן הוא פרוטוקול לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה מיטוכונדריאלי בתאי המוח המוחזקים שמקורם האדם המושרה pluripotent תאים גזע (. IPSCs מובחנים לתוך הנוירונים telencephalic glutamatergic באמצעות שיטות מבוססות היטב. המיטוטור של הנוירונים מוכתם עם MitoTracker CMXRos, ותנועה מיטוכונדריאלי בתוך האקסונים נלכדים באמצעות מיקרוסקופ לחיות הדמיה מצויד בחממה לתרבות התא. תמונות בזמן קפיצה מנותח באמצעות תוכנה עם "MultiKymograph", "היבואן Bioformat", ו "מאקרו" תוספים. הקייגרפים של תחבורה מיטוכונדריאלי מופקים, ומהירות מיטוכונדריאלי ממוצעת בכיוונים המודרכים והנסיגה מקריאה מהקימוגרף. בנוגע לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלי, אורך מיטוכונדריאלי, אזור ויחס גובה-רוחב מתקבלים באמצעות ImageJ. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של המבנה שלהם כדי להקל על מחקרים של מחלות ניווניות.
Introduction
תנועתיות מיטוכונדריאלי והפצה ממלאים תפקיד חיוני במילוי הדרישות האנרגטיות המיוחדות בנוירונים מקוטטים. נוירונים יכולים להאריך אקסונים ארוכים מאוד כדי להתחבר עם מטרות דרך היווצרות של הסינפסות, אשר דורשים רמות גבוהות של אנרגיה עבור Ca2 + אגירה וזרמים יון. תחבורה של המיטו, מ סומה כדי אקסון הוא קריטי לתמיכה בתפקוד אקסון ו סינפטית של נוירונים. התנועה מיטוכונדריאלי דינמי באופן זמני מתנהל על ידי הובלה סיבי מהירה בשיעורי מיקרומטר מספר1לשנייה.
במיוחד, חלבונים מוטוריים או מתאם, כגון קינזין ו dynein, להשתתף בתחבורה ארגונית מהירה לאורך microtubules לשלוט על התנועה שלהמיטומטר 2,3. פעילות עצבית נורמלית דורשת העברה נאותה של המיטו, החדשים מתוך הנוירואליות החדשה (הובלה אקסון) והעברה הפוכה של המיטוטרים מן המרוחק בחזרה אל גוף התא (הובלה רטרוגרדית). מחקרים שנעשו לאחרונה ציינו כי הקצאת מיטוכונדריאלי לא ראויה קשורה בחוזקה עם פגמים עצביים ומחלות ניווניות תא מנוע4,5. לכן, כדי לנתח את התפקיד של המיטו, בניוון נוירולוגי, חשוב להקים שיטות לבדיקת תנועה מיטוכונדריאלי לאורך האקסונים בתרבויות חיות.
ישנם שני אתגרים עיקריים בבדיקת וניתוח מעקב אחר המיטו, (1) זיהוי המיטוטרים מהרקע בכל מסגרת, ו (2) ניתוח ויצירת הקשרים בין כל מסגרת. בפתרון האתגר הראשון, גישה תיוג פלואורסצנטית משמש באופן נרחב כדי להבחין המיטומטר מן הרקע, כגון מיטואו לצבוע או העברה של מיטוכונדריזה של התמזגו פלואורסצנטי (למשל, mito-gfp)6,7,8. לניתוח הקשר בין מסגרות, מספר אלגוריתמים וכלי תוכנה תוארו במחקרים קודמים9. בעיתון האחרון, החוקרים לעומת ארבעה כלים אוטומטיים שונים (למשל, Volocity, Imaris אריס, wrMTrck, וההבדל עוקב) כדי לכמת הובלה מיטוכונדריאלי. התוצאות הראו כי למרות אי-התאמות באורך המסלול, העקירה מיטוכונדריאלי, משך התנועה, ומהירות, אלה כלים אוטומטיים מתאימים להערכת הפרשי התחבורה לאחר הטיפול10. בנוסף לכלים אלה, תוסף משולב "מאקרו" עבור ImageJ (נכתב על ידי Rietdorf ו-Seitz) נעשה שימוש נרחב לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי11. שיטה זו מייצרת קימוגרפים שניתן להשתמש בהם לניתוח תנועה מיטוכונדריאלי, כולל מהירות בכיוונים כוללים וכיווני נסיגה.
מיטוכונמיטוa הם אורגלות דינמיות ביותר, שמשתנים באופן קבוע במספר ובמבנה מתוך תגובה לתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ביקוע מיטוכונדריאלי והיתוך בחוזקה להסדיר מורפולוגיה והומאוסטזיס. חוסר האיזון בין ביקוע מיטוכונדריאלי ופיוז'ן יכול לגרום לרשתות מיטוכונדריאליות קצרות או ארוכות במיוחד, שיכולות לפגוע בתפקוד מיטוכונדריאלי ולגרום לפעילות עצבית חריגה וניוון עצבי. הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, ו מצנח העיוותים תורשתי (hsp)12,13,14,15. Hsp היא קבוצה הטרוגנית של הפרעות נוירולוגיות תורשתית המאופיינת הניוון של corticospinal בדרכי והכשל הבאים לשלוט שרירי הגפיים התחתונות16,17. במחקר זה, הנוירונים הנגזרות iPSC מראש משמשים להערכת הובלה מיטוכונדריאלי מורפולוגיה ב HSP. שיטה זו מספקת פרדיגמה ייחודית לבדיקת דינמיקה מיטוכונדריאלי של האקאונים העצביים בתרבויות חיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הדור של נוירונים telencephalic glutamatergic מ iPSCs
הערה: הפרוטוקול המפורט לשמירת iPSCs והבידול שלהם לתוך הנוירונים telencephalic glutamatergic דומים לאלה שתוארו בעבר18. כאן, התהליך הקריטי במהלך הבידול של תאי גזע האדם רב עוצמה מוצג ומודגש.
- תרבות iPSCs על העכבר מעובריים מתחלקים (MEF) מזינים בתא גזע האדם העובריים (hESC) בינונית בתוספת עם גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ (bFGF, 4 ng/mL).
- לאחר דגירה עם dispase (1 מ"ג/mL) עבור 3 דקות, הנתק את iPSCs לתוך גושים קטנים. לאחר מכן, התרבות האגרגטים של iPSC בהשעיה במדיום hESC במשך 4 ימים. עיין בנקודת זמן זו, כאשר iPSCs מתחילות כתרבות ההשעיה, כיום 1 (D1). לשנות את המדיום מדי יום במשך 4 ימים.
- ב D5, לאסוף את האגרגטים iPSC לאחר צנטריפוגה ב 200 x g עבור 2 דקות ותרבות השראה עצבית מדיה (נים) במשך 3 ימים. התרבות מאגרגטים את התא בהשעיה במשך 3 ימים על ידי שינוי מחצית התקשורת כל יומיים. הוסף DMH-1 (2 μM) ו SB431542 (2 μM) כדי מדיום נים כדי להגדיל את יעילות האינדוקציה העצבית.
- ב D8, לאסוף את האגרגטים iPSC לאחר צנטריפוגה ב 200 x g עבור 2 דקות ולתת להם לדבוק 6 טוב צלחות (סביב 20 – 30 אגרגטים לכל טוב של הצלחת) על ידי CULTURING ב נים עם 10% fbs (או עם צלחות מצופה למינציה) לילה. ביום שלמחרת, להסיר את המדיום הישן ולשנות ל נים כל 2 ימים עד D17.
הערה: הדור של תאים נוירואפיתל, אשר מצוין על ידי היווצרות של תאים טורי עם מבנים שושנת, הוא נצפתה בתקופה זו. - בשעה D17, לבודד מכנית את התאים הנוירואפיתל במרכז המושבות (הסרת ישירות על ידי הפעלת לחץ קטן למרכז המושבות) או אנזימטי (מטופלים עם dispase). להעביר את התאים נוירואפיתל מבודדים לתרבות רקמה שאינה מטופלת T25 תרמוס המכיל 8 מ ל נים עם תוספת של B27 (1x), מחנה (1 μM), ו IGF (10 ng/mL).
הערה: התרבות ההשעיה מאפשרת תאים ליצור נוירוספירות המועשרת עם ושלתי עצביים עצבית. - לאחר D35, צלחת הנוירוספירות על פולי האורלים ו LDEV-מופחתת הצמיחה מופחת מטריצת ממברנה מטריצה (טבלה של חומרים)-מצופה 35 מ"מ זכוכית מנות התחתון כדי לייצר נוירונים telencephalic glutamatergic (הקרנת קליפת המוח נוירונים). לפני ציפוי, הנתק את הנוירוספירות לאשכולות קטנים על ידי הדגירה עם 1 mg/mL הניתוק התא פתרון עבור 2 דקות ב 37 ° c.
- הסר את פתרון הניתוק התא על-ידי צנטריפוגה והשהה מחדש 1 mL של בידול עצבי בינוני (NDM). תאים לוחית על המנה התחתונה זכוכית (סביב חמישה אשכולות ב 100 μL של בינוני לכל מנה) כדי לתת להם לצרף. לאחר מכן, להוסיף NDM (1 מ"ל לכל מנה) ותרבות התאים ב-NDM המכיל B27 (1x), מחנה (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL), ו GDNF (10 ng/mL).
הערה: אשכולות קטנים מצופים כי הם שורדים היטב ולתת נוירונים הקרנה ארוכה. לחילופין, תאים יכולים להיות מנוכה ומצופה בצפיפות סביב 20,000 תאים לכל מנה עבור הפרדה טובה יותר. - אפיון הנוירונים telencephalic glutamatergic על ידי חיסוני מכתים את Tbr1 ו βIII טובולין סמנים.
2. בחינת הובלה מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים של נוירונים telencephalic glutamatergic
- לחמם את NDM ולהפעיל את החממה עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטית להגדיר ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- כדי להמחיש את המיטו, לאורך אקסונים של נוירונים במוח מוקדם, דגירה של הנוירונים עם 50 ננומטר לצבוע בצבעי פלורסנט אדום כדי כתם המיטומטר בתאים חיים (למשל, mitotracker cmxros) ב ndm עבור 3 דקות ב 37 ° c. לאחר מכן, שטוף תאים 2x עם החמם NDM. הנוירונים מודבטים ב-NDM.
- על מנת להקליט את ההובלה היטוכונדריאלי לאורך האקסונים, לקחת תמונות בזמן הקפיצה של תנועה מיטוכונדריאלי באמצעות מטרה 40x עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית.
הערה: כדי לייצב את התרבות, בצע את הדמיה של התא החי כאשר התאים מודבטים בחממה עבור 20 דקות של כתמים מיטוכונדריאלי לאחר. - תחת שדה שלב, לזהות את אקסונים מבוסס על מאפיינים מורפולוגיים (ישירות לצאת מהגוף הגוף העצבי, ארוך דק מאוד neurites ללא הסתעפות). המיטוa מהלך בתוך כיתה (מתא הגוף לתוך המחשב המרוחק) וכיווני נסיגה (ממסוף axon לגוף התא). כדי להבדיל בין הכיוון של תנועה מיטוכונדריאלי לאורך axons, לזהות בבירור את גופי התא של נוירונים. בשלב זה, למקד אקסונים תחת שדה שלב כדי להפחית את הלבנת התמונות.
- לאחר הבחנה את גוף התא ואת axon, להתאים את זמן חשיפה ומיקוד של המיטו, באקסונים. לאחר מכן, ללכוד את ההובלה של המיטו, בתוך אקסונים כל 5 s עבור משך כולל של 5 דקות, מניב 60 מסגרות. לכוד באופן אקראי לפחות חמישה מיקומים עבור כל מנה וחזור על 3x עבור כל קבוצה.
3. ניתוח נתונים של הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בנוירונים
הערה: לנתח את הנתונים שנאספו על הובלה מיטוכונדריאלי באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (למשל, ImageJ או התמרה19). מאחר ImageJ זמין בקלות, בצע ניתוח של הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה באמצעות ImageJ עם Multikymograph, פקודות מאקרו וניתוח תוספים של חלקיקים.
- ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי באמצעות ImageJ
- לאחר לכידת תמונות הזמן מעידה של תנועתיות מיטוכונדריאלי, לנתח את המהירות ואת התנועה של המיטו, באמצעות תוסף Multikymograph . התמונות נשמרות כקבצי תבנית. tiff, שנותחו על-ידי תוכנת פיג'י בעקבות שיטה20שדווחה קודם לכן.
- הורד את תוכנת פיג'י. הורד תוספים כי יהיה צורך לנתח מהירות הנעה מיטוכונדריאלי מ kymographs. הורד את חבילת ביו-פורמטים ואת התוסף kymograph יחד עם ארבעת אלה תוספים . Class , כולל: ריבוב, מחלקה, ריבוב. class, הפרש stackdifference class, ו WalkingAverage. class (רשימת חומרים). העבר קבצים אלה לתיקיית התוספים של פיג'י. הורד "tsp050706. txt" תוספים לתיקיה התוספים. הפעל מחדש את התוכנה של פיג'י כאשר הקבצים מועברים לתיקיית התוספים.
- פתח את תוכנת פיג'י. בחר תוספים, ולאחר מכן לייבא תמונות של סדרת. tiff באמצעות ביוגרפיה בפורמטים יבואן תחת תבניות ביו. הקפידו לבחור באפשרות ' ImageJ סטנדרטי ' בתצוגת אוסף, בחרו ' פתח את כל הסדרות', בידקו את ' קנה מידה אוטומטי' ולחצו על ' אשר'. שימו לב למספר המסגרת ולגודל התמונות בפיקסלים, המוצגים בחלק העליון של התמונה.
הערה: קח 60 מסגרות לכל תמונה. - שקול להפוך את התמונות ברורות על ידי התאמת בהירות/ניגודיות תחת תפריט תמונה עבור כל 60 מסגרות.
- לחצו לחיצה ימנית על כלי השורה כדי לבחור קו מקוטע וציירו קו מקוטע החל מגוף התא ומסתיימת ב-axon המסוף. צור את הקימוגרף על-ידי בחירת ריבוב מתחת לתוספים. בחירת רוחב הקו מוצגת לאחר בחירת ריבוב. ודא שזהו מספר אי-זוגי. בחר 1 עבור רוחב הקו. לאחר שלב זה נוצר קימוגרף.
הערה: ניתן לקרוא מספר פיסות מידע חשובות מתוך הקימוגרף. ציר y של kymograph הוא זמן המשך (5 דקות) עבור 60 מסגרות. ציר ה-x מייצג את מיקומו של האקסונים שנבחרו. - השתמש בקו אלכסוני ב-kymograph כדי לקבוע את כיוון התנועה של המיטואים (כיתה, נסיגה, או יציב). לדוגמה, שורה היורדת לימין לאורך ציר-y מציינת תנועה של כיתה, ושורה היורדת לשמאל לאורך ציר-y מצביעה על תנועת נסיגה. קו אנכי מצביע על כך שאין תנועה במיטופיוטס.
- למדוד את המרחק, ערכי זמן, ומהירות עבור המיטו, המעבר באמצעות תוסף פקודות מאקרו בתוכנת פיג'י. עבור לתוספים | פקודות מאקרו | התקנת | tsp050607. txtלצייר קו מקוטע על העקבות של תנועה מיטוכונדריאלי על kymograph, ותמיד למתוח את הקו מן העליון לאזור נחות (y-ציר).
- לאחר ציור הקו, עבור לתוספים | פקודות מאקרו | קרוא את המהירויות של כפית. מאז קו מקוטע לאורך העקבות מצויר, התוסף קורא המהירויות מקוטעת המתאימים לקו.
הערה: היחידה עבור כל הנתונים היא פיקסלים. dy sum הוא הזמן הנצרך מנקודת ההתחלה, וסכום dx מציין את מרחק המיטו, הנעים בציר ה-x. dy עכשיו ו-dx מציג כעת את זמן התקופה ואת מרחק התנועה עבור כל קטע, בהתאמה. מהירות בפועל מראה את המהירות עבור כל פלח (dx עכשיו/dy עכשיו). מהירות ממוצעת מציינת את המהירות הממוצעת למעבר מיטוכונדריאלי (סכום dx/dy sum). - שינוי יחידת dx כעת מפיקסל ל-יקרומטר כיחס של פיקסל ב-יקרומטר על-ידי מדידת סרגל הסרגל. המר את היחידה למרחק מפיקסל ל- יקרומטר על-ידי מדידת פסי קנה מידה בתמונות. השתמש בכלי קו כדי לצייר קו לאורך הסרגל סרגל ולמדוד את אורך הקו על ידי בחירת מדידה ' תחת "לנתח. שנה את השעה מפיקסל לשניות, כמו 1 פיקסל = 5 שניות בניסוי זה.
- בקובץ הגיליון האלקטרוני, לחשב את המהירות הממוצעת בהתאמה לנסיגה תווית או תנועה במקביל. ממוצע כיתות הכיוון או מהירות התנועה הרטרוגרדית.
- לקבוע את האחוז של המיטוגרפים מורצפת מתוך kymograph. כיתות הכיוון או המיטומטר הנעות מוגדרים כמעבר 5 יקרומטר קדימה או אחורה מהמקור במהלך התקופה כולה21. המיטומטר נחשבים נייחים אם הם לא זזים יותר 5 יקרומטר במהלך 5 דקות.
- ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלי באמצעות ImageJ
הערה: קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת אורך, אזור ויחס גובה מיטוכונדריאלי באמצעות ImageJ. לשם כך, בצע את השלבים שלהלן.- על מנת לנתח את אורך ואזור מיטוכונדריאלי בתוך axons, להוריד את Straighten_. jar התוסף מאתר imagej (ראה טבלת חומרים) ולהעביר אותו לתיקיה של תוספים. הפעל מחדש את תוכנת ImageJ.
- פתח את התמונה באמצעות הפונקציה open תחת הקובץ והמר את התמונה 32 bit ל-8 סיביות באמצעות הסוג תחת תמונה.
- ציירו קו מקוטע לאורך האקסונים. בחר ' יישר תחת תוספים ' והגדר 50 פיקסלים לרוחב של קו להט/רוחב. . זה ייצור מגוון
- כוונן את הסף תחת התמונה והגדר את המדידה תחת ניתוח באמצעות בחירת "שטח | היקף | אליפסה מתאימה | מתארי צורה.
- מדדו את סרגל קנה המידה באמצעות הפונקציה line וקבעו את קנה המידה תחת ניתוח על-ידי מילוי המרחק בפיקסל, דע מרחק ויחידת אורך. לאחר מכן, בחרו ' כללי ' לקביעת הגדרת קנה המידה.
- השתמש בנתח חלקיקים תחת ניתוח כדי לקבוע את האזור. פרמטרי הבקשה הם גודל (פיקסל ^ 2) = 0.20 – אינסוף, מעגליות = 0.00 – 1.00, ולהציג = אליפסות. בחר תוצאות תצוגה.
הערה: המדידה תניב את תוצאות הפרמטרים של מורפולוגיה מרובה מיטוכונדריאלי, כולל שטח, מטרים, אורך (מרכזי), רוחב (מינורי) ויחס גובה-רוחב (AR). מספר מיטוכונדריאלי המקביל מופיע גם הוא. - חישוב מספר מיטוכונדריאלי לכל אקסון (μm) באמצעות מספר מיטוכונדריאלי המחולק באורך של אקסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, האדם iPSCs היו מובחנים לתוך telencephalic glutamatergic נוירונים, אשר התאפיין בהכתמים חיסוני עם Tbr1 ו βIII טובולין סמנים (איור 1א). כדי לבחון את התחבורה האקונלית של המיטו, תאים אלה היו מוכתמים בצבע פלורסנט אדום, והדמיה זמן בוצע. מאז ImageJ הוא זמין וקל להשגה, הובלה מיטוכונדריאלי היה מנותח עוד עם "MultiKymograph" ו "מאקרו" התוספים ImageJ, המוצג באיור 1.
ישנם שלושה מצבים של תנועה מיטוכונדריאלי, כולל סטטי, כיתה ותנועה רטרוסטטית (איור 1ב, ג). מיטוכונדריאל אחד יכול להישאר סטטי או לנוע בכיוון האנטרוכיתה או נסיגה בתוך האקסון, וכאן, קו מקוטע נמשך לאורך המסלול של תנועה מיטוכונטאלי כדי לקבוע מהירות (איור 1ד). המהירות של תנועה מיטוכונדריאלי לאורך האקסון מוצגת באיור 1E ומתאימה לקווים המקודקים באיור 1ד לאחר קריאה על-ידי "פקודות מאקרו" ב-imagej. בדומה לתוכנת התמרה, ImageJ ניתן להשתמש כדי לקבוע את מהירות מיטוכונדריאלי ואחוזי המיטוגרפים מבוסס על kymograph שנוצר על ידי ImageJ (איור 1F). באמצעות תוכנת ניתוח מסחרית זמין (למשל, התמרה), הנתונים הקודמים הראו כי אחוז של נעים המיטוa היה מופחת באופן משמעותי בנוירונים SPG3A לעומת נוירונים נורמלי, בעוד מהירות לא שונתה19. כדי להעריך את התוכנה imagej, את האחוז של נעים המיטוa נבדק, ואת הפחתה דומה באחוז של המיטו, מורצפת ב SPG3A נוירונים לעומת שליטה פראי סוג (WT) נוירונים נצפתה (איור 1G).
לגבי ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלי, אזור מיטוכונדריאלי, אורך, ו AR נותחו באמצעות הפונקציה "לנתח חלקיקים" ב-ImageJ. Axons התיישר באמצעות תוסף "ליישר" (איור 2א, ב). המיטו, נבחרו באופן ברור על ידי התאמת הסף (איור 2C, D). לבסוף, אזור מיטוכונדריאלי, אורך (מרכזי), רוחב (מינורי), יחס גובה-רוחב והיקף התקבלו מהאקסון הקבוע באמצעות התוסף "ניתוח חלקיקים" (איור 2E, F). מורפולוגיה מיטוכונדריאלי לא נורמלית היה (ובעבר היה) נצפתה hsp ipsc-נגזר telencephalic glutamatergic נוירונים, כולל תאים SPG15 (איור 2G, H, אני)13,22. הן אורך מיטוכונדריאלי והן יחס הרוחב הופחתו באופן משמעותי ב-SPG15 הנוירונים לעומת שליטה בנוירונים (באיור 2G, H, I).
איור 1: ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי באמצעות ImageJ. (א) חיסוני מראה את הדור של נוירונים telencephalic glutamatergic. Tbr1 (אדום), βIII טובולין (ירוק), והואכסט (כחול). קנה מידה של סרגלים = 50 μm. דמות זו שונתה ממחקר הקודם19. (ב) הובלה מיטוכונדריאלי בתוך אקסונים של נוירונים. תנועת מיטוכונדריאלי של אנטרוכתה מוגדרת בתור המיטוטרים מגוף התא ועד להאקאקסון, ותנועת מיטוכונדריאלי מעוברת מגיעה מהסיווג המרוחק ומתרחבת לגוף התאים העצבי. קו הקטע מצויר לאורך אקסונים מגוף התאים העצבי לטרמינל המרוחק כדי ליצור kymographs. (ג) kymograph נוצר באמצעות imagej; ציר x הוא המיקום הסיבי וציר-y הוא הזמן. קו לבן רציף אחד הוא המיטו, הנעים בכיוון כיוון התנועה (ראש חץ ורוד), כיוון נסיגה (ראש חץ כחול) או מצב סטטי (ראש חץ צהוב). (ד) קו מקוטע נמשך כדי לקרוא את המהירות באמצעות תוסף פקודות מאקרו. מספרים 1 – 8 לתאר את הקטע של הקו. התנועה באנטרוכיתה (1 – 4, 6, 8) והמצב הסטטי (5, 7) ניתן להבדיל מתוך kymograph מוגדל זה. (ה) זמן ומרחק נעים עבור כל פלח, מהירות בפועל וממוצע (בפיקסלים). (ו) kymograph של הובלה מיטוכונדריאלי עבור WT ו SPG3A קורטיקלית היקפית באמצעות imagej. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (G) יחס מיטוכונדריאלי Motile ב WT ו SPG3A קורטיהיקפית באמצעות ImageJ (* p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלי באמצעות ImageJ. (א) פרמטרים ליישור האקסון. (ב) הנציג הישרו את האקסון. (ג,ד) התאמת הסף לבחור המיטו,. (E,F) אזור מיטוכונדריאלי הנמדד, היקף, אורך (מרכזי), רוחב (מינורי) ויחס גובה-רוחב (AR) המתאים למיטומטר שנבחרו (E). (G) תמונות מייצגות של המיטוגרם ב WT ו SPG15 telencephalic glutamatergic נוירונים. סולם ברים = 20 μm. (H) אורך מיטוכונדריאלי ב WT ו SPG15 נוירונים. (I) יחס הגובה של המיטו, ב WT ו SPG15 נוירונים. * *p < 0.01 לעומת WT. (ז), (ח), ו (I) משתנים ממחקר קודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| כלי פלורסנט | יתרונות | חסרונות | פניות |
| מיטאוגשש | MitoTracker הוא מיטוכונדריאלי פוטנציאל עצמאי, והוא יכול לשמש כדי לנתח את הלוקליזציה של המיטו, עם אוטומטי או lysosome. | . למחקר לטווח ארוך | 35 |
| NPA-TPP | הצבע הזה הוא הרומן מיטוכונדריאלי החדשניים תיוג מגיב. | תהליך הסינתזה והטיהור של הצבע הזה הוא זמן רב ויקר. | 23 |
| מיטואדי | ניתן להשתמש בצבע זה להדמיה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופ ראמאן עם רגישות גבוהה וספציפיות. | השימוש בצבע זה דורש מיקרוסקופ ראמאן. | 25 |
| מיכל העצמאות | הצבע הזה הוא לא רעיל, הצבע מיטוכונדריאלי ספציפי לצבוע עם ריכוז נמוך ללא השפעה מקוצ'ינג. | TMRE תיוג מיטוכונדריא תלוי בפוטנציאל הממברנה המיטומיטוכונאלי. | 36, 37 |
| המיטו, חלבונים פלורסנט ממוקד | המיטו, חלבונים פלורסנט ממוקד יותר ספציפיים ויציבים. | שיטה זו זקוקה ליעילות של העברה והעברה שונה עבור סוגי תאים שונים. | 38, 39 |
טבלה 1: יתרונות וחסרונות של כמה כלי פלורסנט עבור תיוג מיטוכונדריאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בדפוס עצבי באמצעות צבע פלורסנט אדום ותוכנת imagej, שניהם מספקים פלטפורמה ייחודית לחקר ניוון אקסונים ומורפולוגיה מיטוכונדרילית במחלות ניווניות. קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, כולל כתמים של המיטו, הדמיה של תאים חיים וניתוח התמונות. בשיטה זו, צבע פלורסנט שימש כדי להכתים מיטוכונמיטוa. כיוון שהנוירונים האנושיים הנגזרים מנותקת בקלות ממנה, חשוב להשאיר פתרון כלשהו בצלחת ולהוסיף בעדינות את המדיום הנוירו-בסיס. ניתן לבצע את הכביסה שלוש או ארבע פעמים כדי להסיר את הצבע. בנוסף, המיטומטר יכול להיות מתויג עם כתבים אחרים כדי למדוד את ההובלה שלהם לאורך axons, כגון חלבון פלורסנט התמזגוהמיטומטרמיקוד חלבונים 6. במעקב ארוך טווח, מספר בדיקות (כלומר, npa-tpp, 2, 1, 3-benzothiadiazole [btd] נגזרות פלורסנט, ו בדיקה ראמאן ספציפית) הראה פוטנציאל גדול במעקב ארוך טווח מיטוכונדריאלי וניתוח מיטוכונדריאלי הדינמיקה23,24,25. היתרונות והחסרונות של הבדיקות השונות ניתן למצוא בטבלה 1.
לאחר כתמים מיטוכונדריאלי, הדמיה של תאים חיים מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ מצויד בחממה. כדי למקד ביעילות את הנוירונים במהלך ההדמיה, יש לשמור דגימות עצביות בחממה 37 ° c עם 5% CO2 ובסביבה לח לפחות 15 דקות. כדי למזער את ההשפעות מחוץ לפוקוס, תמונות במיקומים Z שונים ניתן לנקוט כדי להפוך Z-מחסנית, או את הפונקציה מיקוד אוטומטי יכול להיות מנוצל. חשוב לזהות את הכיוון של הובלה מיטוכונדריאלי (כיתה או נסיגה), תמונות פאזה נלקחים כדי להבדיל בין גוף התאים העצבי והאקטונים. בעיה קריטית נוספת היא הלבנה של דגימות פלורסנט, אשר חייב להיות מנועים כדי להשיג מיטוכונדריאלי יעיל להעברת תמונות זמן. שיטה אפקטיבית כדי למזער את הלבנת העור היא למקד דגימות דרך עינית ולהגדיר את כל הפרמטרים הדמיה מתחת לערוץ השלב, למעט זמן חשיפה. יתר על כן, שינוי גודל אוטומטי דפוס יכול להקטין את הלבנת התמונה של הזריחה.
המיטואים הם מארגני דינמיקה מאוד והוא יכול לנוע בכיוונים כיוונים וכיווני נסיגה. בנוירונים, כמה מיטוכונקסונים בתוך האקטונים נשארים נייחים במהלך ההקלטה. בין המיטו, מצב תנועה יכול להשתנות לאורך זמן. תופעה זו מעלה את השאלה החשובה שבה סוג המיטו, נחשב נייח או נע. ניתן לפתור זאת על-ידי הגדרת הסף במהלך ניתוח של תעבורה מיטוכונדרילית. כדי להבדיל בין המיטו, נוימן ואח '. השתמשו במרכז המסלול היטוכונדריאלי, המוגדר כממוצע הקואורדינטות שלה לאורך זמן, לאחר מכן להגדיר את הסף ל 350 ננומטר/s כך מרחק סטייה מקסימלית של המיטוטרים ממרכז המסלול שלה הוא במסגרת הראשונה26. במחקר אחר, המחברים להגדיר 50 ננומטר/s כמו הסף להבחין מצב נייח ממצב המעבר27. מ300 ננומטר/s משמש כאן כדי להבדיל בין התעבורה המבוססת על המיקרו-כדורית כפישנעשה בדוחותהקודמים 28,29. למרות הסף עבור המיטו, נייח ונעים שונה, הגדרת הסף יכול לספק מידע יחסי חשוב על התנועה מיטוכונדריאלי בתוך אקסונים בין סוג פראי ונוירונים ניווניות.
רוב הפרוטוקולים מעורבים ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי השתמשו kymograms, שהם ייצוג דו מימדי של עמדות לעומת הזמן. כלים אוטומטיים מרובים פותחו לניתוח מעקב חלקיקים26,30,31,32,33,34. אלה יכולים להפריד במדויק כל מסגרת. בנוסף מהירות ואחוז נעים כי imagej יכול למדוד, שיטה זו יכולה למדוד אירועים נעים במדויק. עם זאת, אלה אינם חופשיים לשימוש. כאן, ניתוח של הובלה מיטוכונדריאלי בוצעה באמצעות ImageJ עם התוספים "Multikymograph" ו-"פקודות מאקרו". תוספים אלה יכולים ביעילות למדוד תנועה מיטוכונדריאלי. היתרון של התוספים הללו הוא קלות השימוש שלהם ואת היכולת לציין שינויים בתחבורה סיבי מיטוכונדריאלי בצורה של kymographs ומהירות לאורך זמן.
המיטו, מואריח נותחו ב SPG3A ושליטה נוירונים. הפחתה דומה באחוזי המיטו, שנצפו בשתי שיטות ניתוח שונות, מאשרת את התועלת של imagej כדי לנתח את התחבורה סיבי. בנוסף, מורפולוגיה מיטוכונדריאלי ניתן לנתח באמצעות אותה קבוצה של תמונות, אשר מספקת קריאות חשובות לימוד בתפקוד מיטוכונדריאלי במחלות נוירולוגיות שונות. מאז ניוון סיבי ובעיות מיטוכונדריאליות מתרחשות בדרך כלל בשלבים מוקדמים יותר, לפני הנוירונים מתים, שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון שינויים פתולוגיים מוקדם כדי לעזור לזהות מסלולים מולקולריים therapeutics מסך כדי להציל . ניוון עצבי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
העבודה הזאת נתמכת על ידי הקרן הפרספסטית, קרן בלייזר ו-NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
