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Neuroscience

मानव प्रेरित प्लीस्ट्रेटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में मिटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का विश्लेषण वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया

Published: February 9, 2020 doi: 10.3791/60548
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

बिगड़ा माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में शामिल हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न अग्रमस्तिष्क न्यूरॉन्स का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल एक्सोन और उनकी आकृति विज्ञान के विश्लेषण के साथ माइटोकॉन्ड्रियल तस्करी के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के अध्ययन को सुविधाजनक बनाएगा।

Abstract

न्यूरॉन्स उच्च ऊर्जा के लिए तीव्र मांग है ताकि उनके कार्यों का समर्थन करने के लिए । मानव न्यूरॉन्स में एक्सोन के साथ बिगड़ा माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन देखा गया है, जो विभिन्न रोग राज्यों में न्यूरोडिजेनरेशन में योगदान दे सकता है। यद्यपि जीवित मानव नसों में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता की जांच करना चुनौतीपूर्ण है, लेकिन न्यूरोडिजेनरेशन में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका का अध्ययन करने के लिए ऐसे प्रतिमान महत्वपूर्ण हैं। यहां वर्णित मानव प्रेरित प्लुरीटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से प्राप्त फोरब्रेन न्यूरॉन एक्सॉन में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। आईपीएससी को अच्छी तरह से स्थापित तरीकों का उपयोग करके टेलेएंसेफेलिक ग्लूटाएर्गिक न्यूरॉन्स में विभेदित किया जाता है। न्यूरॉन्स के माइटोकॉन्ड्रिया को माइटोट्रैकर सीएमएक्सआरओ से दाग दिया जाता है, और एक्सॉन के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन को सेल संस्कृति के लिए इनक्यूबेटर से लैस लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया जाता है। समय-चूक छवियों का विश्लेषण "मल्टीकिमोग्राफ", "बायोफॉर्मेट आयातक", और "मैक्रो" प्लगइन्स के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन के केमोग्राफ उत्पन्न होते हैं, और एंटेरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं में औसत माइटोकॉन्ड्रियल वेग कायोग्राफ से पढ़ा जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान विश्लेषण के बारे में, इमेजजे का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल लंबाई, क्षेत्र और पहलू अनुपात प्राप्त किए जाते हैं। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए एक्सॉन के साथ माइटोकॉन्ड्रियल तस्करी और उनकी आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और वितरण ध्रुवीकृत न्यूरॉन्स में चर और विशेष ऊर्जावान मांगों को पूरा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। न्यूरॉन्स सिनेप्स के गठन के माध्यम से लक्ष्यों के साथ जुड़ने के लिए बेहद लंबे अक्षों का विस्तार कर सकते हैं, जो सीए2 + बफरिंग और आयन धाराओं के लिए ऊर्जा के उच्च स्तर की मांग करते हैं। न्यूरॉन्स के एक्सोनल और सिनैप्टिक फ़ंक्शन का समर्थन करने के लिए सोमा से एक्सॉन तक माइटोकॉन्ड्रिया का परिवहन महत्वपूर्ण है। स्थानिक और अस्थायी गतिशील माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन तेजी से एक्सोनल परिवहन द्वारा कई माइक्रोमीटर प्रति सेकंड1की दरों पर आयोजित किया जाता है ।

विशेष रूप से, मोटर या एडाप्टर प्रोटीन, जैसे किनेसिन और डिनेइन, माइटोकॉन्ड्रिया2,3के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोट्यूब्यूल के साथ फास्ट ऑर्गेनेल परिवहन में भाग लेते हैं। सामान्य न्यूरोनल गतिविधि के लिए न्यूरोनल सोमा से डिस्टल एक्सॉन (एंट्रोग्रेड एक्सोन लांचे) तक नए इकट्ठे माइटोकॉन्ड्रिया के उचित परिवहन और डिस्टल एक्सॉन से माइटोकॉन्ड्रिया के रिवर्स परिवहन को सेल बॉडी (प्रतिगामी परिवहन) तक वापस करने की आवश्यकता होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि अनुचित माइटोकॉन्ड्रियल आवंटन न्यूरोनल दोषों और मोटर न्यूरॉन अपक्षयी रोगों4,5से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है । इसलिए, न्यूरोडिजेनरेशन में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका को विच्छेदन करने के लिए, लाइव संस्कृतियों में अक्षों के साथ माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन की जांच करने के लिए तरीके स्थापित करना महत्वपूर्ण है।

माइटोकॉन्ड्रिया की ट्रैकिंग की जांच और विश्लेषण करने में दो मुख्य चुनौतियां हैं: (1) हर फ्रेम में पृष्ठभूमि से माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान करना, और (2) हर फ्रेम के बीच कनेक्शन का विश्लेषण और उत्पादन करना। पहली चुनौती को हल करने में, एक फ्लोरेसेंस लेबलिंग दृष्टिकोण का उपयोग पृष्ठभूमि से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है, जैसे माइटोट्रैकर डाये या फ्लोरेसेंस-फ्यूज्ड माइटोकॉन्ड्रियल लक्ष्यीकरण प्रोटीन (जैसे, माइटो-जीएफपी)6,7,8। फ्रेम के बीच संबंध का विश्लेषण करने के लिए, पिछलेअध्ययनों9 में कई एल्गोरिदम और सॉफ्टवेयर उपकरण वर्णित किए गए हैं। हाल ही में एक पेपर में शोधकर्ताओं ने माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन की मात्रा निर्धारित करने के लिए चार अलग-अलग स्वचालित उपकरणों (जैसे, वोलोसिटी, इमरिस, wrMTrck, और अंतर ट्रैकर) की तुलना की। परिणामों से पता चला है कि ट्रैक लंबाई, माइटोकॉन्ड्रियल विस्थापन, आंदोलन अवधि और वेग में विसंगतियों के बावजूद, ये स्वचालित उपकरणउपचार 10के बाद परिवहन अंतर का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त हैं। इन उपकरणों के अलावा, इमेजजे के लिए एक एकीकृत प्लगइन "मैक्रोन" (रिएटडोर्फ और सेट्ज द्वारा लिखित) का व्यापक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन11का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है। यह विधि केमोग्राफ उत्पन्न करती है जिसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें एंट्रोग्रेड और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में वेग शामिल है।

माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक गतिशील ऑर्गेनेल्स हैं जो शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के जवाब में लगातार संख्या और आकृति विज्ञान में बदलते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और संलयन माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और होमोस्टोसिस को कसकर विनियमित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और संलयन के बीच असंतुलन बेहद कम या लंबे माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को प्रेरित कर सकता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को ख़राब कर सकता है और इसके परिणामस्वरूप असामान्य न्यूरोनल गतिविधियां और न्यूरोडिजेनरेशन हो सकते हैं। बिगड़ा माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, हंटिंगटन रोग, और वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया (एचएसपी)12,13,14,15जैसे विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शामिल हैं। एचएसपी विरासत में मिले न्यूरोलॉजिकल विकारों का एक विषम समूह है जो कोर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट के पतन और बाद में निचले अंग की मांसपेशियों को नियंत्रित करने में विफलता की विशेषता है16,17। इस अध्ययन में आईपीएससी से व्युत्पन्न फोरब्रेन न्यूरॉन्स का इस्तेमाल एचएसपी में माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्ट और मॉर्फोलॉजी का आकलन करने के लिए किया जाता है। यह विधि लाइव संस्कृतियों में न्यूरोनल अक्षों की माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता की जांच के लिए एक अनूठा प्रतिमान प्रदान करती है।

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Protocol

1. आईपीएससी से टेलेएन्सेफेलिक ग्लूटार्गिक न्यूरॉन्स की पीढ़ी

नोट: आईपीएससी बनाए रखने और टेलेएन्सेफेलिक ग्लूटाएर्ग न्यूरॉन्स में उनके भेदभाव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पहले18वर्णित उन लोगों के समान है । यहां, मानव pluripotent स्टेम सेल के भेदभाव के दौरान महत्वपूर्ण प्रक्रिया शुरू की है और प्रकाश डाला है ।

  1. मानव भ्रूणस्टेम सेल (एचएसईसी) मध्यम में माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) फीडरपर संस्कृति आईपीएससी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ, 4 एनजी/एमएल) के साथ पूरक है ।
  2. 3 मिन के लिए डिसपे (1 मिलीग्राम/एमएल) के साथ ऊष्मायन के बाद, आईपीएससी को छोटे झुरमुटों में अलग कर दें। फिर, आईपीएससी 4 दिनों के लिए एचएसईएससी माध्यम में निलंबन में एकत्रित संस्कृति। इस टाइमपॉइंट को देखें, जब आईपीएससी निलंबन संस्कृति के रूप में शुरू कर रहे हैं, 1 दिन (D1) के रूप में । 4 दिनों के लिए रोजाना मीडियम बदलें।
  3. D5 में, 3 दिनों के लिए तंत्रिका प्रेरण मीडिया (एनआईएम) में 2 मिन और संस्कृति के लिए 200 x ग्राम पर केंद्रीकरण के बाद आईपीएससी समुच्चय एकत्र करें। संस्कृति सेल हर 2 दिनों में मीडिया के आधे बदलकर 3 दिनों के लिए निलंबन में समुचित । तंत्रिका प्रेरण दक्षता बढ़ाने के लिए एनआईएम माध्यम में डीएमएच-1 (2 माइक्रोन) और एसबी431542 (2 माइक्रोन) जोड़ें।
  4. D8 में, 2 मिन के लिए 200 x ग्राम पर केंद्रीकरण के बाद आईपीएससी समुच्चय एकत्र करें और उन्हें 10% एफबीएस (या लैमिनिन-लेपित प्लेटों के साथ) के साथ एनआईएम में विविधता करके 6 अच्छी तरह से प्लेट (प्लेट के लगभग 20-30 समुच्चय) का पालन करने दें। अगले दिन, पुराने माध्यम को हटा दें और D17 तक हर 2 दिन में NIM में बदल ें।
    नोट: न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं की पीढ़ी, जो रोसेट संरचनाओं के साथ स्तंभर कोशिकाओं के गठन से इंगित की जाती है, इस अवधि में देखी जाती है।
  5. D17 में, यांत्रिक रूप से कालोनियों के केंद्र में न्यूरोपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करें (कॉलोनियों के केंद्र में एक छोटा सा दबाव लागू करके सीधे उठाना) या एंजामेटिक ली (dispase के साथ इलाज)। अलग न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं को गैर-इलाज ऊतक संस्कृति T25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें बी 27 (1x), सीएमपी (1 माइक्रोन), और आईजीएफ (10 एनजी/एमएल) के अलावा एनआईएम के 8 मिलीएल होते हैं।
    नोट: निलंबन संस्कृति कोशिकाओं को न्यूरोस्फीयर बनाने की अनुमति देती है जो कॉर्टिकल प्रोजेक्शन तंत्रिका जनकों से समृद्ध हैं।
  6. D35 के बाद, पॉली-ऑर्निथिन और एलवीई-फ्री कम ग्रोथ फैक्टर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स(सामग्री की तालिका)पर न्यूरोस्फीयर प्लेट करें - लेपित 35 मिमी ग्लास बॉटम व्यंजन टेलेसेफेलिक ग्लूटामैटर्जिक न्यूरॉन्स (कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स) उत्पन्न करने के लिए। चढ़ाना से पहले, न्यूरोस्फीयर को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिन के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल सेल टुकड़ी समाधान के साथ इनक्यूबेटकरके द्वारा छोटे समूहों में अलग करें।
  7. केंद्रीकरण द्वारा सेल टुकड़ी समाधान निकालें और तंत्रिका भेदभाव माध्यम (एनडीएम) के 1 mL में फिर से निलंबित करें। ग्लास बॉटम डिश (प्रति डिश के 100 माइक्रोन में लगभग पांच क्लस्टर) पर प्लेट कोशिकाएं उन्हें संलग्न करने के लिए। इसके बाद एनडीएम (1 किलो प्रति डिश) और कल्चर को एनडीएम में सेल्स जोड़ें जिसमें बी 27 (1x), सीएमपी (1 माइक्रोन), आईजीएफ (10 एनजी/एमएल), एचबीएनएफ (10 एनजी/एमएल), और जीडीएनएफ (10 एनजी/एमएल) शामिल हैं ।
    नोट: छोटे समूहों चढ़ाया जाता है क्योंकि वे अच्छी तरह से जीवित रहते हैं और लंबे प्रक्षेपण न्यूरॉन्स को जन्म देते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को बेहतर अलगाव के लिए प्रति डिश 20,000 कोशिकाओं के आसपास एक घनत्व पर अलग और चढ़ाया जा सकता है।
  8. Tbr1 और eIII-ट्यूबलिन मार्कर इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा टेलेएन्सेफेलिक ग्लूटामर्गिक न्यूरॉन्स की विशेषता है।

2. टेलेएन्सेफेलिक ग्लूटामिट्रिक न्यूरॉन्स के अक्षतों के साथ माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन की जांच

  1. एनडीएम को गर्म करें और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सेट के लिए इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर चालू करें।
  2. फोरब्रेन न्यूरॉन्स के एक्सोन के साथ माइटोकॉन्ड्रिया की कल्पना करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिन के लिए एनडीएम में माइटोकॉन्ड्रिया को दाग नेके लिए 50 एनएम लाल फ्लोरोसेंट डाये के साथ न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, गर्म एनडीएम के साथ कोशिकाओं 2x धोएं। न्यूरॉन्स एनडीएम में इनक्यूबेटेड हैं।
  3. एक्सोन के साथ माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन को रिकॉर्ड करने के लिए, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ 40x उद्देश्य का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन की समय-चूक छवियां लें।
    नोट: संस्कृति को स्थिर करने के लिए, लाइव सेल इमेजिंग करें जब कोशिकाओं को माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला के बाद 20 मिन के लिए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटेड किया जाता है।
  4. चरण क्षेत्र के तहत, रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर एक्सोन की पहचान करें (सीधे न्यूरोनल सेल शरीर से निकलते हैं, लगातार पतली लंबी न्यूराइट्स नहीं शाखाओं में बंटी के साथ)। माइटोकॉन्ड्रिया एंट्रोग्रेड (सेल बॉडी से डिस्टल एक्सॉन तक) और रेट्रोग्रेड दिशाओं (एक्सोनल टर्मिनल से सेल बॉडी तक) में चलता है। एक्सोन के साथ माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन की दिशा को अलग करने के लिए, स्पष्ट रूप से न्यूरॉन्स के सेल निकायों की पहचान करें। इस चरण में, फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए चरण क्षेत्र के तहत एक्सोन पर ध्यान केंद्रित करें।
  5. सेल बॉडी और एक्सॉन को अलग करने के बाद, एक्सॉन में माइटोकॉन्ड्रिया के एक्सपोजर टाइम और फोकस को एडजस्ट करें। फिर, 5 मिनट की कुल अवधि के लिए हर 5 एस के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया के परिवहन पर कब्जा करें, 60 फ्रेम उपज। प्रत्येक डिश के लिए कम से कम पांच स्थानों पर बेतरतीब ढंग से कब्जा करें और प्रत्येक समूह के लिए 3x दोहराएं।

3. कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का डेटा विश्लेषण

नोट: छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, इमेजजे या मेटामॉर्फ19)का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन पर एकत्र किए गए डेटा का विश्लेषण करें। चूंकि इमेजजे आसानी से उपलब्ध है, मल्टीकिमोग्राफ, मैक्रो,और कणों प्लगइन्स का विश्लेषण के साथ इमेजजे का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का विश्लेषण करें।

  1. इमेजजे का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन का विश्लेषण करना
    1. माइटोकॉन्ड्रियल मोटिलिटी की समय-चूक छवियों पर कब्जा करने के बाद, मल्टीकिमोग्राफ प्लगइन का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया के वेग और आंदोलन का विश्लेषण करें। छवियों को .tiff प्रारूप फ़ाइलों के रूप में सहेजा जाता है, जिनका विश्लेषण फिजी सॉफ्टवेयर द्वारा पहले रिपोर्ट की गई विधि20के बाद किया जाता है।
    2. फिजी सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें। केमोग्राफ से माइटोकॉन्ड्रियल मूविंग वेग का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक प्लगइन्स डाउनलोड करें। इन चार .class प्लगइन्स के साथ बायो-फॉर्मेट पैकेज और काइमोग्राफ प्लगइन डाउनलोड करें, जिनमें: मल्टीप्लेक्समोग्राफ.क्लास, मल्टीपलओवरले.क्लास, स्टैकडिएंथ.क्लास और वॉकिंगएवरेज.क्लास (टेबल ऑफ मैटेरियल्स)शामिल हैं। इन फ़ाइलों को फिजी प्लगइन्स फ़ोल्डर में ले जाएं। प्लगइन्स फ़ोल्डर के लिए "tsp050706.txt" प्लगइन्स डाउनलोड करें। जब फ़ाइलों को प्लगइन्स फ़ोल्डर में ले जाया जाता है तो फिजी सॉफ्टवेयर को फिर से शुरू करें।
    3. फिजी सॉफ्टवेयर खोलें। प्लगइन्सचुनें, फिर बायो-फॉर्मेटके तहत बायो-फॉर्मेट आयातक के माध्यम से .tiff श्रृंखला की छवियों का आयात करें। स्टैक व्यूइंगमें स्टैंडर्ड इमेजजे चुनना सुनिश्चित करें, सभी श्रृंखलाओं को खोलें, ऑटोस्केलकी जांच करें, फिर ओकेपर क्लिक करें। पिक्सेल में छवियों के फ्रेम नंबर और आकार पर ध्यान दें, जो छवि के शीर्ष पर प्रदर्शित होते हैं।
      नोट: प्रति छवि 60 फ्रेम लें।
    4. सभी ६० फ्रेम के लिए छवि मेनू के तहत चमक/इसके विपरीत समायोजन करके छवियों को स्पष्ट करने पर विचार करें ।
    5. खंडित लाइन चुनने के लिए लाइन टूल पर सही क्लिक करें और सेल बॉडी से शुरू होने वाली सेगमेंटेड लाइन खींचें और टर्मिनल एक्सॉन पर समाप्त हो जाएं। प्लगइन्सके तहत मल्टीपलकिमोग्राफ चुनकर कायोग्राफ जेनरेट करें । मल्टीपलकिमोग्राफचुनने के बाद लाइन की चौड़ाई का चयन किया जाता है . सुनिश्चित करें कि यह एक अजीब संख्या है। लाइन चौड़ाई के लिए 1 चुनें। इस कदम के बाद एक किमोग्राफ उत्पन्न होता है।
      नोट: जानकारी के कई महत्वपूर्ण टुकड़े kymograph से पढ़ा जा सकता है । काइमोग्राफ की वाई-एक्सिस 60 फ्रेम के लिए अवधि (5 मिनट) का समय है। एक्स-एक्सिस चयनित एक्सन की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है।
    6. माइटोकॉन्ड्रिया (एंटोकॉन्ड्रिया (एंटेरोग्रेड, रेट्रोग्रेड या स्थिर) की आंदोलन दिशा निर्धारित करने के लिए काइमोग्राफ में एक विकर्ण रेखा का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, वाई-एक्सिस के साथ दाईं ओर जाने वाली एक लाइन एंट्रोग्रेड आंदोलन को इंगित करती है, और वाई-एक्सिस के साथ बाईं ओर जाने वाली एक लाइन प्रतिगामी आंदोलन को इंगित करती है। एक ऊर्ध्वाधर रेखा इंगित करती है कि माइटोकॉन्ड्रिन में कोई आंदोलन नहीं था।
    7. फिजी सॉफ्टवेयर में मैक्रोन प्लगइन का उपयोग करके चलती माइटोकॉन्ड्रिया के लिए दूरी, समय मूल्यों और वेग को मापें। प्लगइन्स पर जाएं । मैक्रोन । स्थापित करें । tsp050607.txt. kymograph पर माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन के निशान पर एक खंडित लाइन ड्रा, और हमेशा बेहतर से अवर क्षेत्र (y-axis) से लाइन आकर्षित ।
    8. लाइन खींचने के बाद प्लगइन्स जाएं । मैक्रोन । टीएसपी से वेग पढ़ें। चूंकि ट्रेस के साथ एक खंडित लाइन तैयार की जाती है, प्लगइन लाइन के अनुरूप खंडित वेग पढ़ता है।
      नोट: सभी डेटा के लिए इकाई पिक्सेल है। उप राशि प्रारंभिक बिंदु से उपभोग किया जाने वाला समय है, और डीएक्स योग एक्स-एक्सिस में जाने वाले माइटोकॉन्ड्रिन की दूरी को इंगित करता है। अब और dx अब अवधि के समय और हर खंड के लिए आंदोलन दूरी, क्रमशः दिखाता है । वास्तविक गति हर खंड के लिए गति से पता चलता है (dx अब/ औसत गति माइटोकॉन्ड्रियल मूविंग (डीएक्स योग/डीवाई राशि) के लिए औसत गति को इंगित करती है ।
    9. स्केल बार को मापकर माइक्रोन में पिक्सेल के अनुपात के रूप में अब डीएक्स की इकाई को पिक्सेल से माइक्रोन में बदलें। छवियों में पैमाने पर सलाखों को मापने के द्वारा पिक्सेल से माइक्रोन तक की दूरी के लिए इकाई को परिवर्तित करें। स्केल बार के साथ एक लाइन खींचने के लिए लाइन टूल का उपयोग करें और "विश्लेषण" के तहत उपायचुनकर लाइन की लंबाई को मापें। इस प्रयोग में 1 पिक्सेल = 5 सेकंड के रूप में पिक्सेल से सेकंड तक का समय बदलें।
    10. स्प्रेडशीट फ़ाइल में, औसत वेग की गणना करें और तदनुसार प्रतिगामी या पूर्ववर्ती आंदोलन को लेबल करें। पूर्ववर्ती या प्रतिगामी आंदोलन वेग का औसत।
    11. काइमोग्राफ से स्थिर और मोती माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत निर्धारित करें। एंटेरोग्रेड या प्रतिगामी मूविंग माइटोकॉन्ड्रिया को पूरी अवधि21के दौरान मूल से 5 माइक्रोन आगे या पीछे जाने के रूप में परिभाषित किया गया है । माइटोकॉन्ड्रिया को स्थिर माना जाता है यदि वे 5 मिन के दौरान 5 माइक्रोन से अधिक नहीं ले जाते थे।
  2. इमेजजे का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण
    नोट: इमेजजे का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल लंबाई, क्षेत्र और पहलू अनुपात को मापकर माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान निर्धारित करें। ऐसा करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. एक्सोन के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल लंबाई और क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए, इमेजजे वेबसाइट (सामग्री की तालिकादेखें) से Straighten_ जार प्लगइन डाउनलोड करें और इसे प्लगइन्सके फ़ोल्डर में ले जाएं। इमेजजे सॉफ्टवेयर को पुनः आरंभ करें।
    2. फ़ाइल के तहत खुले फ़ंक्शन के माध्यम से तस्वीर खोलें और छविके तहत टाइप का उपयोग करके 32 बिट छवि को 8 बिट में परिवर्तित करें।
    3. एक्सोन के साथ एक खंडित रेखा ड्रा करें। प्लगइन्स के तहत स्ट्रेटन चुनें और फिलामेंट/वाइड लाइन की चौड़ाई केलिए 50 पिक्सल सेट करें। इससे सीधा एक्सॉन जनरेट होगा।
    4. छवि के तहत दहलीज को समायोजित करें और "क्षेत्र" चुनकर विश्लेषण के तहत माप निर्धारितकरें। परिधि । फिट एलिप्स । आकार वर्णनकर्ता।
    5. लाइन फ़ंक्शन का उपयोग करके स्केल बार को मापें और पिक्सेल में दूरीभरकर, दूरी और लंबाई की इकाईको जानकर विश्लेषण के तहत पैमाने को सेट करें। फिर, इस पैमाने पर सेटिंग सेट करने के लिए वैश्विक चुनें।
    6. क्षेत्र निर्धारित करने के लिए विश्लेषण के तहत कणों का विश्लेषण करें। त्वरित पैरामीटर आकार (पिक्सेल ^2) = 0.20-अनंत, परिपत्र = 0.00-1.00 हैं, और = अंडाकार दिखाते हैं। प्रदर्शन परिणामचुनें।
      नोट: माप क्षेत्र, परिधि, लंबाई (प्रमुख), चौड़ाई (मामूली), और पहलू अनुपात (एआर) सहित कई माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान मापदंडों के परिणाम निकलेगा । इसी माइटोकॉन्ड्रियल नंबर भी सूचीबद्ध है।
    7. एक्सोनल लंबाई से विभाजित माइटोकॉन्ड्रियल नंबर का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल संख्या प्रति एक्सॉन (माइक्रोन) की गणना करें।

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Representative Results

यहां, मानव आईपीएससी को टेलेएंसेफेलिक ग्लूटामिज न्यूरॉन्स में विभेदित किया गया था, जिन्हें Tbr1 और 3 tubulin मार्कर(चित्रा 1ए)के साथ इम्यूनोस्टेनिंग की विशेषता थी। माइटोकॉन्ड्रिया के अक्षीय परिवहन की जांच करने के लिए, इन कोशिकाओं को लाल फ्लोरोसेंट रंग से दाग दिया गया था, और समय-चूक इमेजिंग की गई थी। चूंकि इमेजजे आसानी से उपलब्ध है और प्राप्त करना आसान है, माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन का विश्लेषण "मल्टीकिमोग्राफ" और "मैक्रो" इमेजजे प्लगइन्स के साथ किया गया था, जो चित्र 1में दिखाया गया था।

माइटोकॉन्ड्रियल मोशन के तीन संबंधित राज्य हैं, जिनमें स्थिर, एंट्रोग्रेड और प्रतिगामी आंदोलन(चित्रा 1बी, सी)शामिल हैं। एक एकल माइटोकॉन्ड्रिन स्थिर रह सकता है या एक एक्सॉन के भीतर एंट्रोग्रेड या प्रतिगामी दिशा में जा सकता है, और यहां, वेग निर्धारित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन के ट्रैक के साथ एक खंडित लाइन खींची गई थी(चित्रा 1डी)। एक्सॉन के साथ माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन का वेग चित्रा 1ई में दिखाया गया है और इमेजजे में "मैक्रो" द्वारा पढ़ने के बाद चित्रा 1डी में खंडित लाइनों से मेल खाती है। मेटामॉर्फ सॉफ्टवेयर के समान, इमेजजे का उपयोग इमेजजे(चित्र 1एफ)द्वारा उत्पन्न केमोग्राफ के आधार पर माइटोकॉन्ड्रियल वेग और मोटिकल माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषण सॉफ्टवेयर (उदाहरण के लिए, मेटामॉर्फ) का उपयोग करते हुए, पिछले डेटा से पता चला है कि सामान्य न्यूरॉन्स की तुलना में एसपीजी3ए न्यूरॉन्स में मोटिवल माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत काफी कम हो गया था, जबकि वेग19को नहीं बदला गया था। इमेजजे सॉफ्टवेयर का मूल्यांकन करने के लिए, मोटिवल माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिशत की जांच की गई थी, और नियंत्रण जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) न्यूरॉन्स की तुलना में एसपीजी 3ए न्यूरॉन्स में मोटिल माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिशत में इसी तरह की कमी देखी गई(चित्रा 1जी)।

माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के विश्लेषण के बारे में, माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र, लंबाई और एआर का विश्लेषण इमेजजे में "विश्लेषण कणों" समारोह का उपयोग करके किया गया था। एक्सन को "स्ट्रेटन" प्लगइन(चित्रा 2ए, बी)का उपयोग करके सीधा किया गया था। माइटोकॉन्ड्रिया को दहलीज(चित्रा 2सी, डी)को समायोजित करके स्पष्ट रूप से चुना गया था। अंत में, माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र, लंबाई (प्रमुख), चौड़ाई (मामूली), पहलू अनुपात और परिधि को "विश्लेषण कणों" प्लगइन(चित्रा 2ई, एफ)का उपयोग करके सीधे एक्सन से प्राप्त किया गया था। असामान्य माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान (और पहले किया गया है) एचएसपी iPSC-व्युत्पन्न टेलेंसेफेलिक ग्लूटामिराज न्यूरॉन्स में मनाया गया था, जिसमें एसपीजी15 कोशिकाएं(चित्रा 2जी, एच, आई)13,22शामिल हैं। डब्ल्यूटी न्यूरॉन एक्सॉन(चित्रा 2जी, एच, आई)को नियंत्रित करने की तुलना में एसपीजी15 न्यूरॉन एक्सोन में माइटोकॉन्ड्रियल लंबाई और पहलू अनुपात दोनों में काफी कमी आई थी।

Figure 1
चित्रा 1: इमेजजे का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन का विश्लेषण। (A)टेलेएन्सेफेलिक ग्लूटामर्ग न्यूरॉन्स की पीढ़ी को दिखाते हुए इम्यूनोस्टेनिंग। Tbr1 (लाल), एक III ट्यूबलिन (हरा), और Hoechst (नीला) । स्केल बार = 50 माइक्रोन। इस आंकड़े को पिछलेअध्ययन 19से संशोधित किया गया है । (ख)न्यूरॉन्स के अक्षतके भीतर माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन। एंटेरोग्रेड माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन को कोशिका निकाय से डिस्टल एक्सॉन की ओर जाने वाले माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में परिभाषित किया गया है, और प्रतिगामी माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन डिस्टल एक्सॉन से निकलता है और न्यूरोनल सेल शरीर तक फैली हुई है। सेगमेंट लाइन को न्यूरोनल सेल बॉडी से डिस्टल एक्सोनल टर्मिनल तक एक्सॉन के साथ खींचा जाता है ताकि केमोग्राफ उत्पन्न किए जा सके। (C)इमेजजे का उपयोग करके काइमोग्राफ उत्पन्न होता है; एक्स-एक्सिस अक्षीय स्थिति है और वाई-अक्ष समय है। एक निरंतर सफेद रेखा एंट्रोग्रेड दिशा (गुलाबी तीरसिर), प्रतिगामी दिशा (नीले तीरसिर), या स्थिर स्थिति (पीले तीरसिर) में चलती माइटोकॉन्ड्रिन है। (D)खंडित रेखा मैक्रोन प्लगइन का उपयोग करके वेग को पढ़ने के लिए तैयार की जाती है। नंबर 1-8 लाइन के सेगमेंट का वर्णन करते हैं। एंटेरोग्रेड आंदोलन (1-4, 6, 8) और स्थिर राज्य (5, 7) को इस बढ़ाया केमोग्राफ से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। (ई)प्रत्येक खंड के लिए समय और चलती दूरी, वास्तविक और औसत वेग (पिक्सल में) । (एफ)इमेजजे का उपयोग करके डब्ल्यूटी और एसपीजी3ए कॉर्टिकल पीएन के लिए माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन का Kymograph। स्केल बार = 10 माइक्रोन (जी) डब्ल्यूटी और एसपीजी 3ए कॉर्टिकल पीएन में मोटिवल माइटोकॉन्ड्रियल अनुपात इमेजजे (* पी एंड एलटी; 0.05) का उपयोग करके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इमेजजे का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करना। (A)एक्सॉन को सीधा करने के लिए पैरामीटर। (ख)प्रतिनिधि ने कुल्हाड़ी सीधी कर दी । (C,D) माइटोकॉन्ड्रिया चुनने के लिए दहलीज का समायोजन। (ई,एफ) मापा माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र, परिधि, लंबाई (प्रमुख), चौड़ाई (मामूली), और पहलू अनुपात (एआर) (ई) में चयनित माइटोकॉन्ड्रिया के अनुरूप। (जी)डब्ल्यूटी में माइटोकॉन्ड्रिया और एसपीजी15 टेलेंसेफेलिक ग्लूटामिबल्जी न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि चित्र । स्केल बार = 20 माइक्रोन.(एच)डब्ल्यूटी और एसपीजी15 न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल लंबाई। (I)डब्ल्यूटी और एसपीजी15 न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया का पहलू अनुपात। **पी एंड एलटी; 0.01 बनाम. WT. (जी), (एच), और (I) एक पिछले अध्ययन13से संशोधित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फ्लोरोसेंट टूल्स लाभ नुकसान संदर्भ
माइटोट्रैकर माइटोट्रैकर माइटोकॉन्ड्रियल संभावित-स्वतंत्र है और इसका उपयोग ऑटोफागोसोम या लाइसोसोम के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के सहस्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। माइटोट्रैकर दीर्घकालिक अनुसंधान के लिए पर्याप्त फोटोटेबल नहीं है। 35
एनपीए-टीपीपी यह डाया एक उपन्यास फोटोटेबल माइटोकॉन्ड्रियल लेबलिंग रिएजेंट है। इस रंग की संश्लेषण और शुद्धिकरण प्रक्रिया समय लेने वाली और महंगी होती है। 23
मिटोबाडी इस रंग का उपयोग उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ रमन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जा सकता है। इस डाये का इस्तेमाल करने के लिए रमन माइक्रोस्कोप की जरूरत होती है। 25
TMRE यह रंग कम एकाग्रता और कोई शमन प्रभाव के साथ एक गैर विषैले, विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला रंग है। माइटोकॉन्ड्रिया लेबलिंग TMRE माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर निर्भर करता है। 36, 37
माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन अधिक विशिष्ट और स्थिर होते हैं। इस विधि को ट्रांसफेक्शन की आवश्यकता होती है और विभिन्न सेल प्रकारों के लिए ट्रांसफेक्शन दक्षता अलग-अलग होती है। 38, 39

तालिका 1: माइटोकॉन्ड्रियल लेबलिंग के लिए कुछ फ्लोरोसेंट उपकरणों के फायदे और नुकसान।

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Discussion

यह लेख लाल फ्लोरोसेंट डाये और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके न्यूरोनल एक्सोन में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने की एक विधि का वर्णन करता है, जो दोनों न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में एक्सोनल डिजनरेशन और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिनमें माइटोकॉन्ड्रिया का धुंधला होना, लाइव सेल इमेजिंग और छवियों का विश्लेषण करना शामिल है। इस विधि में माइटोकॉन्ड्रिया को दाग देने के लिए फ्लोरोसेंट डाये का इस्तेमाल किया गया। चूंकि मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स आसानी से पकवान से अलग हो जाते हैं, इसलिए डिश में कुछ समाधान छोड़ना और धीरे-धीरे न्यूरोबेसल मीडियम जोड़ना महत्वपूर्ण है। डाइस को हटाने के लिए तीन-चार बार धुलाई की जा सकती है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया को अन्य संवाददाताओं के साथ एक्सोन के साथ अपने परिवहन को मापने के लिए लेबल किया जा सकता है, जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूज्ड माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन6को लक्षित करना। दीर्घकालिक ट्रैकिंग में, कई जांच (यानी, एनपीए-टीपीपी, 2,1,3-बेंजोथिडियाज़ोल [बीटीडी] फ्लोरोसेंट डेरिवेटिव, और एक विशिष्ट रमन जांच) ने दीर्घकालिक माइटोकॉन्ड्रियल ट्रैकिंग और माइटोकॉन्ड्रियल डायनेमिक्स विश्लेषण23,24,25में काफी संभावनाएं दिखाईं। विभिन्न जांचों के फायदे और नुकसान तालिका 1में पाए जा सकते हैं ।

माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला होने के बाद, इनक्यूबेटर से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लाइव सेल इमेजिंग की जाती है। इमेजिंग के दौरान न्यूरॉन्स को प्रभावी ढंग से केंद्रित करने के लिए, तंत्रिका नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ और कम से कम 15 कम के लिए आर्द्र वातावरण में रखा जाना चाहिए। आउट-ऑफ-फोकस प्रभावों को कम करने के लिए, जेड-स्टैक बनाने के लिए विभिन्न जेड-पदों पर छवियों को लिया जा सकता है, या ऑटो-फोकस फ़ंक्शन का उपयोग किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन (एंट्रोग्रेड या प्रतिगामी) की दिशा की पहचान करने के लिए, न्यूरोनल सेल शरीर और एक्सोन को अलग करने के लिए चरण छवियों को लिया जाता है। एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा फ्लोरोसेंट नमूनों की फोटोब्लीचिंग है, जिसे कुशल माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन समय-चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए रोका जाना चाहिए। फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए एक प्रभावी तरीका आईपीस के माध्यम से नमूनों को केंद्रित करना और एक्सपोजर समय को छोड़कर चरण चैनल के तहत सभी इमेजिंग पैरामीटर निर्धारित करना है। इसके अलावा, स्वचालित स्केलिंग पैटर्न फ्लोरेसेंस की फोटोब्लीचिंग को कम कर सकता है।

माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक गतिशील ऑर्गेनेल्स हैं और एंट्रोग्रेड और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में स्थानांतरित हो सकते हैं। न्यूरॉन्स में, एक्सोन के भीतर कुछ माइटोकॉन्ड्रिया रिकॉर्डिंग के दौरान स्थिर रहते हैं। चलती माइटोकॉन्ड्रिया में, गति की स्थिति समय के साथ भिन्न हो सकती है। यह घटना महत्वपूर्ण सवाल उठाती है जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया प्रकार को स्थिर या आगे बढ़ने वाला माना जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल एक्सोनल ट्रांसपोर्ट एनालिसिस के दौरान इसकी दहलीज तय करके इसका समाधान किया जा सकता है। स्थिर माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए, न्यूमन एट अल ने माइटोकॉन्ड्रियल ट्रैक सेंटर का उपयोग किया, जिसे समय के साथ अपनी स्थिति समन्वय के रूप में परिभाषित किया गया है, फिर 350 एनएम/एस तक सीमा निर्धारित करें ताकि इसके ट्रैक सेंटर से माइटोकॉन्ड्रिन की अधिकतम विचलन दूरी पहले फ्रेम26में हो। एक अन्य अध्ययन में, लेखकों ने चलती स्थिति27से स्थिर स्थिति को अलग करने के लिए सीमा के रूप में ५० एनएम/एस निर्धारित किया । यहां माइक्रोट्यूबबुल आधारित परिवहन को अलग करने के लिए 300 एनएम/एस की सीमा का उपयोग किया गया था जैसा कि पिछली रिपोर्टों में किया गया था28,29। यद्यपि स्थिर और चलती माइटोकॉन्ड्रिया के लिए सीमा अलग है, सीमा निर्धारित करना जंगली प्रकार और अपक्षयी न्यूरॉन्स के बीच अक्षतके भीतर माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन पर महत्वपूर्ण सापेक्ष जानकारी प्रदान कर सकता है।

माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन विश्लेषण से जुड़े अधिकांश प्रोटोकॉल ों में केमोग्राम का उपयोग किया गया है, जो समय बनाम पदों का द्वि-आयामी प्रतिनिधित्व हैं। पार्टिकल ट्रैकिंग26,30,31,32,33,34के विश्लेषण के लिए कई स्वचालित उपकरण विकसित किए गए हैं . ये प्रत्येक फ्रेम को सटीक रूप से अलग कर सकते हैं। इमेजजे माप सकते हैं कि वेग और गतिशील प्रतिशत के अलावा, यह विधि गतिशील घटनाओं को सही ढंग से माप सकती है। हालांकि, ये उपयोग करने के लिए स्वतंत्र नहीं हैं। यहां, माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन का विश्लेषण इमेजजे का उपयोग करके "मल्टीकिमोग्राफ" और "मैक्रो" प्लगइन्स के साथ किया गया था। ये प्लगइन्स माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन को प्रभावी ढंग से माप सकते हैं। इन प्लगइन्स का लाभ उनके उपयोग में आसानी और समय के साथ केमोग्राफ और वेग के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल एक्सोनल परिवहन में परिवर्तन को इंगित करने की क्षमता है।

एसपीजी3ए और नियंत्रण न्यूरॉन्स में मोटिवल माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण किया गया। दो अलग-अलग विश्लेषण विधियों का उपयोग करके मोती माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिशत में इसी तरह की कमी देखी गई, जिससे एक्सोनल परिवहन का विश्लेषण करने के लिए इमेजजे की उपयोगिता की पुष्टि हुई। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण छवियों के एक ही सेट का उपयोग करके किया जा सकता है, जो विभिन्न न्यूरोलॉजिकल रोगों में माइटोकॉन्ड्रियल रोग का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण रीडआउट प्रदान करता है। चूंकि एक्सोनल डिजनरेशन और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन आमतौर पर पहले के चरणों के दौरान होते हैं, इससे पहले कि न्यूरॉन्स मर जाते हैं, इस विधि का उपयोग आणविक रास्तों और स्क्रीन चिकित्सीय की पहचान करने में मदद करने के लिए प्रारंभिक रोग परिवर्तनों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। न्यूरोडिजेनरेशन।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को स्पास्टिक पैराप्लेजिया फाउंडेशन, ब्लेजर फाउंडेशन और एनआईएच (R21NS109837) ने समर्थन दिया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Cell Detachment Solution Innovative Cell Technologies AT104
Biosafety hood Thermo Scientific 1300 SERIES A2
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R/ 75004261
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
Cyclic AMP (cAMP) Sigma-Aldrich D0627
Dispase Gibco 17105-041
Dorsomorphin Selleckchem S7146
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Corning 10-092-CV
FBS Gibco 16141-002
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Peprotech 100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Gibco A1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement Gemini 400-160
Glass Bottom Dishes MatTek P35G-0.170-14-C
9'' glass pipetes VWR 14673-043
Glial derived neurotrophic factor (BDNF) Sigma-Aldrich D0627
GlutaMAX-I Gibco 35050-061
Heparin Sigma H3149
Insulin growth factor 1 (IGF1) Invitrogen M7512
Knockout Serum Replacer Gibco A31815
Laminin Sigma L-6274
2-Mercaptoethanol Sigma M3148-100ML
MitoTracker CMXRos Invitrogen M7512
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Non Essential Amino Acids Gibco 11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free Supplement Gemini 400-163
Olympus microscope IX83 Olympus IX83-ZDC2
PBS Corning 21-031-CV
Phase contrast microscope Olympus CKX41/ IX2-SLP
6 well plates Corning 353046
24 well plates Corning 353047
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) Sigma-Aldrich P3655
SB431542 Stemgent 04-0010
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane Millipore SCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF Millipore SCGVU10RE
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
Trypsin inhibitor Gibco 17075029
50 ml tubes Phenix SS-PH50R
15 ml tubes Phenix SS-PH15R
T25 flasks (untreated) VWR 10861-572
Plugins for softwares
Bio-formats Package http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji software https://fiji.sc/
Kymograph Plugin https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jar https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txt https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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न्यूरोसाइंस इश्यू 156 माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्ट माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी फोरब्रेन न्यूरॉन्स प्रेरित प्लुरीटेंट स्टेम सेल एक्सोनल डिजनरेशन वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया
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Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein,… More

Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. J. Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia. J. Vis. Exp. (156), e60548, doi:10.3791/60548 (2020).

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