Summary
Nedsatt mitokondrietransport og morfologi er involvert i ulike nevrodegenerative sykdommer. Den presenterte protokollen bruker indusertpluripotente stamcelle-avledet forebrain nevroner for å vurdere mitokondrietransport og morfologi i arvelig spastisk paraplegi. Denne protokollen tillater karakterisering av mitokondriehandel langs aksoner og analyse av deres morfologi, noe som vil lette studiet av nevrodegenerativ sykdom.
Abstract
Nevroner har intense krav om høy energi for å støtte sine funksjoner. Nedsatt mitokondrietransport langs aksoner har blitt observert hos menneskelige nevroner, noe som kan bidra til nevrodegenerasjon i ulike sykdomstilstander. Selv om det er utfordrende å undersøke mitokondriedynamikk i levende menneskelige nerver, er slike paradigmer avgjørende for å studere mitokondrienes rolle i nevrodegenerasjon. Beskrevet her er en protokoll for å analysere mitokondrietransport og mitokondriemorfologi i forebrain neuron aksoner avledet fra humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCer). IPSCer er differensiert i telencephalic glutamatergic nevroner ved hjelp av veletablerte metoder. Mitokondrier av nevronene er farget med MitoTracker CMXRos, og mitokondriebevegelse i aksonene fanges opp ved hjelp av et levende cellebildemikroskop utstyrt med en inkubator for cellekultur. Time-lapse bilder analyseres ved hjelp av programvare med "MultiKymograph", "Bioformat importør" og "Makroer" plugins. Kymografer av mitokondrietransport genereres, og gjennomsnittlig mitokondriehastighet i anterograde og retrograd retninger leses fra kymografen. Når det gjelder mitokondriemorfologianalyse, oppnås mitokondrielengde, areal og sideforhold ved hjelp av ImageJ. Oppsummert tillater denne protokollen karakterisering av mitokondriehandel langs aksoner og analyse av deres morfologi for å lette studier av nevrodegenerative sykdommer.
Introduction
Mitokondriemotilitet og distribusjon spiller en viktig rolle i å oppfylle variable og spesialiserte energiske krav i polariserte nevroner. Nevroner kan strekke ekstremt lange aksoner for å koble til mål gjennom dannelsen av synapser, som krever høye nivåer av energi for Ca2 + bufring og ionstrømmer. Transport av mitokondrier fra soma til axon er avgjørende for å støtte aksonerog synaptisk funksjon av nevroner. Romlig og tempolig dynamisk mitokondriebevegelse utføres av rask aksonal transport med priser på flere mikrometer per sekund1.
Spesielt, motor eller adapter proteiner, som kinesin og dynein, delta i rask organelle transport langs mikrotubuli for å kontrollere bevegelsen av mitokondrier2,3. Normal nevronal aktivitet krever riktig transport av nymonterte mitokondrier fra nevronal soma til distal axon (anterograde aksonert transport) og omvendt transport av mitokondrier fra den distale aksonen tilbake til cellekroppen (retrograd transport). Nyere studier har indikert at feil mitokondrietildeling er sterkt forbundet med nevronale defekter og motorneurondegenerative sykdommer4,5. Derfor, for å dissekere rollen som mitokondrier i nevrodegenerasjon, er det viktig å etablere metoder for å undersøke mitokondriebevegelse langs aksoner i levende kulturer.
Det er to hovedutfordringer i å undersøke og analysere sporing av mitokondrier: (1) identifisere mitokondrier fra bakgrunnen i hver ramme, og (2) analysere og generere forbindelsene mellom hver ramme. I å løse den første utfordringen brukes en fluorescensmerkingstilnærming mye for å skille mitokondrier fra bakgrunnen, for eksempel MitoTracker-farge eller transfeksjon av fluorescens-smeltet mitokondriemålrettingsprotein (f.eks. mito-GFP)6,7,8. For å analysere sammenhengen mellom rammer, har flere algoritmer og programvareverktøy blitt beskrevet i tidligere studier9. I en fersk artikkel sammenlignet forskere fire forskjellige automatiserte verktøy (f.eks. Volocity, Imaris, wrMTrck og Difference Tracker) for å kvantifisere mitokondrietransport. Resultatene viste at til tross for avvik i sporlengde, mitokondrieforskyvning, bevegelsesvarighet og hastighet, er disse automatiserte verktøyene egnet for evaluering av transportforskjell etter behandling10. I tillegg til disse verktøyene har en integrert plugin "Makroer" for ImageJ (skrevet av Rietdorf og Seitz) blitt mye brukt til å analysere mitokondrietransport11. Denne metoden genererer kymografer som kan brukes til å analysere mitokondriebevegelse, inkludert hastighet i både anterograde og retrograd retninger.
Mitokondrier er svært dynamiske organeller som stadig endres i antall og morfologi som svar på både fysiologiske og patologiske forhold. Mitokondriefisjon og fusjon tett regulere mitokondriemorfologi og homeostase. Ubalansen mellom mitokondriefisjon og fusjon kan indusere ekstremt korte eller lange mitokondrienettverk, noe som kan svekke mitokondriefunksjonen og resultere i unormale nevronale aktiviteter og nevrodegenerasjon. Nedsatt mitokondrietransport og morfologi er involvert i ulike nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og arvelig spastisk paraplegi (HSP)12,13,14,15. HSP er en heterogen gruppe arvelige nevrologiske lidelser preget av degenerasjon av kortikospinalkanalen og påfølgende unnlatelse av å kontrollere nedre lem muskler16,17. I denne studien brukes iPSC-avledede forebrain-nevroner til å vurdere mitokondrietransport og morfologi i HSP. Denne metoden gir et unikt paradigme for å undersøke mitokondriedynamikk av nevronale aksoner i levende kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generasjon av telencephalic glutamatergic nevroner fra iPSCs
MERK: Den detaljerte protokollen for å opprettholde iPSCer og deres differensiering i telencephalic glutamatergic nevroner ligner de som er beskrevet tidligere18. Her blir den kritiske prosessen under differensiering av menneskelige pluripotente stamceller introdusert og uthevet.
- Kultur iPSCer på mus embryonale fibroblast (MEF) matere i humane embryonale stamcelle (hESC) medium supplert med fibroblast vekstfaktor (bFGF, 4 ng / ml).
- Etter inkubasjon med dispase (1 mg/ml) i 3 min, dissosiere iPSCene i små klumper. Deretter kultur iPSC aggregater i suspensjon i hESC medium i 4 dager. Se dette tidspunktet, når iPSCer starter som suspensjon kultur, som dag 1 (D1). Endre mediet daglig i 4 dager.
- Ved D5 samler du iPSC-aggregatene etter sentrifugering på 200 x g i 2 min og kultur i nevrale induksjonsmedier (NIM) i 3 dager. Kultur cellen aggregerer i suspensjon i 3 dager ved å endre halvparten av media hver 2 dager. Tilsett DMH-1 (2 μM) og SB431542 (2 μM) til NIM medium for å øke neural induksjonseffektivitet.
- Ved D8 samler du iPSC-aggregatene etter sentrifugering ved 200 x g i 2 min og lar dem holde seg til 6 brønnplater (rundt 20–30 aggregater per brønn av platen) ved å kulere i NIM med 10 % FBS (eller med lamininbelagte plater) over natten. På følgende dag, fjern det gamle mediet og bytt til NIM hver 2 dager til D17.
MERK: Generasjonen av nevroepitelceller, som indikeres ved dannelse av søyleceller med rosettstrukturer, observeres i denne perioden. - Ved D17 isolerer de nevroepitelcellene mekanisk i midten av kolonier (løfter av direkte ved å bruke et lite trykk på kolonienes sentrum) eller enzymatically (behandlet med ulike). Overfør de isolerte nevroepitelcellene til ikke-behandlet vevskultur T25 kolbe som inneholder 8 ml NIM med tilsetning av B27 (1x), cAMP (1 μM) og IGF (10 ng/ml).
MERK: Suspensjonskulturen gjør det mulig for celler å danne nevrosfærer som er beriket med kortikale projeksjon nevrale stamfarer. - Etter D35, plate nevrosfærene på poly-ornithine og LDEV-fri redusert vekstfaktor kjeller membran matrise (Table of Materials)-belagt 35 mm glass bunnretter for å generere telencephalic glutamatergic nevroner (kortikale projeksjon nevroner). Før plating, dissosiere nevrosfærene til små klynger ved å inkubere med 1 mg / ml celleavløsning i 2 min ved 37 °C.
- Fjern celleavløsningsløsningen ved sentrifugering og resuspender i 1 ml nevrale differensieringsmedium (NDM). Plateceller på glassbunnfatet (rundt fem klynger i 100 μL medium per tallerken) for å la dem feste. Deretter legger du til NDM (1 ml per tallerken) og kultur cellene i NDM som inneholder B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/ml), hBDNF (10 ng/ml) og GDNF (10 ng/ml).
MERK: Små klynger er belagt fordi de overlever godt og gir opphav til lange projeksjonsnevroner. Alternativt kan celler dissosieres og belagt med en tetthet rundt 20.000 celler per tallerken for bedre separasjon. - Karakteriser telencephalic glutamatergic nevroner ved immunostaining Tbr1 og βIII-tubulin markører.
2. Undersøkelse av mitokondrietransport langs aksoner av telencephalic glutamatergige nevroner
- Varm opp NDM og slå på inkubatoren for fluorescensmikroskopet satt til 37 °C og 5 % CO2.
- For å visualisere mitokondrier langs aksonene av forebrain nevroner, inkuber nevronene med 50 nM rød fluorescerende farge til flekkmitokondrier i levende celler (f.eks. MitoTracker CMXRos) i NDM i 3 min ved 37 °C. Deretter vaske celler 2x med oppvarmet NDM. Nevronene er inkubert i NDM.
- For å registrere mitokondrietransporten langs aksonene, ta time-lapse bilder av mitokondriebevegelse ved hjelp av 40x-målet med et fluorescensmikroskop.
MERK: For å stabilisere kulturen, utfør levende celleavbildning når cellene inkuberes i inkubatoren i 20 min etter mitokondriefarging. - Under fasefelt identifiserer du aksonene basert på morfologiske egenskaper (direkte kommer fra nevronal cellekropp, konstant tynne lange nøyder uten forgrening). Mitokondrier beveger seg i anterograde (fra cellelegemet til distal akson) og retrograd retninger (fra aksonert terminal til cellelegemet). For å skille retningen av mitokondriebevegelse langs aksoner, identifiserer du tydelig cellelegemene til nevroner. I dette trinnet fokuserer du på aksoner under fasefelt for å redusere fotobleking.
- Etter å ha særet cellelegemet og aksonen, justereksponeringstiden og fokuset til mitokondrier i aksoner. Deretter fange transport av mitokondrier i aksoner hver 5 s for en total varighet på 5 min, noe som gir 60 rammer. Tilfeldig fange minst fem steder for hver tallerken og gjenta 3x for hver gruppe.
3. Dataanalyse av mitokondrietransport og morfologi i kortikale nevroner
MERK: Analyser de innsamlede dataene om mitokondrietransport ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare (f.eks. ImageJ eller MetaMorph19). Siden ImageJ er lett tilgjengelig, utfør analysen av mitokondrietransport og morfologi ved hjelp av ImageJ med MultiKymograph, Makroerog Analyser partikler plugins.
- Analysere mitokondrietransport ved hjelp av ImageJ
- Etter å ha fanget time-lapse bilder av mitokondrie motilitet, analysere hastigheten og bevegelsen av mitokondrier ved hjelp av MultiKymograph plugin. Bildene lagres som TIFF-formatfiler, som analyseres av Fiji-programvare etter en tidligere rapportert metode20.
- Last ned Fiji-programvaren. Last ned plugins som vil være nødvendig for å analysere mitokondrie bevegelseshastighet fra kymografer. Last ned Bio-formater Pakke og Kymograph Plugin sammen med disse fire .class plugins, inkludert: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class, og WalkingAverage.class (Table of Materials). Flytt disse filene til Fiji plugins-mappen. Last ned "tsp050706.txt" plugins til plugins-mappen. Start Fiji-programvaren på nytt når filene flyttes til plugins-mappen.
- Åpne Fiji-programvare. Velg plugins, og importer deretter bilder av TIFF-serien gjennom Bio-Formats Importer under Bio-Formats. Pass på at du velger Standard ImageJ i stakkvisning, velg Åpne alle serier, merk av For Autoskaler, og klikk deretter OK. Legg merke til rammenummeret og størrelsen på bildene i piksler, som vises øverst på bildet.
MERK: Ta 60 bilder per bilde. - Vurder å gjøre bildene klarere ved å justere lysstyrke/kontrast under Bilde-menyen for alle 60 bilder.
- Høyreklikk linjeverktøyet for å velge segmentert linje og tegne en segmentert linje fra cellehuset og avslutte ved terminalaksonen. Generer kymografen ved å velge MultipleKymograph under Plugins. Valget av linjebredde blir bedt om etter at du har valgt MultipleKymograph. Sørg for at dette er et oddetall. Velg 1 for linjebredden. En kymograf genereres etter dette trinnet.
MERK: Flere viktige opplysninger kan leses fra kymografen. Y-aksen til kymografen er varighetstiden (5 min) for de 60 rammene. X-aksen representerer plasseringen av de valgte aksonene. - Bruk en diagonal linje i kymografen til å bestemme bevegelsesretningen til mitokondrier (anterograde, retrograd eller stabil). En linje som går ned til høyre langs y-aksen indikerer for eksempel forutgradsbevegelse, og en linje som går ned til venstre langs y-aksen indikerer retrogradbevegelse. En vertikal linje indikerer at det ikke var noen bevegelse i mitokondrionen.
- Mål avstanden, tidsverdiene og hastigheten for de bevegelige mitokondriene ved hjelp av makroerplugin i Fiji-programvare. Gå til Plugins | Makroer | Installere | tsp050607.txt. Tegn en segmentert linje over sporet av mitokondriebevegelse på kymografen, og trekk alltid linjen fra den overordnede til dårligere regionen (y-akse).
- Etter å ha tegnet linjen, gå til Plugins | Makroer | lese hastigheter fra ts. Siden en segmentert linje langs sporingen er tegnet, leser plugin-modulen segmenterte hastigheter som tilsvarer linjen.
MERK: Enheten for alle data er piksler. dy sum er tiden som forbrukes fra utgangspunktet, og dx sum indikerer avstanden til mitokondrion beveger seg i x-aksen. dy nå og dx viser nå tidsperioden og bevegelsesavstanden for hvert segment, henholdsvis. faktisk hastighet viser hastigheten for hvert segment (dx nå / dy nå). gjennomsnittshastighet indikerer gjennomsnittshastigheten for mitokondrieflytting (dx sum / dy sum). - Endre enheten av dx nå fra piksel til μm som forholdet mellom piksel i μm ved å måle skalalinjen. Konverter enheten for avstand fra piksel til μm ved å måle skalalinjer i bilder. Bruk linjeverktøyet til å tegne en linje langs skaleringslinjen og måle lengden på linjen ved å velge Mål under "Analyser. Endre tiden fra piksel til sekunder, som 1 piksel = 5 sekunder i dette eksperimentet.
- I regnearkfilen beregner du gjennomsnittshastigheten og tilsvarende merker retrograd eller forutgradsbevegelse. Gjennomsnittlig anterograde eller retrograd bevegelseshastighet.
- Bestem prosentandelen stasjonære og motile mitokondrier fra kymografen. Anterograde eller retrograd bevegelige mitokondrier er definert som å flytte 5 μm fremover eller bakover fra opprinnelsen i hele perioden21. Mitokondrier anses stasjonære hvis de ikke beveget seg mer enn 5 μm i løpet av 5 min.
- Analyse av mitokondriemorfologi ved hjelp av ImageJ
MERK: Bestem mitokondriemorfologi ved å måle mitokondrielengde, areal og sideforhold ved hjelp av ImageJ. Hvis du vil gjøre dette, følger du trinnene nedenfor.- For å analysere mitokondrielengde og -området innenfor aksoner, last ned Straighten_.jar plugin fra ImageJ nettsted (se Table of Materials) og flytte den til mappen av plugins. Start ImageJ-programvaren på nytt.
- Åpne bildet gjennom den åpne funksjonen under Fil, og konverter 32-bitersbildet til 8-biters ved hjelp av Type under Bilde.
- Tegn en segmentert linje langs aksonene. Velg Rette under Plugins og angi 50 piksler for bredde på Filament/bred linje. Dette vil generere en rettet øks.
- Juster terskelen under Bilde og angi målingen under Analyser ved å velge"Område | Omkrets | Monter ellipse | Figurbeskrivelser.
- Mål skaleringslinjen ved hjelp av linjefunksjonen, og angi skalaen under Analyser ved å fylle avstanden i pikselen, kjenn avstandog lengdens enhet. Velg deretter Global for å angi denne skalainnstillingen.
- Bruk Analyser partikler under Analyser for å bestemme området. Hurtigparameterne er størrelse (piksel^2) = 0,20–uendelighet, sirkularitet = 0,00–1,00, og vis = ellipser. Velg Visningsresultater.
MERK: Målingen vil gi resultatene av flere mitokondriemorfologiparametere, inkludert område, omkretser, lengde (stor), bredde (mindre) og sideforhold (AR). Tilsvarende mitokondrienummer er også oppført. - Beregn mitokondrienummeret per akson (μm) ved hjelp av mitokondrienummeret delt på aksonallengde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her ble humane iPSCer differensiert til telencephalic glutamatergic nevroner, som var preget av immunstaining med Tbr1 og βIII tubulin markører (Figur 1A). For å undersøke aksonal transport av mitokondrier, disse cellene ble farget med rød fluorescerende farget, og time-lapse imaging ble utført. Siden ImageJ er lett tilgjengelig og enklere å få tak i, ble mitokondrietransport ytterligere analysert med "MultiKymograph" og "Makroer" ImageJ plugins, vist i figur 1.
Det er tre respektive tilstander av mitokondriebevegelse, inkludert statisk, anterograde, og retrograd bevegelse (Figur 1B,C). En enkelt mitokondrion kan forbli statisk eller bevege seg i anterograde eller retrograd retning innenfor en akson, og her ble en segmentert linje trukket langs sporet av mitokondriebevegelse for å bestemme hastighet (Figur 1D). Hastigheten på mitokondriebevegelse langs aksonen vises i figur 1E og tilsvarer de segmenterte linjene i figur 1D etter lesing av "Makroer" i ImageJ. I likhet med MetaMorph-programvaren kan ImageJ brukes til å bestemme mitokondriehastigheten og prosentandelen av motilmitokondrier basert på kymografen generert av ImageJ (Figur 1F). Ved hjelp av kommersielt tilgjengelig analyseprogramvare (f.eks. MetaMorph) viste tidligere data at prosentandelen av motile mitokondrier ble betydelig redusert i SPG3A-nevroner sammenlignet med normale nevroner, mens hastigheten ikke ble endret19. For å evaluere ImageJ-programvaren ble prosentandelen av motile mitokondrier undersøkt, og en lignende reduksjon i prosentandelen av motile mitokondrier i SPG3A nevroner sammenlignet med kontroll villtype (WT) nevroner ble observert (Figur 1G).
Når det gjelder analyse av mitokondriemorfologi, ble mitokondrieområdet, lengden og AR analysert ved hjelp av "analyser partikler" -funksjonen i ImageJ. Axons ble rettet ved hjelp av "rette" plugin(Figur 2A,B). Mitokondrier ble valgt tydelig ved å justere terskelen (Figur 2C,D). Til slutt ble mitokondrieområdet, lengde (stor), bredde (mindre), sideforhold og omkrets hentet fra den rettede aksonen ved hjelp av plugin-modulen "Analyser partikler" (figur 2E,F). Unormal mitokondriemorfologi var (og har tidligere vært) observert i HSP iPSC-avledede telencephalic glutamatergic nevroner, inkludert SPG15 celler (Figur 2G,H,I)13,22. Både mitokondrielengde og sideforhold ble signifikant redusert i SPG15 nevronaksoner sammenlignet med kontroll wt nevron aksoner (figur 2G, H, I).
Figur 1: Analyse av mitokondrietransport ved hjelp av ImageJ. (A) Immunstaining som viser generering av telencephalic glutamatergic nevroner. Tbr1 (rød), βIII tubulin (grønn) og Hoechst (blå). Skalerstenger = 50 μm. Dette tallet er endret fra en tidligere studie19. (B) Mitokondrietransport innenfor aksoner av nevroner. Anterograde mitokondriebevegelse er definert som mitokondriene som beveger seg fra cellekroppen til distal akson, og retrograd mitokondriebevegelse stammer fra den distale aksonen og strekker seg til den nevronale cellekroppen. Segmentlinjen trekkes langs aksoner fra nevronal cellelegeme til distal aksonal terminal for å generere kymografer. (C) Kymograph genereres ved hjelp av ImageJ; x-aksen er aksonalposisjonen og y-aksen er tid. En kontinuerlig hvit linje er mitokondrion beveger seg i anterograde retning (rosa pilhode), retrograd retning (blå pilhode), eller statisk tilstand (gul pilhode). (D) Den segmenterte linjen trekkes for å lese hastigheten ved hjelp av makroer-plugin-modulen. Nummer 1–8 beskriver segmentet av linjen. Anterograde bevegelse (1–4, 6, 8) og statisk tilstand (5, 7) kan skilles fra denne forstørrede kymografen. (E) Tid og flytting avstand for hvert segment, faktisk og gjennomsnittlig hastighet (i piksler). (F) Kymograph av mitokondrietransport for WT og SPG3A kortikale PNer ved hjelp av ImageJ. Skalabar = 10 μm. (G) Motile mitokondrieforhold i WT og SPG3A kortikale PNer ved hjelp av ImageJ (*p < 0,05). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Analysere mitokondriemorfologi ved hjelp av ImageJ. (A) Parametere for å rette aksonen. (B) Den representative rettet øks. -Jeg har ikkenoeå si. Justering av terskelen for å velge mitokondrier. (E,F) Det målte mitokondrieområdet, omkretsen, lengden (hoved), bredde (mindre) og sideforhold (AR) som tilsvarer den valgte mitokondriene i (E). (G) Representative bilder av mitokondrier i WT og SPG15 telencephalic glutamatergic nevroner. Skala stenger = 20 μm. (H) Mitokondrielengde i WT og SPG15 nevroner. (I) Sideforhold mellom mitokondrier i WT og SPG15 nevroner. **p < 0,01 vs. WT. (G), (H) og (I) er endret fra en tidligere studie13. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Fluorescerende verktøy | Fordeler | Ulemper | Referanser |
| MitoTracker (andre) | MitoTracker er mitokondrie potensial-uavhengig og kan brukes til å analysere kolokalisering av mitokondrier med autophagosome eller lysosom. | MitoTracker er ikke photostable nok for langsiktig forskning. | 35 |
| NPA-TPP (andre) | Dette ye er en roman photostable mitokondrie merking reagens. | Syntese- og rensingsprosessen av dette hellet er tidkrevende og kostbart. | 23 |
| Mitobady (andre artilleri) | Dette farge kan brukes til mitokondrievisualisering ved hjelp av Raman mikroskopi med høy følsomhet og spesifisitet. | Bruk av dette farge krever Raman mikroskop. | 25 |
| TMRE (andre) | Dette farge er en giftfri, spesifikk mitokondriefarging farge med lav konsentrasjon og ingen slukkende effekt. | TMRE merking mitokondrier avhenger av mitokondriemembranpotensialet. | 36, 37 |
| Mitokondrier-målrettede fluorescerende proteiner | Mitokondrier-målrettede fluorescerende proteiner er mer spesifikke og stabile. | Denne metoden trenger transfection og transfection effektivitet er forskjellig for ulike celletyper. | 38, 39 |
Tabell 1: Fordeler og ulemper ved noen fluorescerende verktøy for mitokondriemerking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en metode for å analysere mitokondrietransport og morfologi i nevronale aksoner ved hjelp av rød fluorescerende dye og ImageJ-programvare, som begge gir en unik plattform for å studere aksonal degenerasjon og mitokondriemorfologi i nevrodegenerativ sykdom. Det er flere kritiske trinn i protokollen, inkludert farging av mitokondrier, levende celleavbildning og analyse av bildene. I denne metoden ble et fluorescerende farge brukt til å flekke mitokondrier. Siden menneskelige iPSC-avledede nevroner lett er løsrevet fra parabolen, er det viktig å la noen løsning i parabolen og forsiktig legge neurobasal medium. Vaskingen kan utføres tre eller fire ganger for å fjerne dye. I tillegg kan mitokondrier merkes med andre journalister for å måle sin transport langs aksoner, for eksempel fluorescerende protein smeltet mitokondrier rettet mot proteiner6. I langsiktig sporing viste flere sonder (dvs. NPA-TPP, 2,1,3-benzothiadiazole [BTD] fluorescerende derivater, og en bestemt Raman-sonde) stort potensial i langsiktig mitokondriesporing og mitokondriedynamikkanalyse23,24,25. Fordelene og ulempene ved ulike sonder finnes i tabell 1.
Etter mitokondriefarging utføres levende celleavbildning ved hjelp av et mikroskop utstyrt med en inkubator. For effektivt å fokusere nevronene under bildebehandling, bør nevrale prøver holdes i 37 ° C inkubatoren med 5% CO2 og i et fuktig miljø i minst 15 min. For å minimere de ut-av-fokus effekter, bilder på forskjellige Z-posisjoner kan tas for å lage en Z-stabel, eller auto-fokus funksjonen kan benyttes. Viktigere, for å identifisere retningen av mitokondrietransport (anterograde eller retrograd), fasebilder er tatt for å skille nevronal celle kropp og aksoner. Et annet kritisk problem er fotobleking av fluorescerende prøver, som må forhindres for å oppnå effektive mitokondrietransport tidsforløpsbilder. En effektiv metode for å minimere fotobleking er å fokusere prøver gjennom okularet og sette alle bildeparametere under fasekanalen, med unntak av eksponeringstid. Videre kan det automatiske skaleringsmønsteret redusere fotobleking av fluorescens.
Mitokondrier er svært dynamiske organeller og kan bevege seg i både anterograde og retrograde retninger. I nevroner forblir noen få mitokondrier i aksoner stasjonære under opptaket. Blant de bevegelige mitokondriene kan bevegelsesstatusen variere over tid. Dette fenomenet reiser det viktige spørsmålet om hvilken mitokondritype anses stasjonær eller bevegelig. Dette kan løses ved å sette terskelen under mitokondrieaksonal transportanalyse. For å skille mellom de statiske mitokondriene brukte Neumann et al. mitokondriebanesenteret, som er definert som gjennomsnittet for posisjonskoordinatene over tid, og sett deretter terskelen til 350 nm/s slik at den maksimale avviksavstanden til mitokondrionen fra sporsenteret er i første ramme26. I en annen studie setter forfatterne 50 nm/s som terskelen for å skille stasjonær status fra flyttestatusen27. En 300 nm / s terskel ble brukt her for å skille mikrotubulbasert transport som gjort i tidligere rapporter28,29. Selv om terskelen for stasjonære og bevegelige mitokondrier er forskjellig, kan det å sette terskelen gi viktig relativ informasjon om mitokondriebevegelse i aksoner mellom villtype og degenerative nevroner.
De fleste protokoller som involverer mitokondrietransportanalyse har brukt kymograms, som er todimensjonal representasjon av posisjoner versus tid. Flere automatiserte verktøy er utviklet for analyse av partikkelsporing26,30,31,32,33,34. Disse kan nøyaktig skille hver ramme. I tillegg til hastighetog motile prosent som ImageJ kan måle, denne metoden kan måle motile hendelser nøyaktig. Disse er imidlertid ikke gratis å bruke. Her ble analysen av mitokondrietransport utført ved hjelp av ImageJ med "Multikymograph" og "Makroer" plugins. Disse plugins kan effektivt måle mitokondrie bevegelse. Fordelen med disse plugins er deres brukervennlighet og evne til å indikere endringer i mitokondrie aksonal transport i form av kymografer og hastighet over tid.
Motile mitokondrier ble analysert i SPG3A og kontroll nevroner. En lignende reduksjon i prosentandelen av motilmitokondrier ble observert ved hjelp av to forskjellige analysemetoder, noe som bekrefter nytten av ImageJ for å analysere aksonal transport. I tillegg kan mitokondriemorfologi analyseres ved hjelp av samme sett med bilder, noe som gir viktige avlesninger for å studere mitokondriedysfunksjon i ulike nevrologiske sykdommer. Siden aksonal degenerasjon og mitokondriedysfunksjon vanligvis forekommer i tidligere stadier, før nevroner dør, kan denne metoden brukes til å undersøke tidlige patologiske forandringer for å identifisere molekylære veier og skjermterapeutiske midler for å redde nevrodegenerasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Spastic Paraplegia Foundation, Blazer Foundation og NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
