Summary
El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están involucrados en diversas enfermedades neurodegenerativas. El protocolo presentado utiliza neuronas anticerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en paraplejia espástica hereditaria. Este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axones y el análisis de su morfología, lo que facilitará el estudio de la enfermedad neurodegenerativa.
Abstract
Las neuronas tienen intensas demandas de alta energía con el fin de apoyar sus funciones. Se ha observado un deterioro del transporte mitocondrial a lo largo de los axones en las neuronas humanas, que puede contribuir a la neurodegeneración en varios estados de la enfermedad. Aunque es difícil examinar la dinámica mitocondrial en los nervios humanos vivos, estos paradigmas son críticos para estudiar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración. Aquí se describe un protocolo para analizar el transporte mitocondrial y la morfología mitocondrial en axónicos de neuronas forebrain derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Los IPSCse se diferencian en neuronas glutamatérgicas telencéfalas utilizando métodos bien establecidos. Las mitocondrias de las neuronas están manchadas con MitoTracker CMXRos, y el movimiento mitocondrial dentro de los axones se captura mediante un microscopio de imágenes de células vivas equipado con una incubadora para el cultivo celular. Las imágenes de lapso de tiempo se analizan utilizando software con plugins "MultiKymograph", "Bioformat importer" y "Macros". Se generan kymographs de transporte mitocondrial, y la velocidad mitocondrial promedio en las direcciones anteroógradas y retrógradas se lee en el kymograph. En cuanto al análisis de morfología mitocondrial, la longitud mitocondrial, el área y la relación de aspecto se obtienen utilizando el ImageJ. En resumen, este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axons y el análisis de su morfología para facilitar los estudios de enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
La motilidad mitocondrial y la distribución juegan un papel vital en el cumplimiento de las demandas energéticas variables y especializadas en las neuronas polarizadas. Las neuronas pueden extender axónes extremadamente largos para conectarse con objetivos a través de la formación de sinapsis, que exigen altos niveles de energía para Ca2+ amortiguación y corrientes ióndas. El transporte de mitocondrias de soma a axón es fundamental para apoyar la función axonal y sináptica de las neuronas. El movimiento mitocondrial dinámica espacial y temporal se lleva a cabo mediante un transporte axonal rápido a velocidades de varios micrómetros por segundo1.
Específicamente, las proteínas motoras o adaptadoras, como la cinaína y la dinanina, participan en el transporte rápido de orgánulos a lo largo de los microtúbulos para controlar el movimiento de las mitocondrias2,3. La actividad neuronal normal requiere el transporte adecuado de las mitocondrias recién ensambladas desde el soma neuronal al axón distal (transporte axonal anterogrado) y el transporte inverso de mitocondrias desde el axón distal de vuelta al cuerpo celular (transporte retrógrado). Estudios recientes han indicado que la asignación mitocondrial inadecuada está fuertemente asociada con defectos neuronales y enfermedades degenerativas de neuronas motoras4,5. Por lo tanto, para diseccionar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración, es importante establecer métodos para examinar el movimiento mitocondrial a lo largo de los axons en cultivos vivos.
Hay dos desafíos principales en el examen y análisis del seguimiento de las mitocondrias: (1) identificar las mitocondrias desde el fondo en cada fotograma, y (2) analizar y generar las conexiones entre cada fotograma. Para resolver el primer desafío, se utiliza ampliamente un enfoque de etiquetado de fluorescencia para distinguir las mitocondrias del fondo, como el tinte MitoTracker o la transfección de la proteína de orientación mitocondrial fusionada con fluorescencia (por ejemplo, mito-GFP)6,7,8. Para analizar la asociación entre fotogramas, en estudios anteriores9se han descrito varios algoritmos y herramientas de software. En un artículo reciente, los investigadores compararon cuatro herramientas automatizadas diferentes (por ejemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck y Difference Tracker) para cuantificar el transporte mitocondrial. Los resultados mostraron que, a pesar de las discrepancias en la longitud de la pista, el desplazamiento mitocondrial, la duración del movimiento y la velocidad, estas herramientas automatizadas son adecuadas para evaluar la diferencia de transporte después del tratamiento10. Además de estas herramientas, un plugin integrado "Macros" para ImageJ (escrito por Rietdorf y Seitz) ha sido ampliamente utilizado para analizar el transporte mitocondrial11. Este método genera kymographs que se pueden utilizar para analizar el movimiento mitocondrial, incluyendo la velocidad en direcciones anterogradas y retrógradas.
Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos que cambian constantemente en número y morfología en respuesta a condiciones fisiológicas y patológicas. La fiscalidad mitocondrial y la fusión regulan estrechamente la morfología mitocondrial y la homeostasis. El desequilibrio entre la fission mitocondrial y la fusión puede inducir redes mitocondriales extremadamente cortas o largas, lo que puede afectar la función mitocondrial y dar lugar a actividades neuronales anormales y neurodegeneración. El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están implicados en diversas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la paraplejia espástica hereditaria (HSP)12,13,14,15. El HSP es un grupo heterogéneo de trastornos neurológicos hereditarios caracterizadopor la degeneración del tracto corticoespinal y la posterior falta de control de los músculos inferiores de las extremidades16,17. En este estudio, las neuronas forebrain derivadas de iPSC se utilizan para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en HSP. Este método proporciona un paradigma único para examinar la dinámica mitocondrial de los axons neuronales en cultivos vivos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generación de neuronas glutamatérgicas telencéfalas a partir de ISCs
NOTA: El protocolo detallado para mantener los iPSC y su diferenciación en neuronas glutamatérgicas telencéfalas son similares a los descritos anteriormente18. Aquí, se introduce y resalta el proceso crítico durante la diferenciación de células madre pluripotentes humanas.
- IPSCs de cultivo en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en un medio de células madre embrionarias humanas (hESC) complementados con factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF, 4 ng/mL).
- Después de la incubación con dosis (1 mg/ml) durante 3 min, disociar los IPSC en pequeños grumos. A continuación, cultivo de los agregados iPSC en suspensión en el medio hESC durante 4 días. Consulte este punto de tiempo, cuando los iPSC comienzan como el cultivo de suspensión, como el día 1 (D1). Cambie el medio diariamente durante 4 días.
- En D5, recoja los agregados iPSC después de la centrifugación a 200 x g durante 2 min y el cultivo en medios de inducción neuronal (NIM) durante 3 días. Cultivo de los agregados de celda en suspensión durante 3 días cambiando la mitad de los medios cada 2 días. Agregue DMH-1 (2 m) y SB431542 (2 m) al medio NIM para aumentar la eficiencia de inducción neuronal.
- En D8, recoja los agregados iPSC después de la centrifugación a 200 x g durante 2 min y déjelos adherirse a 6 placas de pozo (alrededor de 20-30 agregados por pozo de la placa) mediante el cultivo en NIM con 10% FBS (o con placas recubiertas de laminina) durante la noche. Al día siguiente, retire el medio antiguo y cambie a NIM cada 2 días hasta D17.
NOTA: La generación de células neuroepiteliales, que se indica mediante la formación de células columnares con estructuras de roseta, se observa en este período. - En D17, aislar mecánicamente las células neuroepiteliales en el centro de las colonias (levantar directamente aplicando una pequeña presión al centro de las colonias) o enzimáticamente (tratada con dispensa). Transfiera las células neuroepiteliales aisladas al matraz T25 de cultivo t25 no tratado que contiene 8 ml de NIM con adición de B27 (1x), campo (1 m) e IGF (10 ng/ml).
NOTA: El cultivo de suspensión permite a las células formar neuroesferas enriquecidas con progenitores neuronales de proyección cortical. - Después de D35, placa las neuroesferas en la poliornitina y lDEV libre de factor de crecimiento reducido matriz de membrana sótano(Tabla de materiales)platos de fondo de vidrio recubiertos 35 mm para generar neuronas glutamatérgicas telencéfalas (neuronas de proyección cortical). Antes del revestimiento, disociar las neuroesferas a pequeños racimos incubando con 1 mg/ml de solución de desprendimiento celular durante 2 min a 37oC.
- Retire la solución de desprendimiento celular por centrifugación y resuspenda en 1 ml de medio de diferenciación neuronal (NDM). Células de placa en el plato inferior de vidrio (alrededor de cinco racimos en 100 s de medio por plato) para dejarlas acoplar. A continuación, agregue NDM (1 mL por plato) y el cultivo de las células en NDM que contienen B27 (1x), cAMP (1 m), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) y GDNF (10 ng/mL).
NOTA: Los pequeños racimos están chapados porque sobreviven bien y dan lugar a neuronas de proyección larga. Alternativamente, las células se pueden disociar y chapar a una densidad alrededor de 20.000 células por plato para una mejor separación. - Caracterizar las neuronas glutamatérgicas telencéfalas inmunomanchando los marcadores Tbr1 y III-tubulina.
2. Examen del transporte mitocondrial a lo largo de axones de neuronas glutamatérgicas telencéfalas
- Caliente el NDM y encienda la incubadora para el microscopio de fluorescencia a 37oC y 5%CO2.
- Para visualizar las mitocondrias a lo largo de los axones de las neuronas forebrain, incubar las neuronas con un tinte fluorescente rojo de 50 nM a las mitocondrias de manchas en células vivas (por ejemplo, MitoTracker CMXRos) en NDM durante 3 min a 37 oC. A continuación, lave las células 2veces con NDM caliente. Las neuronas se incuban en NDM.
- Para grabar el transporte mitocondrial a lo largo de los axons, tome imágenes de lapso de tiempo del movimiento mitocondrial utilizando el objetivo 40x con un microscopio de fluorescencia.
NOTA: Para estabilizar el cultivo, realice la imagen de células vivas cuando las células se incuban en la incubadora durante 20 minutos después de la tinción mitocondrial. - En el campo de fase, identificar los axons en función de las características morfológicas (directamente emergen del cuerpo de las células neuronales, neurites largos delgados constantes sin ramificación). Las mitocondrias se mueven en anterogrado (del cuerpo celular al axón distal) y direcciones retrógradas (desde el terminal axonal hasta el cuerpo celular). Para distinguir la dirección del movimiento mitocondrial a lo largo de los axons, identifique claramente los cuerpos celulares de las neuronas. En este paso, enfoque axons en el campo de fase para reducir el fotoblanqueo.
- Después de distinguir el cuerpo celular y el axón, ajuste el tiempo de exposición y el enfoque de las mitocondrias en los axones. A continuación, capturar el transporte de las mitocondrias dentro de los axons cada 5 s para una duración total de 5 min, produciendo 60 fotogramas. Captura aleatoriamente al menos cinco ubicaciones para cada plato y repite 3 veces para cada grupo.
3. Análisis de datos del transporte mitocondrial y morfología en neuronas corticales
NOTA: Analizar los datos recogidos sobre el transporte mitocondrial utilizando un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ o MetaMorph19). Dado que ImageJ está fácilmente disponible, realice el análisis del transporte mitocondrial y la morfología utilizando ImageJ con los plugins MultiKymograph, Macrosy Analyze particles.
- Análisis del transporte mitocondrial con ImageJ
- Después de capturar las imágenes de lapso de tiempo de la motilidad mitocondrial, analiza la velocidad y el movimiento de las mitocondrias usando el plugin MultiKymograph. Las imágenes se guardan como archivos de formato .tiff, que son analizados por el software de Fiji siguiendo un método reportado previamente20.
- Descargue el software Fiji. Descarga plugins que serán necesarios para analizar la velocidad de movimiento mitocondrial de los kymographs. Descargue el paquete de formatos biológicos y kymograph Plugin junto con estos cuatro plugins .class, incluidos: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class y WalkingAverage.class (Tabla de materiales). Mueva estos archivos a la carpeta de plugins de Fiji. Descargue los plugins "tsp050706.txt" en la carpeta plugins. Reinicie el software Fiji cuando los archivos se muevan a la carpeta de plugins.
- Abra el software Fiji. Elija pluginsy, a continuación, importe imágenes de la serie .tiff a través de Bio-Formats Importer en Bioformatos. Asegúrese de elegir Standard ImageJ en Stack viewing, elija Open all series, marque Autoscaley, a continuación, haga clic en OK . Tome nota del número de fotograma y el tamaño de las imágenes en píxeles, que se muestran en la parte superior de la imagen.
NOTA: Tome 60 fotogramas por imagen. - Considere la posibilidad de hacer las imágenes más claras ajustando el brillo/contraste en el menú Imagen para los 60 fotogramas.
- Haga clic con el botón derecho del botón derecho en la herramienta de línea para elegir la línea segmentada y dibuje una línea segmentada a partir del cuerpo de la celda y terminando en el axón terminal. Genere el kymograph eligiendo MultipleKymograph en Plugins. La selección del ancho de línea se solicita después de elegir el MultipleKymograph. Asegúrese de que este es un número impar. Elija 1 para el ancho de línea. Después de este paso se genera un kymograph.
NOTA: Se pueden leer varias piezas importantes de información del kymograph. El eje Y del kymograph es el tiempo de duración (5 min) para los 60 fotogramas. El eje x representa la posición de los axones seleccionados. - Utilice una línea diagonal en el kymograph para determinar la dirección de movimiento de las mitocondrias (anterogradas, retrógradas o estables). Por ejemplo, una línea que baja a la derecha a lo largo del eje Y indica un movimiento anterogrado, y una línea que baja a la izquierda a lo largo del eje Y indica un movimiento retrógrado. Una línea vertical indica que no hubo movimiento en el mitocondrion.
- Mida la distancia, los valores de tiempo y la velocidad de las mitocondrias en movimiento utilizando el plugin Macros en el software Fiji. Ir a Plugins ? Macros de la página de macros de la Instalar ? tsp050607.txt. Dibuje una línea segmentada sobre el rastro del movimiento mitocondrial en el cimagrafo, y siempre dibuje la línea de la región superior a inferior (eje y).
- Después de dibujar la línea, vaya a Plugins Macros de la página de macros de la leer las velocidades de tsp. Puesto que se dibuja una línea segmentada a lo largo del trazado, el plugin lee las velocidades segmentadas correspondientes a la línea.
NOTA: La unidad para todos los datos es píxeles. dy sum es el tiempo consumido desde el punto de partida, y dx sum indica la distancia del mitocondrion moviéndose en el eje X. dy now y dx ahora muestra el período de tiempo y la distancia de movimiento para cada segmento, respectivamente. velocidad real muestra la velocidad para cada segmento (dx now/dy now). la velocidad media indica la velocidad media para el movimiento mitocondrial (suma dx/suma de dy). - Cambie la unidad de dx ahora de píxel a m como la proporción de píxeles en m midiendo la barra de escala. Convierta la unidad para la distancia de píxel a m midiendo las barras de escala en las imágenes. Utilice la herramienta de línea para dibujar una línea a lo largo de la barra de escala y medir la longitud de la línea seleccionando Medir' en "Analizar. Cambia el tiempo de píxel a segundos, como 1 píxel a 5 segundos en este experimento.
- En el archivo de hoja de cálculo, calcule la velocidad media y etiqueta el movimiento retrógrado o anterogrado correspondientemente. Promedio de la velocidad de movimiento anterograda o retrógrada.
- Determinar el porcentaje de mitocondrias estacionarias y móviles a partir del kymograph. Las mitocondrias móviles anterogradas o retrógradas se definen como moviéndose 5 m hacia adelante o hacia atrás desde el origen durante todo el período21. Las mitocondrias se consideran estacionarias si no se movieron más de 5 m durante los 5 minutos.
- Análisis de la morfología mitocondrial utilizando ImageJ
NOTA: Determine la morfología mitocondrial mitocondrial midiendo la longitud mitocondrial, el área y la relación de aspecto utilizando ImageJ. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.- Para analizar la longitud mitocondrial y el área dentro de los axons, descargue el plugin Straighten_.jar desde el sitio web de ImageJ (consulte Tabla de materiales)y muévalo a la carpeta de plugins. Reinicie el software ImageJ.
- Abra la imagen a través de la función abrir en Archivo y convierta la imagen de 32 bits a 8 bits usando Tipo en Imagen.
- Dibuja una línea segmentada a lo largo de los axons. Elija Enderezar en Plugins y establezca 50 píxeles para Anchura de filamento/Línea ancha. Esto generará un axón enderezado.
- Ajustar el umbral en Imagen y establecer la medida en Analizar seleccionando "Area ? Perímetro de la página de perímetro de la Ajustar la elipse ? Descriptores de forma.
- Mida la barra de escala utilizando la función de línea y establezca la escala en Analizar rellenando la distancia en píxeles,conocer la distanciay la unidad de longitud. A continuación, elija Global para establecer esta configuración de escala.
- Utilice Analizar partículas en Analizar para determinar el área. Los parámetros de la solicitud son el tamaño (píxel 2) a 0,20–infinito, la circularidad de 0,00 a 1,00 y se muestran a las elipses. Seleccione Mostrar resultados.
NOTA: La medición producirá los resultados de múltiples parámetros de morfología mitocondrial, incluidos el área, los perímetros, la longitud (mayor), la anchura (menor) y la relación de aspecto (AR). También se muestra el número mitocondrial correspondiente. - Calcule el número mitocondrial por axón (m) utilizando el número mitocondrial dividido por la longitud axonal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aquí, los IPSC humanos se diferenciaron en neuronas glutamatérgicas telencéfalas, que se caracterizaban por inmunostaining con marcadores de tubulina Tbr1 y III(Figura 1A). Para examinar el transporte axonal de las mitocondrias, estas células se teñían con un tinte fluorescente rojo y se realizaban imágenes de lapso de tiempo. Dado que ImageJ está fácilmente disponible y es más fácil de obtener, el transporte mitocondrial se analizó más a fondo con los plugins "MultiKymograph" y "Macros" ImageJ, que se muestran en la Figura 1.
Hay tres estados respectivos de movimiento mitocondrial, incluyendo movimiento estático, anterogrado y retrógrado(Figura 1B,C). Un solo mitocondrion puede permanecer estático o moverse en dirección anterograda o retrógrada dentro de un axón, y aquí, se dibujó una línea segmentada a lo largo de la pista del movimiento mitocondrial para determinar la velocidad(Figura 1D). La velocidad del movimiento mitocondrial a lo largo del axón se muestra en la Figura 1E y corresponde a las líneas segmentadas en la Figura 1D después de leer por "Macros" en ImageJ. Al igual que el software MetaMorph, ImageJ se puede utilizar para determinar la velocidad mitocondrial y el porcentaje de mitocondrias motiles basados en el kymograph generado por ImageJ (Figura 1F). Utilizando software de análisis disponible comercialmente (por ejemplo, MetaMorph), datos anteriores mostraron que el porcentaje de mitocondrias móviles se redujo significativamente en las neuronas SPG3A en comparación con las neuronas normales, mientras que la velocidad no se alteró19. Para evaluar el software ImageJ, se examinó el porcentaje de mitocondrias móviles, y se observó una reducción similar en el porcentaje de mitocondrias móviles en las neuronas SPG3A en comparación con las neuronas de tipo silvestre (WT) de control (Figura 1G).
En cuanto al análisis de la morfología mitocondrial, el área mitocondrial, la longitud y la AR se analizaron utilizando la función "analizar partículas" en ImageJ. Los axons se enderezaron usando el plugin "straighten"(Figura 2A,B). Las mitocondrias se eligieron claramente ajustando el umbral(Figura 2C,D). Por último, el área mitocondrial, la longitud (mayor), la anchura (menor), la relación de aspecto y el perímetro se obtuvieron del axón enderezado utilizando el plugin "Analizar partículas"(Figura 2E,F). La morfología mitocondrial anormal se observó (y se ha observado previamente) en las neuronas glutamatérgicas telencéfalas derivadas de HSP iPSC, incluidas las células SPG15(Figura 2G,H,I)13,22. Tanto la longitud mitocondrial como la relación de aspecto se redujeron significativamente en los axónicos de las neuronas SPG15 en comparación con los axónicos de las neuronas WT de control(Figura 2G,H,I).
Figura 1: Análisis del transporte mitocondrial utilizando ImageJ. (A) Inmunostación que muestra la generación de neuronas glutamatérgicas telencéfalas. Tbr1 (rojo), tubulina III (verde) y Hoechst (azul). Barras de escala a 50 m. Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior19. (B) Transporte mitocondrial dentro de axónes de neuronas. El movimiento mitocondrial anterogrado se define como las mitocondrias que se mueven desde el cuerpo celular al axón distal, y el movimiento mitocondrial retrógrado se origina en el axón distal y se extiende al cuerpo de la célula neuronal. La línea de segmento se dibuja a lo largo de los axones desde el cuerpo de las células neuronales hasta el terminal axonal distal para generar kymographs. (C) Kymograph se genera utilizando ImageJ; el eje x es la posición axonal y el eje Y es el tiempo. Una línea blanca continua es el mitocondrión que se mueve en dirección anterograda (cabeza de flecha rosa), dirección retrógrada (cabeza de flecha azul) o estado estático (cabeza de flecha amarilla amarilla). (D) La línea segmentada se dibuja para leer la velocidad utilizando el plugin Macros. Los números 1–8 describen el segmento de la línea. El movimiento anterogrado (1–4, 6, 8) y el estado estático (5, 7) se pueden distinguir de este kymograph magnificado. (E) Tiempo y distancia móvil para cada segmento, velocidad real y media (en píxeles). (F) Kymograph del transporte mitocondrial para P corticales WT y SPG3A utilizando ImageJ. Barra de escala a 10 m. (G) Relación mitocondrial móvil en PN corticales WT y SPG3A utilizando ImageJ (*p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de la morfología mitocondrial utilizando ImageJ. (A) Parámetros para enderezar el axón. (B) El representante enderezó el axón. (C,D) Ajuste del umbral para elegir las mitocondrias. (E,F) El área mitocondrial medida, el perímetro, la longitud (mayor), la anchura (menor) y la relación de aspecto (AR) correspondientes a las mitocondrias seleccionadas en (E). (G) Imágenes representativas de las mitocondrias en las neuronas glutamatérgicas telencéfalas WT y SPG15. Barras de escala a 20 m. (H) Longitud mitocondrial en las neuronas WT y SPG15. (I) Relación de aspecto de las mitocondrias en las neuronas WT y SPG15. **p < 0.01 vs. WT. (G), (H) y (I) se modifican de un estudio anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Herramientas fluorescentes | Ventajas | Desventajas | Referencias |
| MitoTracker | MitoTracker es independiente del potencial mitocondrial y se puede utilizar para analizar la colocalización de las mitocondrias con autofagosoma o lisosoma. | MitoTracker no es lo suficientemente fácil de fotos para la investigación a largo plazo. | 35 |
| NPA-TPP | Este tinte es un nuevo reactivo de etiquetado mitocondrial fotostable. | El proceso de síntesis y purificación de este tinte es lento y costoso. | 23 |
| MitoBADY | Este tinte se puede utilizar para la visualización mitocondrial utilizando microscopía Raman con alta sensibilidad y especificidad. | El uso de este tinte requiere un microscopio Raman. | 25 |
| TMRE | Este tinte es un tinte mitocondrial específico no tóxico con baja concentración y sin efecto de enfriamiento. | El etiquetado TMRE mitocondrias depende del potencial de la membrana mitocondrial. | 36, 37 |
| Proteínas fluorescentes dirigidas a las mitocondrias | Las proteínas fluorescentes dirigidas a las mitocondrias son más específicas y estables. | Este método necesita transfección y la eficiencia de transfección es diferente para diferentes tipos de células. | 38, 39 |
Tabla 1: Ventajas y desventajas de algunas herramientas fluorescentes para el etiquetado mitocondrial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este artículo describe un método para analizar el transporte mitocondrial y la morfología en axones neuronales utilizando tinte fluorescente rojo y software ImageJ, que proporcionan una plataforma única para estudiar la degeneración axonal y la morfología mitocondrial en enfermedades neurodegenerativas. Hay varios pasos críticos en el protocolo, incluyendo la tinción de las mitocondrias, la creación de imágenes de células vivas y el análisis de las imágenes. En este método, se utilizó un tinte fluorescente para manchar las mitocondrias. Dado que las neuronas humanas derivadas de iPSC se separan fácilmente del plato, es importante dejar alguna solución en el plato y añadir suavemente el medio neurobasal. El lavado se puede realizar tres o cuatro veces para eliminar el tinte. Además, las mitocondrias se pueden etiquetar con otros reporteros para medir su transporte a lo largo de los axón, como las mitocondrias fusionadas con proteínas fluorescentes dirigidas a proteínas6. En el seguimiento a largo plazo, varias sondas (es decir, NPA-TPP, 2,1,3-benzotiadiazol [BTD] derivados fluorescentes, y una sonda Raman específica) mostraron un gran potencial en el seguimiento mitocondrial a largo plazo y análisis de dinámica mitocondrial23,24,25. Las ventajas y desventajas de varias sondas se pueden encontrar en la Tabla 1.
Después de la tinción mitocondrial, la imagen de células vivas se realiza mediante un microscopio equipado con una incubadora. Para enfocar eficazmente las neuronas durante la toma de imágenes, las muestras neuronales deben mantenerse en la incubadora de 37 oC con 5% deCO2 y en un ambiente húmedo durante al menos 15 minutos. Para minimizar los efectos fuera de foco, se pueden tomar imágenes en diferentes posiciones Z para hacer una pila Z, o se puede utilizar la función de enfoque automático. Es importante destacar que, para identificar la dirección del transporte mitocondrial (anterogrado o retrógrado), se toman imágenes de fase para distinguir el cuerpo celular neuronal y los axones. Otro problema crítico es el fotoblanqueo de muestras fluorescentes, que deben prevenirse para obtener imágenes eficientes de lapso de tiempo de transporte mitocondrial. Un método eficaz para minimizar el fotoblanqueo es enfocar las muestras a través del ocular y establecer todos los parámetros de imagen bajo el canal de fase, excepto el tiempo de exposición. Además, el patrón de escalado automático puede disminuir el fotoblanqueo de la fluorescencia.
Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos y pueden moverse en direcciones anterogradas y retrógradas. En las neuronas, algunas mitocondrias dentro de los axons permanecen estacionarias durante la grabación. Entre las mitocondrias en movimiento, el estado del movimiento puede variar con el tiempo. Este fenómeno plantea la importante cuestión de qué tipo de mitocondrias se considera estacionaria o en movimiento. Esto se puede resolver estableciendo el umbral durante el análisis de transporte axonal mitocondrial. Para distinguir las mitocondrias estáticas, Neumann y otros utilizaron el centro de la vía mitocondrial, que se define como la media de sus coordenadas de posición a lo largo del tiempo, luego establecen el umbral en 350 nm/s de modo que la distancia máxima de desviación del mitocondrion de su centro de oruga sestá en el primer fotograma26. En otro estudio, los autores establecen 50 nm/s como umbral para distinguir el estado estacionario del estado móvil27. Aquí se utilizó un umbral de 300 nm/s para distinguir el transporte basado en microtúbulos, tal como se ha hecho en los informes anteriores28,29. Aunque el umbral para las mitocondrias estacionarias y móviles es diferente, establecer el umbral puede proporcionar información relativa importante sobre el movimiento mitocondrial dentro de los axones entre neuronas de tipo salvaje y degenerativas.
La mayoría de los protocolos que implican análisis de transporte mitocondrial han utilizado yomogramas, que son representación bidimensional de las posiciones frente al tiempo. Se han desarrollado múltiples herramientas automatizadas para el análisis de seguimiento de partículas26,30,31,32,33,34. Estos pueden separar con precisión cada fotograma. Además de la velocidad y el porcentaje móvil que ImageJ puede medir, este método puede medir eventos móviles con precisión. Sin embargo, estos no son de uso gratuito. Aquí, el análisis del transporte mitocondrial se realizó utilizando ImageJ con los plugins "Multikymograph" y "Macros". Estos plugins pueden medir eficazmente el movimiento mitocondrial. La ventaja de estos plugins es su facilidad de uso y su capacidad para indicar alteraciones en el transporte axonal mitocondrial en forma de kymographs y velocidad a lo largo del tiempo.
Se analizaron mitocondrias motiles en SPG3A y en las neuronas de control. Se observó una reducción similar en el porcentaje de mitocondrias móviles utilizando dos métodos de análisis diferentes, confirmando la utilidad de ImageJ para analizar el transporte axonal. Además, la morfología mitocondrial se puede analizar utilizando el mismo conjunto de imágenes, que proporciona importantes lecturas para el estudio de la disfunción mitocondrial en diversas enfermedades neurológicas. Dado que la degeneración axonal y la disfunción mitocondrial suelen ocurrir durante etapas tempranas, antes de que las neuronas mueran, este método se puede utilizar para examinar los cambios patológicos tempranos para ayudar a identificar las vías moleculares y la terapia de la pantalla para rescatar Neurodegeneración.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Paraplejia Espástica, la Fundación Blazer y la NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
