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Cancer Research

फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स से कैस्टेशन-प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर रोगियों से छोटे गैर-कोडिंग आरएनए को अनुक्रमित करना

Published: November 19, 2019 doi: 10.3791/60549
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Augusta University, 2Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center and University of California, San Francisco, 3Department of Pathology, Veterans Affairs Medical Center and University of California, San Francisco

Summary

चिकित्सा प्रतिरोध अक्सर उन्नत प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों में विकसित होता है, और कुछ मामलों में, कैंसर न्यूरोएंडोक्राइन प्रोस्टेट कैंसर नामक घातक उपप्रकार की प्रगति करता है। छोटे गैर कोडिंग आरएनए मध्यस्थता आणविक परिवर्तन है कि इस संक्रमण की सुविधा का आकलन बेहतर रोग स्तरीकरण और कारण तंत्र है कि न्यूरोएंडोक्राइन प्रोस्टेट कैंसर के विकास के लिए नेतृत्व की पहचान की अनुमति होगी ।

Abstract

एंड्रोजन रिसेप्टर (एआर) का एब्लेशन एंड्रोजन अभाव द्वारा संकेत देना प्रोस्टेट कैंसर के लिए चिकित्सा की पहली पंक्ति का लक्ष्य है जिसके परिणामस्वरूप शुरू में कैंसर प्रतिगमन होता है। हालांकि, मामलों की एक महत्वपूर्ण संख्या में, रोग उन्नत, बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर (सीआरपीसी) की प्रगति करता है, जिसमें सीमित चिकित्सीय विकल्प होते हैं और अक्सर आक्रामक होते हैं। दूर मेटाटैसिस ज्यादातर आक्रामक बीमारी के इस चरण में मनाया जाता है। सीआरपीसी का इलाज एआर पाथवे अवरोधकों की दूसरी पीढ़ी द्वारा किया जाता है जो शुरू में अस्तित्व में सुधार करते हैं, जिसके बाद चिकित्सा प्रतिरोध के उद्भव होते हैं। न्यूरोएंडोक्राइन प्रोस्टेट कैंसर (एनईपीसी) प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) का एक दुर्लभ संस्करण है जो अक्सर न्यूरोएंडोक्राइन भेदभाव (एनईडी) के रूप में जानी जाने वाली ट्रांसविडेशन प्रक्रिया के माध्यम से चिकित्सा प्रतिरोध के परिणामस्वरूप विकसित होता है, जिसमें पीसीए कोशिकाएं वंश स्विच से गुजरती हैं एडेनोकार्सिनोमा से और न्यूरोएंडोक्राइन (एनई) वंश मार्कर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति दिखाते हैं। जीनोमिक परिवर्तन के अलावा जो एनईपीसी के लिए प्रगति और पारदर्शिया को ड्राइव करते हैं, एपिजेनेटिक कारकों और माइक्रोएनवायरमेंटल संकेतों को ड्राइविंग रोग प्रगति में आवश्यक खिलाड़ी माना जाता है। यह पांडुलिपि एपिजेनेटिक ड्राइवरों (यानी छोटे गैर-कोडिंग आरएनए) की पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है जो उन्नत पीसीए से जुड़े हुए हैं। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) मेटास्टैटिक ऊतकों और इसी सीरम-व्युत्पन्न एक्स्सेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) से शुद्ध माइक्रोआरएनए का उपयोग करना, प्रोटोकॉल अनुक्रमण के लिए उचित गुणवत्ता नियंत्रण के साथ पुस्तकालयों को तैयार करने का वर्णन करता है इन नमूना स्रोतों से माइक्रोआरएनए। एफएफपीई और ईवीएस दोनों से आरएनए को अलग करना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि इसमें से अधिकांश या तो अपमानित होते हैं या मात्रा में सीमित होते हैं। यह प्रोटोकॉल अनुक्रमण पर सबसे विशिष्ट पढ़ता है और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उपज करने के लिए आरएनए इनपुट और सीडीएनए पुस्तकालयों को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न तरीकों के बारे में विस्तार से बताया जाएगा।

Introduction

प्रोस्टेट कैंसर एआर सिग्नलिंग के माध्यम से अभिनय एंड्रोजन द्वारा संचालित है। इसलिए, एआर पाथवे को लक्षित करना बीमारी1के लिए मुख्य आधार उपचार है। हालांकि, प्रतिरोध अक्सर लक्षित उपचारों के परिणामस्वरूप होता है और रोग एक उन्नत मेटास्टैटिक सीआरपीसी2की प्रगति करता है। सीआरपीसी का इलाज एआर थेरेपी की दूसरी पीढ़ी द्वारा किया जाता है जिसमें एंजालुटाइड और एबिरेटेरोन2,3 शामिल हैं जो शुरू में अस्तित्व में सुधार करते हैं। हालांकि, एनईपीसी जैसे घातक वेरिएंट अक्सर इलाज सीआरपीसी के 25−30% मामलों में उभरते हैं जिनके पास सीमित उपचार विकल्प होते हैं, जिससे मृत्यु दर3में वृद्धि होती है। एनईपीसी नेड के नाम से जानी जाने वाली एक रिवर्सेबल ट्रांसपेर्युशंस प्रक्रिया के माध्यम से उत्पन्न होती है, जिसमें पीसीए कोशिकाएं एडेनोकार्सिनोमा से वंश स्विच से गुजरती हैं और एनोलेस 2 (ENO2), क्रोमोग्रेन ए (CHGA) और सिनैप्टोफिजिसिन (SYP)4सहित एनई वंश मार्कर की एआर और बढ़ी हुई अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति दिखाती हैं। यह देखते हुए कि ये प्रतिरोध वेरिएंट चिकित्सीय हस्तक्षेपों के परिणामस्वरूप उत्पन्न होते हैं, उन रास्तों को समझना आवश्यक है जो इस घातक की पीढ़ी को जन्म देते हैं, पीकेए के रूप का इलाज करना मुश्किल है।

एनईपीसी के जीनोमिक्स को हाल ही में बेल्ट्रान एट अल द्वारा किए गए एक संपूर्ण अध्ययन में समझा गया था जिससे कॉपी संख्या परिवर्तन, उत्परिवर्तन, एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNPs), और रोगी से डीएनए मिथाइलेशन-व्युत्पन्न मेटास्टैटिक ऊतकों का विश्लेषण किया गया था। पीसीए के इस आक्रामक रूप के जीनोमिक्स की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, छोटे गैर-कोडिंग आरएनए (माइक्रोआरएनए) सहित एपिजेनेटिक कारकों के बारे में बहुत कम जाना जाता है जो सीआरपीसी-एडेनोकार्सिनोमा से एनईपीसी के संक्रमण में शामिल हैं। माइक्रोआरएनए (miRNAs) 22 बीपी लंबे, डबल-फंसे RNAs हैं जो मुख्य रूप से जीन अभिव्यक्ति को दबाने के बाद-अनुक्रम-विशिष्ट बातचीत द्वारा अनुक्रम-विशिष्ट बातचीत द्वारा कार्य करते हैं, कॉग्नेट एमआरएनए लक्ष्य6के साथ विशिष्ट बातचीत। कई ऑनकोमियर्स और ट्यूमर दबाने वालों की पहचान अब की गई है, और रोग की शुरुआत और मेटाटैसिस को विनियमित करने में उनकी भूमिका का विभिन्न कैंसर6,7में अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है । ये छोटे गैर - कोडिंग आरएनए अक्सर रोग मृत्यु दर6,8,9को नियंत्रित करने में बहुत महत्वपूर्ण लक्ष्य के रूप में काम करते हैं । हाल ही में अनुसंधान ऐसे exosomes के रूप में EVs में अपने परिवहन के माध्यम से कैंसर मेटास्तासिस में miRNAs के पैराक्राइन प्रभावको समझने पर ध्यान केंद्रित किया गया है, कि खून में प्रवाह और ट्यूमर कोशिकाओं को एक nuclease मुक्त वातावरण10,11,12में मेटास्टैटिक स्थानों के लिए इन माध्यमिक दूतों भेजने के लिए अनुमति देते हैं । ईवीएस ट्यूमर कोशिकाओं से miRNAs ले मेजबान कोशिकाओं12से बदलने के प्रभाव को स्थानांतरित करने के लिए । इसलिए ट्यूमर कोशिकाओं के माध्यमिक दूतों के रूप में ईवीएस की पहचान रोग की गंभीरता का गैर-आक्रामक पता लगाने में उपयोगी हो सकती है।

एमआईआर-1246 आक्रामक पीसीए से ईवीएस में अत्यधिक अपरेज़ है, और यह रोग की गंभीरता13को इंगित करता है। ये ईवी-संबद्ध एमआईआरएनए न केवल बीमारी के नॉनइनवेसिव बायोमार्कर के रूप में काम करते हैं, बल्कि ट्यूमरकोनेसिस चलाने में कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण भूमिकाएं भी निभाते हैं। इस प्रकार, नॉनइनवेसिव बायोमार्कर की बेहतर पहचान के साथ-साथ उनके कार्यात्मक महत्व की अनुमति देने के लिए पीकेए के प्रतिरोधी रूपों से जुड़े एमआईआरएनए प्रदर्शनों की सूची के महत्व को समझना आवश्यक है।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन ने ट्यूमर परिदृश्य के विवरण का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक मंच की पेशकश की है जिसमें जीनोम में परिवर्तन, गुणसूत्र पुनर्स्थान, क्रोमोथ्रिप्सिस और मिथाइलेशन शामिल हैं, जो सभी कैंसर14,15,16के रूप और प्रकृति में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं । इसी तरह, ट्यूमर कोशिका में होने वाले विशाल एपिनोमिक परिवर्तनों को समझने के लिए यह एक आवश्यक उपकरण भी है और जो अक्सर रोग गंभीरता17में महत्वपूर्ण खिलाड़ी होते हैं। एनईपीसी की पीढ़ी से जुड़े मिरना प्रदर्शनों की सूची को समझने के उद्देश्य से, एफएफपी मेटास्टैटिक सीआरपीसी ऊतकों और उनके इसी सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस पर छोटे आरएनए अनुक्रमण का प्रदर्शन किया गया था। इन दो नमूना स्रोतों में से किसी से प्राप्त आरएनए (1) उपज में कम है और दुर्गति के कारण खराब गुणवत्ता का (2) है जो अक्सर फॉर्मेलिन निर्धारण और ईवी अलगाव के कारण होता है। इसके अलावा, सीडीएनए पुस्तकालयों का उत्पादन एक महत्वपूर्ण है, लेकिन बोझिल, एक अनुक्रमण रन का कदम है । इस प्रकार, इन RNAs को अलग करने और छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए उनका उपयोग करने के तरीकों को सटीक और विश्वसनीय डेटा उत्पन्न करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

आरटी-पीसीआर, माइक्रोरेज़, और इन-सीटू संकरण (ईश) सहित विभिन्न नमूनों में मिरना अभिव्यक्ति को प्रोफ़ाइल करने के कई तरीके हैं। आरटी-पीसीआर और ईश द्वारा मिरना अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एफएफपीई ऊतक-व्युत्पन्न आरएनए का उपयोग करने वाला एक प्रोटोकॉल हाल ही में18प्रकाशित किया गया था। हाल की प्रौद्योगिकियां एक नमूने में मिरना अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए अधिक संपूर्ण और व्यापक प्लेटफार्म प्रदान करती हैं। नैनोस्ट्रिंग nCounter एक संवेदनशील मिरना डिटेक्शन प्लेटफॉर्म19प्रदान करता है, लेकिन पता लगाने अक्सर मिरना की संख्या से सीमित होता है जो सरणी (~ 2,000) में उपलब्ध हैं। ऐसे परिदृश्य में, अगली पीढ़ी अनुक्रमण जैसे अधिक संवेदनशील और संपूर्ण मंच20विभिन्न नमूनों में मिरना पहचान और एक साथ प्रोफाइलिंग की अधिक व्यापक गहराई प्रदान करता है। इस विधि का उपयोग पीसीए रोगियों21,22,23से मूत्र या प्लाज्मा में मिरना हस्ताक्षर निर्धारित करने के लिए किया गया है । वर्तमान लेख में, एफएफपीई ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न ईवी आरएनए का उपयोग करके आक्रामक सीआरपीसी से जुड़े मिरना प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

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Protocol

यह अध्ययन अमेरिकी साझा नियम के नैतिक दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था और इसे मानव अनुसंधान पर संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. माइक्रोडिसेक्शन

नोट: एफएफपी मेटास्टैटिक सीआरपीसी ऊतकों के साथ एडेनोकार्सिनोमा सुविधाओं (सीआरपीसी-एडिनो) या एनई विभेदन (सीआरपीसी-एनई) प्रोस्टेट कैंसर बायोरेपोसिटररी नेटवर्क (पीसीबीएन) से प्राप्त किए गए थे। ग्लास स्लाइड पर दस माइक्रोन पीसीए अनुभाग मैनुअल माइक्रोडिसेक्शन के लिए तैयार किए गए थे जैसा कि पहले18पर चर्चा की गई थी। संक्षेप में संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए:

  1. स्लाइड्स को जाइलीन (2x, 10 मिन प्रत्येक) में भिगोकर टिश्यू सेक्शन को डिपराफिनाइज करें। फिर ग्रेडेड इथेनॉल (100%, 95%, 90%, 80%, और 70%) में 5 मिन के लिए स्लाइड्स इनक्यूबेट करके अनुभागों को फिर से हाइड्रेट करें, इसके बाद एक आसुत पानी धोने और हेमैटोक्सिलिन (30 एस सोख) के साथ धुंधला हो जाता है।
  2. हेमैटोक्सिलिन धुंधला होने के बाद, ऊतक वर्गों को पानी से धोएं। फिर ऊतक वर्गों को ग्रेडेड इथेनॉल (70%, 80% 90%, 95%, 100%) में रखकर निर्जलित करें (5 मिन प्रत्येक) जाइलीन (5 मिन) के बाद ।
  3. ट्यूमर क्षेत्रों (यानी, एडेनोकार्सिनोमा या नेड) की पहचान करने के लिए संबंधित हेमैटोक्सिलिन और इओसिन (एच एंड ई) स्लाइड का विश्लेषण करें और बोर्ड-प्रमाणित पैथोलॉजिस्ट की सहायता से इन ट्यूमर क्षेत्रों और सामान्य आसन्न क्षेत्रों को चिह्नित करें। रोडमैप के रूप में इन एच एंड ई स्लाइड का उपयोग करना, ट्यूमर और सामान्य क्षेत्रों के बीच अंतर करने के लिए उपरोक्त चरण में प्राप्त हेमेटक्सीलिन-दाग ऊतकों को चिह्नित करें।
  4. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करमाइक्रोस्कोप के नीचे चिह्नित ऊतक स्लाइड को सावधानी से विच्छेदन करें।
  5. इलेक्ट्रोस्टैटिकली चार्ज जेल लोडिंग पिपेट युक्तियों का उपयोग करके अलग ट्यूबों में सामान्य और कैंसर वाले क्षेत्रों से विच्छेदित ऊतक एकत्र करें। आवेशित टिप विच्छेदित ऊतक को आकर्षित करती है और विच्छेदन के बाद अधिकतम ऊतक वसूली के लिए अनुमति देती है। एक बार ऊतक आवेशित टिप से चिपक जाता है, एक खाली 2 mL संग्रह ट्यूब में टिप काट।

2. अलग सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस

नोट: एडेनोकार्सिनोमा विशेषताओं (सीआरपीसी-एडिनो) या एनई विभेदन (सीआरपीसी-एनई) के साथ मेटास्टैटिक सीआरपीसी वाले रोगियों से एकत्र किए गए जमे हुए रोगी सीरम नमूने पीसीबीएन से अनुमोदित आईआरबी प्रोटोकॉल का उपयोग करके खरीदे गए थे और उनके उपयोग से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे। सीरम नमूने रोगियों के एक ही सेट से एकत्र किए गए थे क्योंकि संबंधित ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए सूक्ष्म ऊतकों के लिए उपयोग किए जाते थे। ईवीएस एकत्र करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीरम ईवी आइसोलेशन रिएजेंट का उपयोग किया गया था।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए मरीज सीरम के नमूने गल गए।
  2. गल सीरम नमूना के 110 μL का प्रयोग करें और 30 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर स्पिन।
  3. बाद में EV/exosome अलगाव के लिए अतिशयोक्ति ले लीजिए और मलबे गोली त्यागें । 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनेट ेंट और इनक्यूबेट में सीरम एक्सोसोम आइसोलेशन रिएजेंट के 30 माइक्रोन जोड़ें।
  4. 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर स्पिन करें। यदि आवश्यक हो तो एक अलग 1.5 मिलीग्राम ट्यूब में गोली को परेशान किए बिना ईवी-समाप्त सीरम को ध्यान से एकत्र करें और भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. न्यूस्लीज-मुक्त पानी में तैयार फॉस्फेट बफर्ड लवइन (पीबीएस) के 70 माइक्रोन में ईवी पैलेट को फिर से निलंबित करें। कणों की गुणवत्ता और संख्या का आकलन करने के लिए कण ट्रैकिंग विश्लेषण प्रणाली के लिए एक aliquot रखें । आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर बाकी नमूने स्टोर करें।

3. माइक्रोडिसेक्ड प्रोस्टेट ऊतकों और ईवीएस से आरएनए अलगाव

नोट: कुल आरएनए को कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके माइक्रोडिसेटेड ऊतकों और शुद्ध ईवीएस से अलग किया गया था। निम्नलिखित अनुभाग महत्वपूर्ण चरणों पर विशेष जोर देते हुए इन प्रक्रियाओं का संक्षेप में वर्णन करते हैं:

  1. आरएनए को माइक्रोडिसेक्ड ऊतकों से अलग करें।
    1. प्रोटीन के बफर के 150 माइक्रोन में माइक्रोडिसेक्ड एफएफपी ऊतक को फिर से निलंबित करें। भंवर द्वारा मिलाएं और टिप से अवशिष्ट ऊतक को बाहर निकालें। 1 मिन के लिए 11,000 x ग्राम पर स्पिन।
    2. पैलेट में प्रोटीनके 10 माइक्रोन जोड़ें। 2 मिन के लिए प्रतीक्षा करें जब तक गोली सफेद हो जाता है। कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    3. 16 मिन के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। भंवर हर 3 मिन।
    4. सैंपल निकालें और हीट ब्लॉक 80 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने दें। 16 मिन के लिए ब्लॉक पर नमूनों को इनक्यूबेट करें भंवर हर 3 मिन।
    5. 3 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    6. 15 मिन के लिए 20,000 x ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनेटेंट को एक नई 2 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    7. DNase बूस्टर बफर के 16 μL जोड़ें DNase I के 10 μL के बाद ट्यूब धीरे उलटा और कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 min के लिए इनक्यूबेट द्वारा मिश्रण ।
    8. रेड ब्लड सेल (आरबीसी) लिसिस बफर के 320 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब को उलटकर मिलाएं और फिर 100% इथेनॉल के 1,120 माइक्रोन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत स्पिन कॉलम पर तुरंत स्थानांतरित करें। 30 एस के लिए 8,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
    9. कॉलम 2x को वॉश बफर से धोएं और अवशिष्ट वॉश बफर को हटाने के लिए 5 मिन के लिए 20,000 x g पर कॉलम स्पिन करें।
    10. स्पिन कॉलम को 2−3 मिन के लिए सूखी हवा दें, फिर RNase-मुक्त पानी के 19 माइक्रोन के साथ elute। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शुद्ध आरएनए की मात्रा निर्धारित करें और नमूने को 40 एनजी/माइक्रोन तक सामान्य करें।
  2. सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से आरएनए अलगाव।
    1. एक किट का उपयोग कर एक्सोसोमल आरएनए को अलग करें। शुद्ध ईवी निलंबन के 50 माइक्रोन में लिसिस बफर ए और लिसिस बफर बी के 9.3 माइक्रोन के 75 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: ईवीएस की पूरी तरह से लाइसिस की अनुमति देने के लिए लगभग 10 सीन के लिए ट्यूब को उलटकर नमूना मिलाते रहें।
    2. 100% इथेनॉल के 130 माइक्रोन जोड़ें और तुरंत नमूना उलटा करके मिश्रण। स्पिन कॉलम पर ट्रांसफर करें और फिर 1 मिन के लिए 3,300 x g पर स्पिन करें।
    3. कॉलम 2x को वॉश बफर से धोलें। वॉश बफर को पूरी तरह से हटाने के लिए 3 मिन के लिए 1,300 x ग्राम पर कॉलम को स्पिन करें।
    4. कॉलम को 2 मिन के लिए सूखी हवा दें। 18 माइक्रोन को कॉलम में एल्यूटियन बफर डालें और इसे 2 मिन के लिए बैठने दें। 1 मिन के लिए 400 x ग्राम पर स्पिन करें और इसके बाद 3 मिन के लिए 5,800 x ग्राम पर दूसरा स्पिन करें।
    5. नमूने से आरएनए की उपज बढ़ाने के लिए किट में शामिल ल्यूट बफर के साथ चरण 3.2.4 दोहराएं।
    6. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर नमूने की मात्रा निर्धारित करें और इसे 40 एनजी/माइक्रोन तक सामान्य करें।

4. छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी

नोट: अलग आरएनए नमूनों से सीडीएनए पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए एक छोटी आरएनए लाइब्रेरी प्रेप किट(सामग्री की तालिका) काउपयोग किया गया था। एक अनुक्रमक पर चलने से पहले पुस्तकालयों को उत्पन्न करने, शुद्ध करने और गुणवत्ता की जांच करने के लिए कदम किसी भी अनुक्रमण प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे अंततः एक रन से आउटपुट डेटा की गुणवत्ता निर्धारित करते हैं। इसलिए हर कदम के साथ सावधानी से आगे बढ़ें। निर्माता के दिशानिर्देश आरएनए के न्यूनतम 50 एनजी का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। खराब गुणवत्ता और कुल आरएनए की कम मात्रा को देखते हुए आमतौर पर इन दो नमूना स्रोतों से प्राप्त, इस प्रोटोकॉल आरएनए सांद्रता के लिए अनुकूलित किया जाता है के रूप में कम के रूप में १०० एनजी । नीचे प्रोटोकॉल एक पुस्तकालय के एक नमूने के लिए है।

  1. एडाप्टर-लिगाटेड सीडीएनए उत्पन्न करें।
    1. सामान्यीकृत (40 एनजी/माइक्रोन) आरएनए नमूने के 5 माइक्रोन का उपयोग करें। 3 'एडाप्टर के 1 μL जोड़ें। नमूनों को इनक्यूबेट करने से पहले थर्मल साइकिलर को 70 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम करें। 2 मिन के लिए इनक्यूबेट। अगले चरण पर जाने से पहले तुरंत बर्फ पर नमूनों को स्थानांतरित करें।
    2. एक अलग ट्यूब में, लिगेशन बफर का मिश्रण 2 माइक्रोन, आरएनसे अवरोधक का 1 माइक्रोन, और टी 4 आरएनए लिगासे 2 का 1 माइक्रोन, एक हटाने उत्परिवर्ती। ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिश्रण और आरएनए के साथ ट्यूब के लिए इस मिश्रण के 4 μL जोड़ें/
    3. थर्मल साइकिलर को स्थानांतरित करें जिसे 28 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम किया गया है और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया है।
    4. थर्मल ब्लॉक पर नमूनों को रखते हुए स्टॉप सॉल्यूशन के 1 माइक्रोन जोड़ें। एक और 15 मिन के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    5. ट्यूबों को हटा दें और इस स्टेप के तुरंत बाद बर्फ पर रखें।
    6. एक अलग ट्यूब में, 5 'एडाप्टर के 1 μL जोड़ें।
    7. एक थर्मल साइकिलर में स्थानांतरित करें जिसे पहले से 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है और 2 मिन के लिए इनक्यूबेट किया गया है।
    8. एडाप्टर के पुनः एनियलिंग को रोकने के लिए तुरंत ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    9. विकृत 5 'एडाप्टर की ट्यूब में 10 एमएम एटीपी के 1 μL जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिलाएं और मिश्रण में T4 आरएनए लिगाज़ के 1 माइक्रोन जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिलाएं और 3 'एडैप्टर-लिगाटेड आरएनए वाले ट्यूब में इस मिश्रण के 3 माइक्रोन जोड़ें। थर्मल साइकिलर पर स्थानांतरण जो पहले से 28 डिग्री सेल्सियस तक गरम किया गया है और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट है।
    10. तुरंत बर्फ में स्थानांतरित करें और या तो नमूनों के साथ आगे बढ़ें या भविष्य के उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    11. आरटी-पीसीआर करने के लिए, प्रत्येक एडाप्टर-लिगाटेड आरएनए के 6 माइक्रोन का उपयोग करें और इसमें आरएनए आरटी प्राइमर के 1 माइक्रोन जोड़ें। थर्मल साइकिलर है कि 70 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम किया गया है के लिए स्थानांतरण। 2 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    12. एक अलग ट्यूब में, 5x स्ट्रैंड बफर का मिक्स 2 माइक्रोन, 12.5 एमएम डीएनटीपी का 0.5 माइक्रोन, 100 एमएम डीटीटी का 1 माइक्रोन, आरएनएसई अवरोधक का 1 माइक्रोन, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ का 1 माइक्रोन। इस मिश्रण का 5.5 माइक्रोन एडाप्टर-लिगाटेड आरएनए में जोड़ें और थर्मल साइकिलर में स्थानांतरित करें जिसे 50 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम किया गया है। 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    13. एडाप्टर-लिगाटेड सीडीएनए को तुरंत बर्फ में स्थानांतरित करें।
    14. एक अलग ट्यूब में पीसीआर मिक्स का मिक्स 25 माइक्रोन, आरएनए पीसीआर प्राइमर का 2 माइक्रोन, आरएनए पीसीआर प्राइमर इंडेक्स का 2 माइक्रोन और आरएनएसई-फ्री पानी का 8.5 माइक्रोन। इस मिश्रण के 37.5 माइक्रोन को एडाप्टर-लिगाटेड सीडीएनए के 12.5 माइक्रोन में जोड़ें। थर्मल साइकिलर है कि 98 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम किया गया है के लिए स्थानांतरण। 11 के बजाय 15 में संशोधित साइकिल संख्या के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल में सुझाए गए थर्मल साइकिलर को प्रोग्राम करें।
      नोट: उपयोग किए जाने वाले सभी प्राइमर के दृश्य टेबल ऑफ मैटेरियल केतहत सूचीबद्ध हैं।
    15. सैंपल पूरे होने के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। उनके साथ आगे बढ़ें या भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. लिगाटेड सीडीएनए के लिए गुणवत्ता नियंत्रण शुद्ध और प्रदर्शन करें।
    नोट: नीचे बताए गए शुद्ध सीडीएनए नमूनों की गुणवत्ता और उपज में सुधार करने के लिए कुछ संशोधनों को छोड़कर निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके प्रवर्धित सीडीएनए को जेल-शुद्ध किया गया था।
    1. प्रवर्धित सीडीएनए को शुद्ध करने के लिए 6% TBE पॉलीएक्रिलैमाइड जैल का उपयोग करें। डीएनए लोडिंग डाया की बराबर मात्रा के साथ उच्च संकल्प सीढ़ी (एचआरएल) और कस्टम आरएनए सीढ़ी (सीआरएल) को पतला करें।
    2. प्रत्येक सीडीएनए नमूने में डीएनए लोडिंग डाये के 10 माइक्रोन जोड़ें। दो अलग-अलग नमूनों के बीच मध्यवर्ती अंतरिक्ष में सीआरएल और एचआरएल के साथ एक दूसरे से सटे दो अलग-अलग गलियों में प्रत्येक नमूने के 30 माइक्रोन चलाएं।
    3. लगभग 30−40 मीटर के लिए 145 वी पर 1x TBE बफर में जेल चलाएं।
      नोट: लोडिंग डाये के निचले नीले मोर्चे का ट्रैक रखें। जब यह जेल के नीचे के पास पहुंचता है तो इलेक्ट्रोफोरेसिस को रोकें।
    4. 1x TBE बफर में 0.5 μg EtBr/1 mL 1x TBE पर Ethidium ब्रोमाइड (EtBr) के साथ जेल स्थानांतरित करें।
      सावधानी: EtBr एक ज्ञात कैंसरजन है और यहां से प्रत्येक कदम जब तक जेल से एक्सिजन अत्यधिक सावधानी के साथ किया जाना चाहिए ।
    5. एक ट्रांसलिलाइटर में जेल की कल्पना करें और 145 बीपी और 160 बीपी मार्कर के बीच ठीक से जेल काट लें।
      नोट: एडाप्टर डिमर्स 145 बीपी मार्कर के बहुत करीब चलते हैं। इसलिए, एडाप्टर डिमर के साथ संदूषण से बचने के लिए 145 बीपी मार्कर से थोड़ा ऊपर जेल काट लें।
    6. 2 mL इकट्ठा ट्यूबों में रखा डीएनए तोड़ने ट्यूबों के लिए जेल हस्तांतरण। 2 मिन के लिए 20,000 x ग्राम पर स्पिन करें। RNase-मुक्त पानी के 300 माइक्रोन जोड़ें और इसे आरटी पर रात भर एक घुमाव पर धीरे से घुमाने के लिए अनुमति देते हैं।
    7. डीएनए वर्षा करने के लिए, अगले दिन ट्यूब की सामग्री को 5 माइक्रोन फिल्टर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 10 एस के लिए 600 x ग्राम पर स्पिन करें।
      नोट: ट्यूबों को 10 से अधिक समय तक स्पिन न होने दें क्योंकि जेल फिल्टर से गुजरता है।
    8. ग्लूकोजेन के 2 माइक्रोन, 3 एम नाओएसी के 30 माइक्रोन, 0.1 x पैलेट पेंट के 2 माइक्रोन, और 100% इथेनॉल के 975 माइक्रोन को एल्यूट डीएनए में जोड़ें। 20 00 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 0
    9. अधिनायक को त्यागें और पैलेट को धोने के लिए 75% इथेनॉल जोड़ें। 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 17,000 x ग्राम पर स्पिन करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को त्यागें और इथेनॉल को पूरी तरह से वाष्पित करने के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    10. 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.5 के 12 माइक्रोन के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
    11. शुद्ध सीडीएनए को 10x (1:10) द्वारा कमजोर करके और बायो-एनालाइजर पर चलने के लिए पतला सीडीएनए के 1 μL का उपयोग करके लाइब्रेरी गुणवत्ता की जांच करें।
    12. सुनिश्चित करें कि सीडीएनए उत्पाद का आकार इलेक्ट्रोप्रोग्राम में छोटे आरएनए (136−160 बीपी) की सीमा से मेल खाता है। प्रत्येक नमूने के लिए कुल मोलरिटी की गणना करें। Tris-HCl पीएच 8.5 का उपयोग कर 2 एनएम के लिए प्रत्येक नमूने को सामान्य करें।
  3. विकृत और शुद्ध सीडीएनए अनुक्रम।
    1. एक ही 200 माइक्रोन पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक 2 एनएम नमूने के बराबर मात्रा में मिश्रण करके पुस्तकालयों पूल। पूल्ड लाइब्रेरी के 10 माइक्रोन में ताजा तैयार 0.2 एन नाओएच के 10 माइक्रोन जोड़ें।
    2. भंवर द्वारा तुरंत मिलाएं, और 1 मिन के लिए 280 x ग्राम पर स्पिन करें। 5 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट।
    3. विकृत पुस्तकालय के 200 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7 से 20 माइक्रोन के 10 माइक्रोन जोड़ें। भंवर द्वारा मिश्रण और 1 मिन के लिए 280 x ग्राम पर स्पिन।
    4. पुस्तकालय में प्रीचिलेड हाइब्रिडाइजेशन बफर के 970 माइक्रोन जोड़ें और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। पुस्तकालय 20 पीएम की एकाग्रता पर है। बर्फ पर रखें जब तक कि यह अंत में पतला न हो जाए।
      नोट: अंतिम कमजोर पड़ने का काम सीक्वेंसर पर चलने से ठीक पहले किया जाता है ।
    5. विकृत पुस्तकालय के 117 μL को प्रीफ़ल्ड हाइब्रिडाइजेशन बफर के 1,183 माइक्रोन में जोड़ें। ट्यूब और पल्स अपकेंद्रित्र को उलटकर मिलाएं। पुस्तकालय की अंतिम एकाग्रता अब 1.8 पीएम है।
    6. अंतिम पुस्तकालय के 1.3 mL में PhiX के 1.3 μL जोड़ें। एक अनुक्रमक पर एक रन शुरू करने के लिए, सॉफ्टवेयर इंटरफेस पर ऑन-स्क्रीन चरणों का पालन करें, रीड टाइप (एकल पढ़ा), पढ़ें लंबाई (प्रत्येक पढ़ने के लिए चक्र की संख्या), लाइब्रेरी आईडी और चुनें स्टार्टसहित रन मापदंडों की समीक्षा करें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. अनुक्रमक रन के अंत में, फास्टक्यू फ़ाइलों के रूप में परिणामी अनुक्रमण डेटा प्राप्त करें। परिणामस्वरूप अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  2. फास्टक्यू टूलकिट एप्लिकेशन खोलें और लॉन्च बटन दबाएं।
  3. सॉफ्टवेयर में नमूनों की सूची से फाइलों का चयन करें और चुनें कि डेटा कहां से वबी जाएगा।
  4. एक स्ट्रिंग नाम जोड़ें जो प्रत्येक छंटनी किए गए अनुक्रम पर लागू होता है। 0.9 तक स्ट्रिंग रखें। प्रत्येक अनुक्रमित नमूने के 3 के अंत से "TGGAATTCTCGGGTGCAA" के रूप में ट्रिम करने के लिए एडाप्टर अनुक्रम इनपुट करें। रीड फ़िल्टरिंग टैब का विस्तार करें और"5"की न्यूनतम पढ़ें लंबाई का चयन करें। स्वीकार बॉक्स का चयन करें और ट्रिमिंग शुरू करने के लिए जारी बटन दबाएं। छंटनी की गई फाइलों को विश्लेषण के अंत तक परियोजना फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा।
  5. सॉफ्टवेयर पर छोटे आरएनए v.1.0 एप्लिकेशन खोलें और लॉन्च बटन दबाएं।
  6. उस प्रोजेक्ट का चयन करें जहां फाइलों को सहेजकर विश्लेषण के बाद भेजा जाएगा।
  7. आवेदन में उपन्यास miRs और अंतर miRs समारोह का चयन करें। समूहों को अंतर विश्लेषण के लिएनियंत्रणऔर'परीक्षण"के रूप में अलग करें और छंटनी की गई फाइलों को अपने-अपने समूहों में विश्लेषण करने के लिए जोड़ें।
  8. विश्लेषण शुरू करने के लिए लॉन्च बटन का चयन करें। विश्लेषण ों के बाद, परिणामी फ़ाइलों को डाउनलोड करें।

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Representative Results

आरएनए आइसोलेशन के बाद लाइब्रेरी तैयार की गई और क्वालिटी चेक किया गया। सूक्ष्म संप्रदायित ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से अलग आरएनए से तैयार प्रवर्धित सीडीएनए लाइब्रेरी के लिए जेल शुद्धि चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाई गई है। एडाप्टर-लिगाटेड मिर्ना के लिए उत्पाद का आकार प्रत्येक नमूने के लिए लगभग 136−160 बीपी से मेल खाता था। चित्रा 1ए-बी को जेल की सीमा दिखाने के लिए चिह्नित किया गया है जिसे छोटे आरएनए पुस्तकालय की तैयारी के लिए ठीक से उत्पादित किया जाना चाहिए। चित्रा 2ए-बी माइक्रोडिसेक्ड टिश्यू और सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस के लिए जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और इलेक्ट्रोफेरोग्राम दिखाते हैं। सप्लीमेंट्री फिगर 1 इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन और मोलर्टिटी की गणना करने की विधि से एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है।

एक सीक्वेंसर पर चलने से पहले पुस्तकालय मैट्रिक्स प्राप्त करने के लिए कदम किए गए थे। चित्रा 3 अपेक्षित क्लस्टर घनत्व, क्यूसी स्कोर, क्लस्टर पासिंग फिल्टर प्रतिशत, और अनुमानित उपज और त्रुटि दरों का प्रदर्शन करते हुए एक छोटे आरएनए अनुक्रमण रन से प्रतिनिधि मैट्रिक्स दिखाता है। चित्रा 3ए और चित्रा 3सी विभिन्न चक्रों पर क्यूसी स्कोर के लिए सभी रन पैरामीटर और ग्राफ के साथ टेबल दिखाते हैं। चित्रा 3बी, डी विभिन्न चक्रों पर PhiX संरेखण के लिए त्रुटि दरों के चित्रमय अभ्यावेदन हैं। प्रदान किया गया डेटा ऑन-साइट विश्लेषण सॉफ्टवेयर से है।

एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन(सामग्री की तालिका)का उपयोग माइक्रोडिसेटेड ऊतक और सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से अनुक्रमित नमूनों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। अनुक्रमित नमूनों को FASTq टूलकिट का उपयोग करके एडाप्टर दृश्यों से छंटनी की गई थी जिसके बाद"स्मॉल आरएनए v.1.0"एप्लिकेशन पर विश्लेषण किया गया था। चित्रा 3 विश्लेषण पर परिणामी डेटा दिखाता है। तालिका 1 और तालिका 2 शो कुल माइक्रोडिसेटेड ऊतक और सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस अनुक्रमण रन से पढ़ता है। चित्रा 3ए और चित्रा 3बी दो नमूना स्रोतों के लिए छोटे आरएनए लंबाई वितरण दिखाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: छोटे गैर कोडिंग आरएनए अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी । (ए)माइक्रोडिसेक्ड एफएफपी ईआरएन एनएआर से प्रवर्धित पुस्तकालयों के लिए पॉलीएक्रिलामाइड सीडीएनए जेल और(बी)आरएनए शुद्ध सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: छोटे गैर कोडिंग आरएनए अनुक्रमण के लिए गुणवत्ता की जांच करें । के लिए शुद्ध सीडीएनए पुस्तकालय के लिए जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और इलेक्ट्रोफेरोग्राम के लिए प्रतिनिधि छवि(ए)माइक्रोडिसेक्टेड एफएफपी ऊतक और(बी)सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: छोटे आरएनए अनुक्रमण रन के लिए रन मैट्रिक्स। रन पैरामीटर्स का सारणीय और ग्राफिकल प्रतिनिधित्व% क्यू ‧30, क्लस्टर घनत्व, क्लस्टर पासिंग फिल्टर%, अनुमानित उपज, और क्यू स्कोर से अनुक्रमण चलाने के लिए(ए)माइक्रोडिसेक्टेड एफएफपी ऊतक और(सी)सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस। (बी)माइक्रोडिसेक्ड एफएफपी ऊतक और(डी)सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से अनुक्रमण के लिए विभिन्न चक्रों पर PhiX संरेखण के लिए त्रुटि दरों का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। त्रुटियां बार प्रत्येक चक्र के लिए त्रुटि दरों के लिए मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक छोटे से गैर कोडिंग आरएनए अनुक्रमण रन से अपेक्षित परिणाम । छोटे आरएनए(ए)माइक्रोडिसेक्ड एफएफपी ऊतक और(बी)सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से पुस्तकालय के लिए लंबाई पढ़ें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नमूना कुल अनुक्रमण पढ़ता है
1 92,68,658
2 70,00,551
3 1,56,41,204
4 1,50,46,681
5 1,42,82,756
6 1,27,38,970
7 1,57,21,318
8 88,51,578
9 1,32,16,879
10 1,14,66,162
11 1,91,14,932

तालिका 1: कुल अनुक्रमण माइक्रोडिसेटेड एफएफपी ऊतक से चलने वाले एक छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए पढ़ता है। विश्लेषण के बाद प्राप्त किए गए अनुक्रमित एफएफपी नमूनों के लिए छोटे आरएनए के अनुरूप पढ़ता का प्रतिशत।

नमूना कुल अनुक्रमण पढ़ता है
1 2,30,88,960
2 1,77,69,806
3 90,37,884
4 87,26,243
5 73,23,571
6 2,89,37,388
7 76,52,149
8 1,30,07,122
9 54,34,386
10 93,05,941
11 94,53,760
12 82,79,773

तालिका 2: शुद्ध सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से एक छोटे आरएनए अनुक्रमण रन के लिए कुल अनुक्रमण पढ़ता है। विश्लेषण के बाद प्राप्त अनुक्रमित ईवी नमूनों के लिए छोटे आरएनए के अनुरूप पढ़ता का प्रतिशत।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्र1: छोटे गैर कोडिंग आरएनए अनुक्रमण के लिए गुणवत्ता की जांच करें । एक इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन से प्रतिनिधि परिणाम संकेतित नमूने की कुल मोलरिटी दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस लेख में, हम एफएफपीई ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से आरएनए को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो किट का उपयोग करके अनुकूलित किए गए थे जो अलग-थलग आरएनए की उपज और गुणवत्ता को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किए गए थे। इसके अलावा, शुद्ध आरएनए का उपयोग छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए सीडीएनए पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए किया गया था। अनुक्रमण की गुणवत्ता और गहराई निर्धारित करने में सूचीबद्ध दोनों कदम आवश्यक हैं जो24रन से अंतिम परिणाम हैं । इसलिए, इन महत्वपूर्ण चरणों का अनुकूलन एक सफल अनुक्रमण रन के लिए महत्वपूर्ण है।

एफएफपीई-व्युत्पन्न आरएनए के अलगाव में एक महत्वपूर्ण कदम प्रोटीन के साथ पाचन है जो ऊतक से क्रॉस-लिंक्ड फॉर्मेलिन को हटाने की अनुमति देता है। इस कदम को 55 डिग्री सेल्सियस और 80 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 16−18 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक के लिए इनक्यूबेटिंग करके अनुकूलित किया गया है। इसके परिणामस्वरूप 260/280 अनुपात में वृद्धि से अलग आरएनए की गुणवत्ता में प्रभावी वृद्धि हुई । अनुक्रमण पढ़ता है अक्सर एक रन है कि कई नमूने भी शामिल है के लिए चर रहे हैं । इसलिए, पुस्तकालय तैयार करने की शुरुआत में आरएनए इनपुट की मात्रा को नियंत्रित करने से पुस्तकालय की एकरूपता की अनुमति मिलती है। सामान्यीकृत आरएनए का उपयोग विभिन्न नमूनों में समान रूप से एक अनुक्रमण चलाने को समतल करने में मदद करता है। पुस्तकालय की तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रवर्धित एडाप्टर लिगाटेड सीडीएनए की शुद्धि है। 140 बीपी मार्कर के ऊपर जैल को ध्यान से उत्पादित करना बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि मार्कर के नीचे की ओर थोड़ा विचलन एडाप्टर डिमर्स के संदूषण की ओर जाता है। अंत में, सीडीएनए लाइब्रेरी को सामान्य बनाना अनुक्रमण प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है और इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन से गणना की गई सामान्यता के आधार पर सही ढंग से किया जाना चाहिए।

एक एडाप्टर डिमर संदूषण के मामले में, कोई भी TBE जेल पर शुद्ध पुस्तकालय को फिर से चला सकता है और वांछित उत्पाद को फिर से शुद्ध कर सकता है। हालांकि, इस तरह के निष्कर्षण में सीडीएनए लाइब्रेरी की उपज में काफी कमी आई है, जो नमूने से पढ़ी गई लंबाई को प्रभावित कर सकती है। शुद्ध सीडीएनए लाइब्रेरी की एकाग्रता पर अनुमान के लिए, कोई भी टेबे जैल में उत्पाद की तीव्रता के आधार पर इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन पर चलने से पहले नमूनों को पतला कर सकता है और विभिन्न कमजोर (यानी, 5x, 10x या 25x) तैयार कर सकता है। शुद्ध सीडीएनए पुस्तकालयों के अनुमान को और बेहतर बनाने के लिए, इलेक्ट्रोफोरेसिस के अलावा क्यूपीसीआर चलाने से टेम्पलेट के स्तर का मूल्यांकन करने में मदद मिलती है और अधिक सटीक सामान्यीकरण की अनुमति मिलती है।

यद्यपि अल्ट्रासेंट्र्यूज़न विभिन्न स्रोतों से ईवीएस के अलगाव के लिए सोने का मानक है, इस तरह के निष्कर्षण से कणों की कम उपज अक्सर ईवीएस को शुद्ध करने में इस विधि के उपयोग को सीमित करती है जहां शुरुआती सामग्री सीमित है और एक महत्वपूर्ण राशि है डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए इनपुट आरएनए की आवश्यकता है। इस प्रकार, कुल एक्सोसोम आइसोलेशन रिएजेंट का उपयोग नैदानिक नमूनों से सीरम और प्लाज्मा जैसे सीमित स्रोतों से ईवी अलगाव के लिए एक बहुत तेज और उच्च उपज विधि प्रदान करता है।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल सीडीएनए पुस्तकालयों को अधिक समय प्रभावी तरीके से उत्पन्न करने के तरीकों का विवरण देता है, जबकि सटीक और व्यापक अनुक्रमण पढ़ता प्राप्त करने के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों की उपज और गुणवत्ता को ध्यान में रखते हुए। कैंसर बायोमार्कर के स्रोत के रूप में एक्सोसोम्स की क्षमता को देखते हुए, एक्सोसोमल मिरना सामग्री के अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) विश्लेषण के लिए यह विधि क्षेत्र में अनुसंधान के लिए सहायक होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान अधिग्रहण गतिविधि (USAMRAA) द्वारा विचार विकास पुरस्कार अंडरअवार्ड नंबर के माध्यम से समर्थित किया जाता है । W81XWH-18-1-303 और W81XWH-18-2-0013 और अतिरिक्त पुरस्कार संख्या द्वारा । W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, और W81XWH-18-2-0019 प्रोस्टेट कैंसर Biorepository नेटवर्क (PCBN) । राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान संख्या RO1CA177984) में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा लेखकों की प्रयोगशाला के लिए धन सहायता भी स्वीकार किया है । राजवीर दहिया दिग्गजों मामलों के विभाग, BX004473 में एक वरिष्ठ अनुसंधान कैरियर वैज्ञानिक है और NIH-UO1CA199694 (RD) द्वारा वित्त पोषित । राय, व्याख्याओं, निष्कर्ष, और सिफारिशों लेखक के उन रहे है और जरूरी रक्षा विभाग या अमेरिकी सेना द्वारा समर्थन नहीं कर रहे हैं । हम नेक्स्टसेक्यू 500 सीक्वेंसर के साथ उनकी सहायता के लिए सैन फ्रांसिस्को वीएएमसी में कोर सुविधा के निदेशक जूडी शिगेनागा के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 M NaOAc pH 5.5 USB Corp. 75897 100 mL
5 µm filter tubes IST Engineering Inc. 5388-50
6% TBE polyacrylamide gels Novex EC6265BOX
BaseSpace Illumina Analysis software
Bio-analyzer Agilent
DNA loading dye Novex LC6678
Eppendorf Thermostat plus Eppendorf 1.5 mL
EtBr Pierce 17898
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco 111000200
Exosomal RNA isolation kit Norgen 58000
Gel breaking tubes IST Engineering Inc. 3388-100
Glycogen molecular biology grade Thermo Scientifc R0561
Hematoxylin Select Stat lab SL401
Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676 accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit Qiagen 217504
Nanodrop Thermo Scientifc Nano Drop 1000
Nanosight NTA Malvern LM14
NextSeq 500 Sequencer Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) Illumina FC-404-2001
Pellet paint Millipore 70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase Invitogen 18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant Lucigen LR2D11310K
TBE Running buffer (5x) Novex LC6675
Thermal cycler MJ Research PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum) Invitrogen 4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) Illumina RS-200-0012
Xylene Fisher Scientific X3P- 1GAL
RNA 3' Primer GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
- - - 6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1 CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2 ACATCG
RNA PCR Index Primer 3 GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4 TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5 CACTGT
RNA PCR Index Primer 6 ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7 GATCTG
RNA PCR Index Primer 8 TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9 CTGATC
RNA PCR Index Primer 10 AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11 GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12 TACAAG

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 153 छोटे आरएनए अनुक्रमण एक्सोसोम्स एफएफपीई ऊतक प्रोस्टेट कैंसर मिरना बायोमार्कर
फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स से कैस्टेशन-प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर रोगियों से छोटे गैर-कोडिंग आरएनए को अनुक्रमित करना
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Bhagirath, D., Dahiya, R., Majid, S., Tabatabai, Z. L., Saini, S. Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients. J. Vis. Exp. (153), e60549, doi:10.3791/60549 (2019).

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