Summary
Terapi resistens utvikler ofte hos pasienter med avansert prostatakreft, og i noen tilfeller, utvikler kreft til en dødelig under type kalt Nevroendokrine prostata kreft. Vurdere de små ikke-koding RNA-mediert molekylære endringer som letter denne overgangen ville tillate bedre sykdom lagdeling og identifisering av årsakssammenheng mekanismer som fører til utvikling av Nevroendokrine prostatakreft.
Abstract
Ablasjon av androgen reseptor (AR) signalering av androgen deprivasjon er målet for den første linjen i terapi for prostatakreft som i utgangspunktet resulterer i kreft regresjon. Men i et betydelig antall tilfeller, sykdommen utvikler seg til avansert, kastrering prostatakreft (CRPC), som har begrensede terapeutiske alternativer og er ofte aggressiv. Fjern metastasering er mest observert på dette stadiet av den aggressive sykdommen. CRPC er behandlet av en annen generasjon av AR veien hemmere som forbedrer overlevelse i utgangspunktet, etterfulgt av fremveksten av terapi motstand. Nevroendokrine prostatakreft (NEPC) er en sjelden variant av prostatakreft (PCa) som ofte utvikler seg som følge av behandlings motstanden via en transdifferentiation prosess kjent som Nevroendokrine differensiering (NED), hvor PCa-celler gjennomgår en slekts bryter fra adenocarcinomas og vise økt uttrykk for Nevroendokrine (NE) avstamning markører. I tillegg til de genomisk endringene som driver fremdriften og transdifferentiation til NEPC, er epigenetic faktorer og microenvironmental stikkord ansett som viktige aktører når det kommer til å kjøre sykdomsprogresjon. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å identifisere epigenetic drivere (dvs. små ikke-koding RNAs) som er knyttet til avansert PCa. Ved hjelp av renset microRNAs fra formalin-fast parafin-embedded (FFPE) metastatisk vev og tilsvarende serum-avledet ekstracellulære blemmer (EV), protokollen beskriver hvordan du klargjør biblioteker med riktig kvalitetskontroll for sekvensering microRNAs fra disse eksempel kildene. Å isolere RNA fra både FFPE og EV ' r er ofte utfordrende fordi det meste av det er enten degradert eller er begrenset i kvantitet. Denne protokollen vil utdype ulike metoder for å optimalisere RNA innganger og cDNA biblioteker for å gi mest spesifikke leser og høykvalitets data på sekvensering.
Introduction
Prostatakreft er drevet av androgener opptrer via AR signalering. Derfor er rettet mot AR veien den bærebjelke behandling for sykdommen1. Men motstanden ofte oppstår som et resultat av målrettede terapier og sykdommen utvikler seg til en avansert metastatisk CRPC2. CRPC behandles av andre generasjon av AR-terapi som inkluderer enzalutamidog abirateron,som forbedrer overlevelse i starten. Dødelige varianter som NEPC dukker imidlertid ofte opp i 25 − 30% av de behandlede CRPC-tilfellene som har begrensede behandlingsalternativer, noe som fører til økt dødelighet3. NEPC oppstår via en reversibel transdifferentiation prosess kjent som NED, hvor PCa celler gjennomgår en avstamning bytte fra adenocarcinomas og viser redusert uttrykk for AR og økt uttrykk for NE avstamning markører inkludert enolase 2 (ENO2), kromogranin A (CHGA), og synaptophysin (SYP)4. Gitt at disse motstands variantene oppstår som følge av terapeutiske intervensjoner, er det viktig å dechiffrere trasé som fører til generering av denne dødelige, vanskelig å behandle form av PCa.
Genomics av NEPC ble nylig tydet i en omfattende studie gjort av Beltran et al. der kopi nummer endringer, mutasjoner, enkelt nukleotid polymorfismer (SNPs) og DNA-metylering fra pasient-avledet metastatisk vev ble analysert5. Til tross for signifikant fremgang i forståelsen av Genomics av denne aggressive formen av PCa, er lite kjent om epigenetic faktorene, inkludert de små ikke-koding RNAs (microRNAs) som er involvert i overgangen av CRPC-adenokarsinom til NEPC. MicroRNAs (miRNAs) er 22 BP lang, dobbel-strandet RNAs som opptrer hovedsakelig ved å undertrykke genuttrykk post-transcriptionally av sekvens-spesifikk interaksjon med 3-uoversatt regioner (UTRs) av beslektet mRNA mål6. Flere oncomiRs og tumor Suppressors har nå blitt identifisert, og deres rolle i å regulere sykdom utbruddet og metastasering har vært godt studert i ulike kreft6,7. Disse små ikke-koding RNAs ofte tjene som svært viktige mål i å kontrollere sykdom dødelighet6,8,9. Nyere forskning har vært fokusert på å forstå paracrine virkningene av miRNAs i kreft metastasering via deres transport i EV ' r, slik som exosomes, som renner i blodet og tillater tumorceller å sende disse sekundære Messengers til metastatisk steder i et nuklease-fritt miljø10,11,12. EV ' r bærer miRNAs fra tumorceller å overføre transformere effekter fra verten cellene12. Identifisering av EV ' r som sekundær budbringere av tumorceller kan derfor være nyttig i ikke-invasiv påvisning av alvorlighetsgrad av sykdom.
MiR-1246 er svært upregulated i EV ' r fra aggressiv PCa, og det indikerer sykdoms alvorlighetsgrad13. Disse EV-tilknyttede miRNAs ikke bare som ikke-invasiv biomarkører av sykdommen, men også spille funksjonelt viktige roller i kjøring tumorigenesis. Dermed er det viktig å forstå betydningen av den miRNA repertoar som er forbundet med resistente former for PCa å tillate bedre identifisering av ikke-invasiv biomarkører så vel som deres funksjonelle betydning.
Det advent av neste generasjon sekvensering har tilbudt den mest omfattende plattformen for å studere detaljene i tumor landskap med endringer i Genova som mutasjoner, kromosom Relocations, chromothripsis, og metylering, som alle bidrar betydelig til form og natur kreft14,15,16. Likeledes er det også et viktig verktøy for å forstå de store epigenomic endringene som skjer i en tumor celle, og som ofte er viktige aktører i sykdom alvorlighetsgrad17. Med sikte på å forstå miRNA repertoar knyttet til generering av NEPC, ble små RNA sekvensering utført på FFPE metastatisk CRPC vev og deres tilsvarende serum-avledet EV. RNA avledet fra en av disse to sample kildene er (1) lav i yield og (2) av dårlig kvalitet på grunn av fornedrelse som ofte skjer på grunn av formalin fiksering og EV isolasjon. Videre genererer cDNA biblioteker er en kritisk, men tungvint, trinn i en sekvensering kjøre. Således, metoder for å isolere disse RNAs og bruke dem til å generere biblioteker for små RNA sekvensering krever optimalisering for å generere nøyaktige og pålitelige data.
Det finnes flere metoder for å profil miRNA uttrykk i forskjellige eksempler, inkludert RT-PCR, Microarrays, og in-situ hybridisering (ISH). En protokoll som bruker FFPE-avledet RNA for å evaluere miRNA-uttrykk av RT-PCR og ISH ble nylig utgitt18. Nyere teknologi tilbyr mer omfattende og omfattende plattformer for profilering av miRNA uttrykk i en prøve. NanoString nCounter tilbyder en følsom miRNA oppdagelsen plattform19, bortsett fra oppdagelsen er ofte begrenset av antallet av miRNAs det er anvendelig inne det oppstille (~ 2 000). I et slikt scenario, en mer følsom og uttømmende plattform som neste generasjons sekvensering tilbyr mye større dybde av miRNA identifisering og samtidig profilering i forskjellige prøver20. Metoden har blitt brukt til å bestemme miRNA underskrifter i urin eller plasma fra PCa pasienter21,22,23. I den gjeldende artikkelen, en protokoll er presentert for å bruke en neste generasjons sekvensering plattform for å studere miRNA profiler forbundet med aggressive CRPC bruker FFPE vev og serum-avledet EV RNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble gjennomført i samsvar med de etiske retningslinjene for USAs felles regel og ble godkjent av den institusjonelle komiteen for Human Research.
1. Microdissection
Merk: FFPE metastatisk CRPC-vev med adenokarsinom funksjoner (CRPC-Adeno) eller NE-differensiering (CRPC-NE) ble innhentet fra prostatakreft Biorepository Network (PCBN). Ti-mikron PCa seksjoner på glass lysbilder ble utarbeidet for manuell microdissection som omtalt tidligere18. For å kort oppsummere:
- Deparaffinize vev seksjoner ved soaking lysbildene i xylen (2x, 10 min hver). Deretter rehydrate seksjonene ved incubating lysbildene i 5 min hver i gradert etanol (100%, 95%, 90%, 80%, og 70%), etterfulgt av en destillert vann vask og farging med hematoksylin (30 s suge).
- Etter hematoksylin farging, vask vevet seksjoner med vann. Deretter tørke vevs delene ved å plassere dem i gradert etanol (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (5 min hver) etterfulgt av xylen (5 min).
- Analyser tilsvarende hematoksylin og eosin (H & E) lysbilder for å identifisere tumor områder (dvs. adenocarcinomas eller NED) og merke disse tumor områder og normal tilstøtende områder med hjelp av et styre-sertifisert patologen. Ved hjelp av disse H & E lysbilder som veikart, merke hematoksylin-farget vev innhentet i over trinn for å skille mellom tumor og normale områder.
- Analysere det markerte vevet lysbildet nøye under mikroskopet ved hjelp av et skalpell blad.
- Samle det dissekert vevet fra normale og kreft områder i separate rør ved hjelp av elektrostatisk som kan lades med gel. Den ladet spissen tiltrekker dissekert vev og gir maksimal vev utvinning etter disseksjon. Når vevet holder seg til ladet spissen, skjær spissen i en tom 2 mL samling tube.
2. isolere serum-avledede EV-er
Merk: Frosne pasient serumprøver innhentet fra pasienter med metastatisk CRPC med adenokarsinom egenskaper (CRPC-adeno) eller NE differensiering (CRPC-NE) ble anskaffet fra PCBN ved bruk av en godkjent IRB-protokoll og lagret ved-80 ° c før bruk. Serum prøvene ble samlet inn fra samme sett med pasienter som de som ble brukt til microdissected vev for å muliggjøre sammenligning mellom det tilsvarende vevet og de serum-avledede EV-er. Et kommersielt tilgjengelig serum EV isolasjons reagens ble brukt til å samle inn EV ' r.
- Tin frosne pasient serumprøver ved 4 ° c.
- Bruk 110 μL av tint serumprøver og spinn ved 2 000 x g i 30 min.
- Samle supernatanten for påfølgende EV/exosome isolering og kast rusk pellet. Tilsett 30 μL av serum exosome isolasjons reagens til supernatanten og ruge ved 4 ° c i 30 min.
- Snurr på 10 000 x g i 10 min. samle det EV-utarmet serum forsiktig uten å forstyrre pellet i et separat 1,5 ml rør og oppbevar ved-80 ° c for fremtidig analyse, om nødvendig.
- Resuspend EV-pellet i 70 μL av fosfat bufret saltvann (PBS) fremstilt i nuklease vann. Hold en alikvot for partikkel sporings analyse systemet for å vurdere kvaliteten og antall partikler. Oppbevar resten av prøven ved-80 ° c inntil videre analyse.
3. RNA isolering fra Microdissected prostata vev og EV ' er
Merk: Total RNA ble isolert fra microdissected vev og renset EV ' er ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett (materialfortegnelsen) i henhold til produsentens anvisninger med noen få modifikasjoner. De følgende avsnittene beskriver kort disse prosedyrene med spesiell vekt på de viktige trinnene:
- Isoler RNA-en fra det microdissected vevet.
- Resuspend det microdissected FFPE vevet i 150 μL av proteinase K buffer. Bland med virvlingen og Pipetter ut det gjenværende vevet fra spissen. Spin på 11 000 x g for 1 min.
- Tilsett 10 μL av proteinase K til pellet. Vent i 2 minutter til pellet blir hvit. Pipetter opp og ned et par ganger.
- Ruge ved 56 ° c i 16 min. Vortex hver 3 min.
- Fjern prøvene og la varme blokken nå 80 ° c. Ruge prøvene på blokken i 16 min. Vortex hver 3 min.
- Ruge på isen i 3 min.
- Snurr på 20 000 x g i 15 min. Overfør supernatanten til et nytt 2 ml rør.
- Tilsett 16 μL av DNase booster buffer etterfulgt av 10 μL av DNase I. Bland ved å invertere røret forsiktig og ruge ved romtemperatur (RT) i 15 min.
- Tilsett 320 μL av rød blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer. Bland ved å invertere røret og legg deretter til 1 120 μL av 100% etanol. Umiddelbart overføre på spin kolonner lagret ved 4 ° c. Spin på 8 000 x g for 30 s.
- Vask kolonnene 2x med vaskebuffer og snurre kolonnene ved 20 000 x g i 5 min for å fjerne rester av vaske bufferen.
- La spin-kolonnen lufttørke i 2 − 3 min, og eluere deretter med 19 μL RNase-fritt vann. Quantitate renset RNA på en spektrofotometer og normalisere prøven til 40 ng/μL.
- RNA-isolasjon fra fra serum-avledede EV-er.
- Isoler exosomal RNA ved hjelp av et sett. Tilsett 75 μL av lyseringsbuffer A og 9,3 μL av lyseringsbuffer B til 50 μL av renset EV-fjæringen.
Merk: Fortsett å blande prøven ved å invertere røret i ca. 10 minutter for å tillate fullstendig lyse Rings av EV ' er. - Tilsett 130 μL av 100% etanol og bland umiddelbart ved å invertere prøven. Overfør på en spin kolonne og deretter spinne på 3 300 x g i 1 min.
- Vask kolonnen 2x med vaske bufferen. Snurr kolonnen på 1 300 x g i 3 min for å fjerne vaske bufferen fullstendig.
- La kolonnen lufttørke i 2 min. Tilsett 18 μL av eluering buffer til kolonnen og la den sitte i 2 min. spin på 400 x g for 1 min etterfulgt av en andre Spin på 5 800 x g i 3 min.
- Gjenta trinn 3.2.4 med eluert buffer inkludert i settet for å øke utbyttet av RNA fra prøven.
- Kvantifisere prøven på en spektrofotometer og normalisere den til 40 ng/μL.
- Isoler exosomal RNA ved hjelp av et sett. Tilsett 75 μL av lyseringsbuffer A og 9,3 μL av lyseringsbuffer B til 50 μL av renset EV-fjæringen.
4. forberedelse av biblioteket for små RNA-sekvenser
Merk: En liten RNA bibliotek prep Kit (tabell av materialer) ble brukt til å generere cDNA biblioteker fra de isolerte RNA prøvene. Fremgangsmåten for å generere biblioteker, rense og kvalitet sjekke dem før du kjører på en Sequencer er avgjørende for enhver sekvensering protokollen som de til slutt bestemme kvaliteten på produksjonen data fra en løpe. Derfor, gå forsiktig med hvert trinn. Retningslinjene fra produsenten foreslår at du bruker minimum 50 av RNA. Gitt den dårlige kvaliteten og lave mengder av total RNA som vanligvis fås fra disse to utvalgs kildene, er denne protokollen optimert for RNA-konsentrasjoner så lave som 100 ng. Protokollen nedenfor er for ett utvalg av et bibliotek.
- Generer adapter-ligaturer cDNA.
- Bruk 5 μL av normalisert (40 ng/μL) RNA-prøve. Tilsett 1 μL av 3 ' adapter. Varm opp den termiske cycler til 70 ° c før du incubating prøvene. Ruge i 2 min. umiddelbart overføre prøvene på isen før du flytter til neste trinn.
- I et separat rør, bland 2 μL av ligation buffer, 1 μL av RNase-hemmer, og 1 μL av T4 RNA Ligase 2, en sletting mutant. Bland ved pipettering opp og ned og tilsett 4 μL av denne blandingen til røret med RNA/3-adapteren.
- Overfør til den termiske cycler som har blitt forvarmet til 28 ° c og ruge for 1 time.
- Tilsett 1 μL stopp løsning samtidig som du beholder prøvene på den termiske blokken. Ruge ved 28 ° c i en annen 15 min.
- Fjern rørene og holde på isen umiddelbart etter dette trinnet.
- Tilsett 1 μL 5-adapter i et separat rør.
- Overfør til en termisk cycler som har blitt forvarmet til 70 ° c og ruge i 2 min.
- Umiddelbart plassere røret på isen for å hindre re-annealing av adaptere.
- Tilsett 1 μL av 10 mM ATP til røret av denaturert 5 ' adapter. Bland med pipettering og tilsett 1 μL av T4 RNA ligase til mix. Bland med pipettering og tilsett 3 μL av denne blandingen til røret som inneholder 3 ' adapter-ligaturer RNA. Overføring på den termiske cycler som har blitt forvarmet til 28 ° c og ruge for 1 time.
- Umiddelbart overføre til is og enten fortsette videre med prøvene eller lagre ved-20 ° c for fremtidig bruk.
- For å utføre RT-PCR, bruk 6 μL av hver adapter-ligaturer RNA og tilsett 1 μL av RNA RT primer på den. Overføring til den termiske cycler som har blitt forvarmet til 70 ° c. Ruge i 2 min.
- I et separat rør, bland 2 μL av 5x strand buffer, 0,5 μL av 12,5 mM dNTPs, 1 μL av 100 mM DTT, 1 μL av RNase-hemmere og 1 μL av revers transkriptase. Tilsett 5,5 μL av denne blandingen i ligaturer RNA og Overfør til den termiske cycler som har blitt forvarmet til 50 ° c. Ruge for 1 time.
- Overfør adapteren-ligaturer cDNA umiddelbart til is.
- I et separat rør, bland 25 μL av PCR-mix, 2 μL av RNA PCR primer, 2 μL av RNA PCR primer indeks, og 8,5 μL av RNase-fritt vann. Tilsett 37,5 μL av denne blandingen til 12,5 μL av adapter-ligaturer cDNA. Overføring til den termiske cycler som har blitt forvarmet til 98 ° c. Programmere den termiske cycler som foreslått i produsentens protokoll med syklus nummeret endret til 15 i stedet for 11.
Merk: Sekvenser av alle primere som brukes er oppført under tabell av materialer. - Oppbevar prøvene ved 4 ° c etter fullføring. Fortsett med dem eller Oppbevar ved-80 ° c for fremtidig bruk.
- Rens og utfør kvalitetskontroll for ligaturer cDNA.
Merk: Forsterket cDNA var gel-renset av fulgte fabrikanten ' protokollen bortsett fra for et par modifiseringer å gjøre bedre kvaliteten og utbytte av renset cDNA eksemplar idet forklart neden.- Bruk 6% TBE polyakrylamid gels å rense forsterket cDNA. Fortynne høyoppløselig stigen (HRL) og tilpasset RNA stigen (CRL) med like volumer av DNA lasting fargestoff.
- Tilsett 10 μL av DNA-lasting fargestoff til hver cDNA prøven. Kjør 30 μL av hvert utvalg i to separate kjørefelt ved siden av hverandre med CRL og HRL i mellomsjiktet mellom de to forskjellige prøvene.
- Kjør gelen i 1x TBE buffer på 145 V for ca 30 − 40 min.
Merk: Hold styr på den nedre blå fronten av lasting fargestoff. Stopp elektroforese når den nærmer seg bunnen av gel. - Overfør gelen i 1x TBE buffer med Etidiumbromid bromide (EtBr) ved 0,5 μg EtBr/1 mL 1x TBE.
Forsiktig: EtBr er en kjent kreftfremkallende og hvert trinn fra her til forbrukeravgift fra gelen skal utføres med ekstrem forsiktighet. - Visualiser gelen i en transilluminator og kutt gelen nøyaktig mellom 145 BP og 160 BP markør.
Merk: Adapteren dimers kjøre svært nær 145 BP markør. Derfor, kutt gel litt over 145 BP markør for å unngå forurensning med adapter dimer. - Overfør gelen til DNA bryte rørene oppbevares i 2 mL samle rør. Spin på 20 000 x g for 2 min. Tilsett 300 ΜL av RNase-fritt vann og la den rotere forsiktig på en rocker over natten på RT.
- For å utføre DNA-nedbøren, neste dag overføre innholdet i røret til 5 μm filter rør. Spin på 600 x g for 10 s.
Merk: Ikke la rørene spinne lenger enn 10 s når gelen passerer gjennom filteret. - Tilsett 2 μL av glykogen, 30 μL av 3 M NaOAc, 2 μL av 0,1 x pellets maling, og 975 μL av 100% etanol til det eluert DNA. Spin ved 17 000 x g ved 4 ° c i 20 min.
- Kast supernatanten og tilsett 75% etanol for å vaske pellet. Spin ved 17 000 x g ved 4 ° c i 5 min. kast supernatanten og ruge rørene ved 37 ° c for å fordampe hele etanol.
- Resuspend pellet med 12 μL 10 mM Tris-HCl pH 8,5.
- Utfør en kvalitetskontroll av biblioteket ved å fortynne renset cDNA med 10x (1:10) og bruke 1 μL av fortynnet cDNA til å kjøre på en bio-analysator.
- Forsikre deg om at cDNA produktstørrelse tilsvarer rekkevidden til små RNA (136 − 160 BP) i elektroferogrammet. Beregn den totale molaritet for hver prøve. Normalisere hver prøve til 2 nM ved hjelp av Tris-HCl pH 8,5.
- Denaturere og sekvens renset cDNA.
- Pool bibliotekene ved å blande like volumer av hver 2 nM prøve i en enkelt 200 μL PCR tube. Tilsett 10 μL av ferskt tilberedte 0,2 N NaOH til 10 μL av gruppert bibliotek.
- Bland umiddelbart etter virvlingen, og spinn på 280 x g for 1 min. RUGE ved RT i 5 min.
- Tilsett 10 μL av 200 mM Tris-HCl pH 7 til 20 μL av denaturert biblioteket. Bland med virvlingen og spinn på 280 x g i 1 min.
- Tilsett 970 μL av prechilled hybridisering buffer i biblioteket og bland godt med virvlingen. Biblioteket er ved en konsentrasjon på 20 pM. Hold på isen til det er endelig fortynnet.
Merk: Den endelige fortynning gjøres rett før du kjører på Sequencer. - Tilsett 117 μL av denaturert-biblioteket til 1 183 μL av prechilled hybridisering buffer. Bland ved å invertere røret og puls sentrifuger. Den endelige konsentrasjonen av biblioteket er nå 1,8 pM.
- Tilsett 1,3 μL av PhiX til 1,3 mL endelig bibliotek. For å starte en kjøre på en Sequencer, følg instruksjonene på skjermen på programvaregrensesnittet, se gjennom kjøre parametre, inkludert lese type (enkelt lese), lese lengde (antall sykluser for hver lese), Bibliotek-ID, og velg Start.
5. data analyse
- På slutten av Sequencer kjøre, få den resulterende sekvensering data som fastQ filer. Bruk riktig programvare til å analysere de resulterende sekvensering-dataene.
- Åpne fastQ Toolkit programmet og trykk på Start -knappen.
- Velg filene fra listen over eksempler i programvaren, og velg hvor dataene skal lagres.
- Legg til et strengnavn som gjelder for hver trimmet sekvens. Behold stringens til 0,9. Input kortet sekvensen å trimme som "TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG" fra 3 ' slutten av hvert sekvensielt utvalg. Utvid kategorien Les filtrering og velg en minimum lese lengde på "5". Velg boksen erkjenner og trykk på Fortsett -knappen for å starte trimming. Trimmet filene vil bli lagret i prosjektet mappen på slutten av analysen.
- Åpne det lille RNA v. 1.0 -programmet på programvaren, og trykk på Start -knappen.
- Velg prosjektet der filene skal lagres og sendes etter analysen.
- Velg romanen mirer og differensial mirer funksjon i programmet. Skille gruppene som "kontroll" og "test" for differensial analyse og legge trimmet filer som skal analyseres i sine respektive grupper.
- Velg Start knappen for å starte analysen. Last ned de resulterende filene etter analysene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biblioteket ble utarbeidet etter RNA-isolasjon, og en kvalitetskontroll ble utført. Gel rensing for forsterket cDNA biblioteket fremstilt fra RNA isolert fra microdissected vev og serum-avledet EV ' er vist i figur 1 og figur 2. Produkt størrelsen for adapter-ligaturer miRNAs tilsvarte om lag 136 − 160 BP for hver prøve. Figur 1A-B er merket for å vise rekkevidden av gelen som skal være nøyaktig excised for små RNA biblioteket forberedelse. Figur 2A-B viser gel-elektroforese og electropherograms for microdissected og serum-avledede EV-er. Supplerende figur 1 viser et representativt resultat fra elektroforese maskinen og metoden for å beregne molaritet.
Trinn for å få tak i biblioteket beregningene før du kjører på en Sequencer ble utført. Figur 3 viser representative beregningene fra en liten RNA-sekvensering kjører demonstrere forventet klynge TETTHET, QC-poengsum, klynge bestått filter prosent og estimert avkastning og feilrater. Figur 3A og Figur 3C viser TABELLENE med alle kjøre parametre og graf for QC score over ulike sykluser. Figur 3B, D er grafiske representasjoner av feilrater for PhiX justering over ulike sykluser. De oppgitte dataene er fra analyseprogramvaren på stedet.
En kommersielt tilgjengelig programvareapplikasjon (innholdsfortegnelsen) ble brukt til å analysere de sekvensert prøvene fra microdissected vev og serum-avledede EV-er. Det sekvensert prøvene ble trimmet av adapter sekvenser ved hjelp av FASTq verktøykasse etterfulgt av analyse på "Small RNA v. 1.0" programmet. Figur 3 viser resultatdataene ved analyse. Tabell 1 og tabell 2 Vis totalt antall leser fra microdissected vev og serum-avledet EV-sekvenser. Figur 3A og Figur 3B viser den lille RNA lengde fordelingen for de to prøve kildene.
Figur 1: biblioteks forberedelser for sekvensering av små ikke-koding RNA. Polyakrylamid cDNA gel for de forsterkede bibliotekene fra (A) microdissected FFPE vev RNA og (B) RNA fra renset serum-avledede EV-er. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kvalitetskontroll for sekvensering av små ikke-koding RNA. Representativt bilde for gel-elektroforese og elektroferogrammet for renset cDNA-bibliotek for (A) microdissected FFPE-vev og (B) serum-avledede EV-er. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kjør beregninger for små RNA sekvensering kjøre. Tabell og grafisk representasjon av kjøre parametere% Q ≥ 30, klynge tetthet, klynge bestått filter-%, estimert kapasitet og Q-poengsum for sekvenser som kjøres fra (A) microdissected FFPE-vev og (C) serum-avledet EV-er. Grafisk representasjon av feilrater for PhiX-justering over ulike sykluser for sekvensering kjøres fra (B) microdissected FFPE vev og (D) serum-avledet EV. Feil stolper representerer standardavvik for feil satsene for hver syklus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: forventede resultater fra en liten ikke-koding RNA-sekvensering kjøres. Små RNA lese lengder for bibliotek fra (A) Microdissected FFPE vev og (B) serum-avledet EV. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel | Totalt antall sekvensering lyder |
| 1 | 92, 68658 |
| 2 | 70, 00551 |
| 3 | 1, 56, 41204 |
| 4 | 1, 50, 46681 |
| 5 | 1, 42, 82756 |
| 6 | 1, 27, 38970 |
| 7 | 1, 57, 21318 |
| 8 | 88, 51578 |
| 9 | 1, 32, 16879 |
| 10 | 1, 14, 66162 |
| 11 | 1, 91, 14932 |
Tabell 1: Total sekvensering leser for en liten RNA-sekvensering kjøres fra MICRODISSECTED FFPE-vev. Prosentandel av leser som tilsvarer små RNAs for sekvensert FFPE prøver som ble innhentet etter analyse.
| Eksempel | Totalt antall sekvensering lyder |
| 1 | 2, 30, 88960 |
| 2 | 1, 77, 69806 |
| 3 | 90, 37884 |
| 4 | 87, 26243 |
| 5 | 73, 23571 |
| 6 | 2, 89, 37388 |
| 7 | 76, 52149 |
| 8 | 1, 30, 07122 |
| 9 | 54, 34386 |
| 10 | 93, 05941 |
| 11 | 94, 53760 |
| 12 | 82, 79773 |
Tabell 2: Totalt antall sekvenser som er lest for en liten RNA-sekvens, kjører fra de renset serum-avledede EV-er. Prosentandel av leser som tilsvarer små RNAs for sekvensiell EV-prøver innhentet etter analyse.
Supplerende figur 1: kvalitetskontroll for sekvensering av små ikke-koding RNA. Representative resultater fra en elektroforese maskin som viser den totale molaritet av den indikerte prøven. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å isolere RNA fra FFPE-vev og serum-avledede EV ' er med kits som var optimalisert for å øke avkastningen og kvaliteten på isolerte RNAs. Videre ble renset RNAs brukt til å generere cDNA biblioteker for små RNA sekvensering. Begge de oppførte trinnene er avgjørende for å bestemme kvaliteten og dybden av sekvensering leser som er det endelige resultatet fra kjøre24. Derfor er optimalisering av disse viktige trinnene avgjørende for en vellykket sekvens kjøring.
Et viktig skritt i isolering av FFPE-avledet RNA er fordøyelsen med proteinase K som gjør det mulig å fjerne tverrbundet formalin fra vevet. Dette trinnet er optimalisert ved å incubating prøven ved 55 ° c og 80 ° c i ca 16 − 18 min hver. Dette resulterte i en effektiv økning i kvaliteten på isolert RNA med en økning i 260/280-forholdet. Leser sekvenser er ofte variable for en kjøring som inneholder flere eksempler. Derfor, kontrollere mengden av RNA-innganger ved starten av biblioteket forberedelse tillater ensartethet av biblioteket. Ved hjelp av normalisert RNA hjelper i utjevning en sekvensering kjøre jevnt på tvers av forskjellige prøver. Det mest kritiske trinnet i biblioteket forberedelse er rensing av forsterket adapter ligaturer cDNAs. Det er svært viktig å nøye avgiftsdirektoratet i gels over 140 BP markør, fordi en liten avvik mot bunnen av markøren fører til forurensning av adapteren dimers. Til slutt, normalisering av cDNA biblioteket er det viktigste trinnet i sekvensering protokollen og bør gjøres nøyaktig basert på den beregnede normalitet fra elektroforese maskinen.
I tilfelle en adapter dimer forurensning, kan man kjøre renset biblioteket på en TBE gel og repurify ønsket produkt. Imidlertid er utbyttet av cDNA biblioteket i en slik ekstraksjon betydelig redusert, noe som kan påvirke lese lengde fra prøven. For et anslag på konsentrasjonen av renset cDNA biblioteket, kan man fortynne prøvene før du kjører på elektroforese maskin basert på produktets intensitet i TBE gels og forberede ulike fortynninger (dvs. 5x, 10x, eller 25x). For ytterligere å forbedre estimering av renset cDNA bibliotekene, kjører en qPCR i tillegg til elektroforese bidrar til å evaluere mal nivåer og gir mer nøyaktig normalisering.
Selv om ultracentrifugation er gullstandarden for isolering av EV ' r fra forskjellige kilder, vil en lavere avkastning av partiklene fra en slik ekstraksjon ofte begrense bruken av denne metoden i rensing av EV ' r der Start materialet er begrenset og et betydelig beløp for inn data RNA er nødvendig for nedstrøms applikasjoner. Dermed gir bruk av den totale exosome isolasjons reagens en mye raskere og høyere yield-metode for EV-isolering fra begrensede kilder som serum og plasma fra kliniske prøver.
I alt denne protokollen detaljene metodene for å generere cDNA bibliotekene i en mer tid effektiv måte mens du tar i betraktning avkastningen og kvaliteten på cDNA bibliotekene å få nøyaktig og omfattende sekvensering leser. Gitt potensialet i exosomes som en kilde til kreft biomarkører, denne metoden for neste generasjons sekvensering (NGS) analyser av exosomal miRNA innhold vil være nyttig for forskning i feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av US Army Medical Research Acquisition aktivitet (USAMRAA) gjennom Idea Development Award underAward no. W81XWH-18-1-303 og W81XWH-18-2-0013 og i tillegg av Award no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, og W81XWH-18-2-0019 prostata Cancer Biorepository nettverk (PCBN). Finansiering støtte til forfatterne ' lab ved National Cancer Institute ved National Institutes of Health (Grant Number RO1CA177984) er også anerkjent. Rajvir Dahiya er senior Research Career forsker ved Institutt for Veteraner saker, BX004473 og finansiert av NIH-UO1CA199694 (RD). Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er de av forfatteren og er ikke nødvendigvis godkjent av Department of Defense eller US Army. Vi er takknemlige for Judy Shigenaga, direktør for kjerne anlegget i San Francisco VAMC, for hennes hjelp med NextSeq 500 Sequencer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
