Summary

Sekvensering av små icke-kodande RNA från formalin-fasta vävnader och serum-härledda exosomer från Kastrationsresistenta prostata cancer patienter

Published: November 19, 2019
doi:

Summary

Terapi resistens utvecklas ofta hos patienter med avancerad prostatacancer, och i vissa fall, cancer fortskrider till en dödlig subtyp kallas neuroendokrina prostatacancer. Att bedöma de små icke-kodning RNA-medierade molekylära förändringar som underlättar denna övergång skulle möjliggöra bättre sjukdoms stratifiering och identifiering av kausala mekanismer som leder till utveckling av neuroendokrina prostatacancer.

Abstract

Ablation av androgenreceptorn (AR) signalering av androgen deprivation är målet för den första raden av behandling för prostatacancer som initialt resulterar i cancer regression. Emellertid, i ett stort antal fall, sjukdomen fortskrider till avancerad, kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), som har begränsade terapeutiska alternativ och är ofta aggressiv. Avlägsen metastaser observeras främst i detta skede av den aggressiva sjukdomen. CRPC behandlas av en andra generation av AR-utbildningshämmare som förbättrar överlevnaden initialt, följt av uppkomsten av behandlingsresistens. Neuroendokrina prostatacancer (NEPC) är en sällsynt variant av prostatacancer (PCa) som ofta utvecklas som ett resultat av terapi resistens via en transdifferentiering process som kallas neuroendokrina differentiering (NED), vari PCa celler genomgår en Lineage switch från adenocarcinom och Visa ökat uttryck för neuroendokrina (NE) härstamning markörer. Förutom de genomiska förändringar som driver utvecklingen och transdifferentieringen till NEPC, epigenetiska faktorer och mikromiljö signaler anses vara viktiga aktörer för att driva sjukdomsprogression. Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för att identifiera de epigenetiska drivrutinerna (dvs. små icke-kodning RNAs) som är förknippade med Advanced PCa. Med hjälp av renad mikroRNAs från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) metastatiska vävnader och motsvarande serumhärledda extracellulära blåsor (EVs), beskriver protokollet hur man förbereder bibliotek med lämplig kvalitetskontroll för sekvensering mikroRNAs från dessa provkällor. Isolera RNA från både FFPE och EVs är ofta utmanande eftersom de flesta av det är antingen försämrad eller är begränsad i kvantitet. Detta protokoll kommer att utveckla olika metoder för att optimera RNA-ingångar och cDNA-bibliotek för att ge mest specifika läsningar och data av hög kvalitet vid sekvensering.

Introduction

Prostatacancer drivs av androgener som agerar via AR-signalering. Därför, inriktning på AR vägen är stöttepelaren behandling för sjukdomen1. Emellertid, resistens uppstår ofta som ett resultat av riktade terapier och sjukdomen fortskrider till en avancerad metastaserad CRPC2. CRPC behandlas av andra generationen av ar-behandling som inkluderar enzalutamid och abirateron2,3 vilket förbättrar överlevnaden initialt. Men dödliga varianter som NEPC uppstår ofta i 25 − 30% av behandlade CRPC fall som har begränsade behandlingsalternativ, vilket leder till ökad dödlighet3. Nepc uppstår via en reversibel transdifferentieringsprocess som kallas ned, vari PCa celler genomgår en härstamnings växling från adenocarcinom och visar minskat uttryck av ar och ökat uttryck av ne Lineage markörer inklusive knäck 2 (ENO2), chromogranin a (chga), och synaptophysin (SYP)4. Med tanke på att dessa resistens varianter uppstår som ett resultat av terapeutiska interventioner, är det viktigt att dechiffrera vägar som leder till generering av denna dödliga, svårt att behandla form av PCa.

Genomik av nepc var nyligen dechiffreras i en uttömmande studie som gjorts av Beltran et al. där kopior antal förändringar, mutationer, enstaka nukleotid polymorfismer (SNP), och DNA-metylering från patient-derived metastatiska vävnader analyserades5. Trots betydande framsteg i förståelsen av genomik av denna aggressiva form av PCa, är lite känt om epigenetiska faktorer, inklusive den lilla icke-kodning RNAs (microRNAs) som är inblandade i övergången av CRPC-adenocarcinom till NEPC. Micrornas (mirnas) är 22 BP lång, dubbelsträngad rnas som agerar främst genom att undertrycka genuttryck efter transkriptionellt genom sekvens-specifika interaktioner med 3 ‘-oöversatta regioner (utrs) av besläktat mRNA mål6. Flera oncomirs och tumörsuppressorer har nu identifierats, och deras roll i regleringen av sjukdomsdebut och metastaser har studerats väl i olika cancerformer6,7. Dessa små icke-kodbara rnas fungerar ofta som mycket viktiga mål för att kontrollera sjukdoms dödligheten6,8,9. Nyare forskning har fokuserat på att förstå parakrin effekterna av mirnas i cancermetastaser via deras transport i EVS, såsom exosomes, att flödet i blodet och låta tumörceller att skicka dessa sekundära budbärare till metastaserande platser i en nukleasfri miljö10,11,12. EVs bär miRNAs från tumörcellerna för att överföra omformande effekterna från värdcellerna12. Identifiering av EVs som sekundära budbärare av tumörceller kan därför vara användbara i noninvasiv detektion av sjukdoms svårighetsgrad.

MiR-1246 är mycket uppreglerad i EVs från aggressiva PCa, och det indikerar sjukdomens svårighetsgrad13. Dessa EV-associerade miRNAs inte bara fungera som noninvasiv biomarkörer för sjukdomen, men också spela funktionellt viktiga roller i körningen tumorigenesis. Därför är det viktigt att förstå betydelsen av miRNA-repertoaren som är förknippad med resistenta former av PCa för att möjliggöra bättre identifiering av noninvasiv biomarkörer samt deras funktionella betydelse.

Tillkomsten av nästa generations sekvensering har erbjudit den mest omfattande plattform för att studera detaljerna i tumör landskap med förändringar i genomet såsom mutationer, kromosomala omlokaliseringar, kromothripsis, och metylering, som alla bidrar avsevärt till formen och arten av cancer14,15,16. Likaså, det är också ett viktigt verktyg för att förstå de stora epigenomiska förändringar som sker i en tumör cell och som ofta är viktiga aktörer i sjukdomens svårighetsgrad17. I syfte att förstå miRNA repertoar i samband med generering av NEPC, liten RNA sekvensering utfördes på FFPE metastaserad CRPC vävnader och deras motsvarande serum-derived EVs. RNA som härrör från någon av dessa två provkällor är (1) låg i avkastning och (2) av dålig kvalitet på grund av nedbrytningen som ofta sker på grund av formalin fixering och EV isolering. Dessutom är generering av cDNA-bibliotek en kritisk, men besvärlig, steg i en sekvenserings körning. Metoder för att isolera dessa RNAs och använda dem för att generera bibliotek för små RNA-sekvensering kräver därför optimering för att generera korrekta och tillförlitliga data.

Det finns flera metoder för att profilera miRNA uttryck i olika prover, inklusive RT-PCR, Microarrays, och in situ hybridisering (ISH). Ett protokoll som använder FFPE vävnad-härledda RNA för att utvärdera miRNA uttryck av RT-PCR och ISH publicerades nyligen18. Nyare teknik erbjuder mer uttömmande och omfattande plattformar för profilering miRNA uttryck i ett prov. NanoString nCounter erbjuder en känslig miRNA detekterings plattform19, men upptäckten är ofta begränsad av antalet mirnas som är tillgängliga i matrisen (~ 2 000). I ett sådant scenario, en känsligare och uttömmande plattform som nästa generations sekvensering erbjuder mycket bredare djup av miRNA identifiering och samtidig profilering i olika prover20. Metoden har använts för att bestämma Mirna-signaturer i urin eller plasma från PCa-patienter21,22,23. I den nuvarande artikeln presenteras ett protokoll för att använda en nästa generations sekvenserings plattform för att studera miRNA-profiler i samband med aggressiv CRPC med hjälp av FFPE-vävnader och serum-härledda EV-RNAs.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med de etiska riktlinjerna i USA common Rule och godkändes av den institutionella kommittén för mänsklig forskning. 1. microdissection Anmärkning: FFPE metastaserad CRPC vävnader med adenocarcinom funktioner (CRPC-Adeno) eller NE differentiering (CRPC-NE) erhölls från prostata cancer Biorepository nätverk (PCBN). Tio-micron PCa sektioner på glas diabilder var förberedda för manuell microdissection som d…

Representative Results

Biblioteket utarbetades efter RNA-isolering och en kvalitetskontroll utfördes. Gel rening för det förstärkta cDNA-biblioteket som framställs av RNA som isolerats från mikrodissekerade vävnader och serum-derived EVs visas i figur 1 och figur 2. Den produkt storlek för adapter-ligated miRNAs motsvarade cirka 136 − 160 BP för varje prov. Figur 1A-B är markerade för att visa det sortiment av gelen som ska v…

Discussion

I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att isolera RNA från FFPE-vävnader och serumbaserade EVs med hjälp av satser som optimerats för att öka avkastningen och kvaliteten på isolerade RNAs. Vidare användes de renade RNAs-biblioteken för att generera cDNA-bibliotek för små RNA-sekvensering. Båda de listade stegen är viktiga för att bestämma kvaliteten och djupet av sekvensering läsningar som är slutresultatet från körningen24. Därför är det viktigt att optimera des…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av den amerikanska armén medicinsk forskning förvärvsverksamhet (USAMRAA) genom idéutveckling Award underAward No. W81XWH-18-1-303 och W81XWH-18-2-0013 och dessutom genom tilldelning nr. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, och W81XWH-18-2-0019 prostata cancer Biorepository nätverk (PCBN). Finansieringsstöd till författar labbet av National Cancer Institute vid National Institutes of Health (bidrags nummer RO1CA177984) erkänns också. Rajvir Dahiya är en senior forskarkarriär forskare vid Institutionen för Veterans Affairs, BX004473 och finansieras av NIH-UO1CA199694 (RD). Yttranden, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är de av författaren och är inte nödvändigtvis godkändes av Department of Defense eller US Army. Vi är tacksamma till Judy Shigenaga, chef för Core facility på San Francisco VAMC, för hennes hjälp med NextSeq 500 Sequencer.

Materials

3M NaOAc pH 5.5 USB Corp. 75897 100 mL
5 µm filter tubes IST Engineering Inc. 5388-50
6% TBE polyacrylamide gels Novex EC6265BOX
BaseSpace Illumina Analysis software
Bio-analyzer Agilent
DNA loading dye Novex LC6678
Eppendorf Thermostat plus Eppendorf 1.5 mL
EtBr Pierce 17898
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco 111000200
Exosomal RNA isolation kit Norgen 58000
Gel breaking tubes IST Engineering Inc. 3388-100
Glycogen molecular biology grade Thermo Scientifc R0561
Hematoxylin Select Stat lab SL401
Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676 accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit Qiagen 217504
Nanodrop Thermo Scientifc Nano Drop 1000
Nanosight NTA Malvern LM14
NextSeq 500 Sequencer Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) Illumina FC-404-2001
Pellet paint Millipore 70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase Invitogen 18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant Lucigen LR2D11310K
TBE Running buffer (5X) Novex LC6675
Thermal cycler MJ Research PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum) Invitrogen 4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) Illumina RS-200-0012
Xylene Fisher Scientific X3P- 1GAL
RNA 3' Primer GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1 CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2 ACATCG
RNA PCR Index Primer 3 GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4 TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5 CACTGT
RNA PCR Index Primer 6 ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7 GATCTG
RNA PCR Index Primer 8 TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9 CTGATC
RNA PCR Index Primer 10 AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11 GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12 TACAAG

References

  1. Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
  2. Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
  3. Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
  4. Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
  5. Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
  6. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
  7. Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
  8. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  9. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
  10. Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
  11. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  12. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  13. Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
  14. Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
  15. Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
  16. Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
  17. Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
  18. Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
  19. Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
  20. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
  21. Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
  22. Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
  23. Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
  24. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bhagirath, D., Dahiya, R., Majid, S., Tabatabai, Z. L., Saini, S. Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients. J. Vis. Exp. (153), e60549, doi:10.3791/60549 (2019).

View Video