Summary
Therapie resistentie ontwikkelt zich vaak bij patiënten met gevorderde prostaatkanker, en in sommige gevallen vordert kanker naar een dodelijk subtype genaamd neuro-endocriene prostaatkanker. Beoordeling van de kleine niet-codering RNA-gemedieerde moleculaire veranderingen die deze overgang vergemakkelijken zou leiden tot een betere stratificatie van de ziekte en identificatie van causale mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van neuro-endocriene prostaatkanker.
Abstract
Ablatie van androgeen receptor (AR) signalering door androgeen deprivatie is het doel van de eerste lijn van de therapie voor prostaatkanker die in eerste instantie resulteert in kanker regressie. In een groot aantal gevallen vordert de ziekte echter tot gevorderde, castratie bestendige prostaatkanker (CRPC), die beperkte therapeutische opties heeft en vaak agressief is. Verre metastase wordt meestal waargenomen in dit stadium van de agressieve ziekte. CRPC wordt behandeld door een tweede generatie van AR-pathway-remmers die de overleving in eerste instantie verbeteren, gevolgd door de opkomst van de therapie resistentie. Neuro-endocriene prostaatkanker (NEPC) is een zeldzame variant van prostaatkanker (PCa) die zich vaak ontwikkelt als gevolg van resistentie tegen de therapie via een trans differentiatieproces bekend als neuro-endocriene differentiatie (NED), waarbij PCa-cellen een lineage-schakelaar ondergaan van adenocarcinomen en Toon verhoogde expressie van neuro-endocriene (NE) Lineage markers. Naast de genomische veranderingen die de progressie en de trans differentiatie naar NEPC stimuleren, worden epigenetische factoren en microenvironmental cues beschouwd als essentiële spelers in het stimuleren van ziekteprogressie. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol om de epigenetische bestuurders (d.w.z. kleine niet-Codeer Rna's) te identificeren die geassocieerd zijn met Advanced PCa. Met behulp van gezuiverde Microrna's van formalin-vaste paraffine-ingesloten (FFPE) gemetastaseerde weefsels en overeenkomstige uit serum afgeleide extracellulaire blaasjes (Ev's), wordt in het protocol beschreven hoe u bibliotheken voorbereidt met de juiste kwaliteitscontrole voor sequentiëren Microrna's uit deze voorbeeld bronnen. Het isoleren van RNA van zowel FFPE als EVs is vaak een uitdaging omdat de meeste ervan is aangetast of beperkt in kwantiteit. Dit protocol zal uitwerken op verschillende methoden om de RNA-ingangen en cDNA-bibliotheken te optimaliseren om de meest specifieke leesbewerkingen en gegevens van hoge kwaliteit te leveren bij sequencing.
Introduction
Prostaatkanker wordt gedreven door androgenen die handelen via AR-signalering. Daarom is het targeten van de AR-route de Mainstay-behandeling voor de ziekte1. Echter, resistentie vaak ontstaat als gevolg van gerichte therapieën en de ziekte vordert naar een gevorderd gemetastaseerd CRPC2. Crpc wordt behandeld door een tweede generatie AR-therapie met enzalutamide en abirateron2,3 die de overleving in eerste instantie verbetert. Dodelijke varianten zoals NEPC komen echter vaak voor in 25 − 30% van de behandelde CRPC-gevallen met beperkte behandelingsopties, wat leidt tot verhoogde sterfte3. NEPC ontstaat via een omkeerbaar trans differentiatieproces dat bekend staat als NED, waarin PCa-cellen een lineage-overschakeling ondergaan van adenocarcinomen en een verminderde expressie van AR vertonen en een verhoogde expressie van NE-Lineage markers, waaronder Enolase 2 (ENO2), chromogranine A (CHGA) en synaptophysin (SYP)4. Gezien het feit dat deze resistentie varianten ontstaan als gevolg van therapeutische interventies, is het essentieel om trajecten te ontcijferen die leiden tot het genereren van deze dodelijke, moeilijk te behandelen vorm van PCa.
De genomica van NEPC werd onlangs ontcijferd in een uitputtende studie uitgevoerd door Beltran et al. waarbij het aantal wijzigingen in het afschrift, mutaties, enkelvoudige nucleotide polymorfismen (Snp's) en DNA-methylatie van door patiënten afgeleide metastatische weefsels werden geanalyseerd5. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in het begrip van de Genomics van deze agressieve vorm van PCa, is er weinig bekend over de epigenetische factoren, waaronder de kleine niet-Codeer Rna's (Microrna's) die betrokken zijn bij de overgang van CRPC-adenocarcinoom naar NEPC. MicroRNAs (miRNAs) zijn 22 BP lange, dubbel gestrande rna's die primair handelen door het onderdrukken van genexpressie post-transcriptioneel door sequentie-specifieke interacties met de 3 '-onververtaalde gebieden (utrs) van verwant mRNA targets6. Verschillende oncomirs en tumor suppressors zijn nu geïdentificeerd, en hun rol bij het reguleren van de ziekte aanvang en metastase is goed bestudeerd in verschillende kankers6,7. Deze kleine niet-Codeer rna's dienen vaak als zeer belangrijke doelen bij het beheersen van ziekte sterfte6,8,9. Meer recent onderzoek is gericht op het begrijpen van de paracrine effecten van miRNAs in kanker metastasen via hun transport in EVs, zoals exosomen, die stroom in de bloedbaan en laat tumorcellen om deze secundaire boodschappers naar gemetastaseerde locaties in een Nuclease-vrije omgeving te sturen10,11,12. EVs dragen miRNAs uit de tumorcellen om de transformerende effecten van de hostcellen12over te brengen. Identificatie van EVs als secundaire boodschappers van tumorcellen kan daarom nuttig zijn bij niet-invasieve opsporing van de ernst van de ziekte.
De miR-1246 is sterk upregulated in EVs van agressieve PCa, en het geeft de ziekte ernst13. Deze EV-geassocieerde miRNAs dient niet alleen als niet-invasieve biomarkers van de ziekte, maar speelt ook functioneel belangrijke rollen in het rijden van tumorigenesis. Het is dus essentieel om de betekenis te begrijpen van het miRNA-repertoire dat is geassocieerd met resistente vormen van PCa, om een betere identificatie van niet-invasieve biomarkers en hun functionele betekenis mogelijk te maken.
De komst van de volgende generatie sequencing heeft het meest uitgebreide platform aangeboden om de details van het tumor landschap te bestuderen, waarbij veranderingen in het genoom worden aangebracht, zoals mutaties, chromosomale relocaties, chromothripsis en methylatie, die allemaal aanzienlijk bijdragen aan de vorm en de aard van kanker14,15,16. Evenzo is het ook een essentieel instrument om de enorme epigenomische veranderingen te begrijpen die in een tumor cel voorkomen en die vaak belangrijke spelers zijn in de ernst van de ziekte17. Met het oog op het begrijpen van het repertoire van miRNA dat geassocieerd is met de generatie van NEPC, werd kleine RNA-sequencing uitgevoerd op FFPE-gemetastaseerd CRPC-weefsel en hun corresponderende EVs met serum-afgeleide. RNA afkomstig van een van deze twee monsterbronnen is (1) laag in opbrengst en (2) van slechte kwaliteit als gevolg van de afbraak die vaak gebeurt als gevolg van formaline fixatie en EV-isolatie. Bovendien is het genereren van cDNA-bibliotheken een kritieke, maar omslachtige stap van een sequentiëren uitvoeren. Dus, methoden voor het isoleren van deze Rna's en het gebruik ervan om bibliotheken te genereren voor kleine RNA-sequencing vereisen optimalisatie om accurate en betrouwbare gegevens te genereren.
Er zijn verschillende methoden voor het profiel van miRNA expressie in verschillende monsters, waaronder RT-PCR, micro arrays en in-situ hybridisatie (ISH). Een protocol met behulp van FFPE weefsel-afgeleide RNA te evalueren miRNA uitdrukking door RT-PCR en ISH werd onlangs gepubliceerd18. Meer recente technologieën bieden uitgebreidere en uitgebreidere platforms voor profilering van miRNA-expressie in een steekproef. Nano string nCounter biedt een gevoelig miRNA detectie platform19, maar de detectie wordt vaak beperkt door het aantal miRNAs dat beschikbaar is in de array (~ 2.000). In een dergelijk scenario biedt een gevoeliger en uitputtend platform, zoals de volgende generatie sequencing, een veel bredere diepte van miRNA-identificatie en gelijktijdige profilering in verschillende monsters20. De methode is gebruikt om de Mirna-handtekeningen in urine of plasma te bepalen bij PCA-patiënten21,22,23. In het huidige artikel wordt een protocol gepresenteerd voor het gebruik van een volgende generatie sequencing-platform om miRNA-profielen te bestuderen die zijn gekoppeld aan agressieve CRPC met behulp van FFPE-weefsels en door serum afgeleide EV-Rna's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Amerikaanse gemeenschappelijke regel en werd goedgekeurd door het institutioneel Comité voor menselijk onderzoek.
1. microdissectie
Opmerking: FFPE metastatische CRPC weefsels met adenocarcinoom kenmerken (CRPC-Adeno) of NE differentiatie (CRPC-NE) werden verkregen uit de prostaatkanker Biorepository netwerk (PCBN). Ten-micron PCa-secties op glasplaten werden voorbereid voorhand matige microdissectie zoals eerder besproken18. Kort samenvatten:
- Deparaffine de weefsel delen door het weken van de dia's in xyleen (2x, 10 min elk). Hydrateer vervolgens de delen door de glaasjes gedurende 5 minuten te inbroven in gegradeerde ethanol (100%, 95%, 90%, 80% en 70%), gevolgd door een gedestilleerd water wassen en vlekken met HEMA oxylin (30 s Soak).
- Na hematoxyline-kleuring, was de weefsel secties met water. Dehydraat vervolgens de weefsel gedeelten door ze in gesorteerde ethanol te plaatsen (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (5 min elk) gevolgd door xyleen (5 min).
- Analyseer de corresponderende hematoxyline en eosine (H & E) dia's om de tumor gebieden te identificeren (d.w.z. adenocarcinomen of NED) en markeer deze tumor gebieden en normale aangrenzende gebieden met de hulp van een board-gecertificeerde patholoog. Met behulp van deze H & E dia's als roadmaps, Markeer de HEMA oxylin-gekleurd weefsels verkregen in de bovenstaande stap om onderscheid te maken tussen de tumor en de normale gebieden.
- Dissect de gemarkeerde weefsel Slide zorgvuldig onder de microscoop met behulp van een scalpel blad.
- Verzamel het ontleed weefsel van normale en kankerachtige gebieden in afzonderlijke buisjes met behulp van elektrostatisch geladen pipetpunten voor het laden van gel. Het opgeladen uiteinde trekt het ontleed weefsel aan en zorgt voor maximale weefsel terugwinning na dissectie. Zodra het weefsel plakt aan de opgeladen tip, snijd de tip in een lege 2 mL collectie buis.
2. isoleren van serum afgeleide Ev's
Opmerking: Bevroren patiënt serummonsters verzameld van patiënten met gemetastaseerde CRPC met adenocarcinoom kenmerken (CRPC-Adeno) of NE differentiatie (CRPC-NE) werden verkregen van PCBN met behulp van een goedgekeurd IRB-protocol en opgeslagen bij-80 °C voorafgaand aan het gebruik ervan. Serum monsters werden verzameld uit dezelfde groep patiënten als die welke worden gebruikt voor microdissected weefsels, om vergelijkingen tussen de overeenkomstige weefsels en de door het serum afgeleide Ev's mogelijk te maken. Voor het verzamelen van de EVs werd een in de handel verkrijgbare serum EV-isolatie reagens gebruikt.
- Ontdooit serummonsters van bevroren patiënten bij 4 °C.
- Gebruik 110 μL ontdooide serummonster en spin bij 2.000 x g gedurende 30 minuten.
- Verzamel de supernatant voor daaropvolgende EV/exosome isolatie en gooi de puin pellet weg. Voeg 30 μL serum exosome isolatie reagens toe aan het supernatant en incuberen bij 4 °C gedurende 30 minuten.
- Spin bij 10.000 x g gedurende 10 min. Verzamel het met EV verarmd serum zorgvuldig zonder de pellet te storen in een aparte 1,5 ml tube en bewaar bij-80 °c voor toekomstige analyse, indien nodig.
- Respendeer de EV-pellet in 70 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), bereid in Nuclease-vrij water. Houd een aliquot voor het deeltjes volgsysteem om de kwaliteit en het aantal deeltjes te beoordelen. Bewaar de rest van het monster bij-80 °C tot verdere analyse.
3. RNA-isolatie van Microdissected prostaat weefsels en Ev's
Opmerking: Totaal RNA werd geïsoleerd van micro-gedissected weefsels en gezuiverde Ev's met behulp van een in de handel verkrijgbare Kit (tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant met een paar wijzigingen. In de volgende paragrafen worden deze procedures kort beschreven met speciale nadruk op de belangrijke stappen:
- Isoleer het RNA van de microdissected weefsels.
- Respendeer het micro-gedissected ffpe-weefsel in 150 μL proteïnase K-buffer. Meng door grondig en Pipetteer het rest weefsel van de punt. Spin bij 11.000 x g gedurende 1 minuut.
- Voeg 10 μL proteïnase K toe aan de pellet. Wacht 2 minuten totdat de pellet wit wordt. Pipetteer een paar keer omhoog en omlaag.
- Inincuberen bij 56 °C gedurende 16 min. Vortex elke 3 min.
- Verwijder de monsters en laat het warmte blok oplopen tot 80 °C. Inbroed de monsters op het blok gedurende 16 min. Vortex elke 3 min.
- Incuberen op ijs gedurende 3 minuten.
- Spin bij 20.000 x g gedurende 15 min. Breng de supernatant over naar een nieuwe tube van 2 ml.
- Voeg 16 μL DNase Booster buffer toe, gevolgd door 10 μL DNase I. mix door de buis voorzichtig om te keren en te incuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten.
- Voeg 320 μL rode bloedcel (RBC) lysisbuffer toe. Meng door de buis te inverteren en voeg vervolgens 1.120 μL 100% ethanol toe. Onmiddellijk overdragen op spin kolommen opgeslagen bij 4 °C. Spin bij 8.000 x g voor 30 sec.
- Was de kolommen 2x met de Wash buffer en draai de kolommen op 20.000 x g gedurende 5 minuten om de rest Wash buffer te verwijderen.
- Laat de spin kolom aan de lucht drogen voor 2 − 3 minuten, en vervolgens met 19 μL RNase-vrij water. Kwantificeer het gezuiverde RNA op een spectrofotometer en Normaliseer het monster tot 40 ng/μL.
- RNA-isolatie van EVs van serum-afgeleide.
- Isoleer het exosomale RNA met behulp van een kit. Voeg 75 μL lysisbuffer A en 9,3 μL lysisbuffer B toe aan 50 μL van de gezuiverde EV-suspensie.
Opmerking: Blijf het monster mengen door de buis ongeveer 10 minuten te inverteren om volledige lysis van de Ev's toe te staan. - Voeg 130 μL van 100% ethanol toe en meng onmiddellijk door het monster te inverteren. Transfer op een spin kolom en draai vervolgens op 3.300 x g gedurende 1 minuut.
- Was de kolom 2x met de wasbuffer. Draai de kolom op 1.300 x g gedurende 3 minuten om de wasbuffer volledig te verwijderen.
- Laat de kolom aan de lucht drogen gedurende 2 min. Voeg 18 μL elutie buffer toe aan de kolom en laat het 2 min. draaien bij 400 x g gedurende 1 minuut gevolgd door een tweede spin bij 5.800 x g gedurende 3 min.
- Herhaal stap 3.2.4 met de meegeleverde buffer in de kit om de opbrengst van het RNA uit het monster te verhogen.
- Kwantificeer het monster op een spectrofotometer en Normaliseer het tot 40 ng/μL.
- Isoleer het exosomale RNA met behulp van een kit. Voeg 75 μL lysisbuffer A en 9,3 μL lysisbuffer B toe aan 50 μL van de gezuiverde EV-suspensie.
4. bibliotheek voorbereiding voor kleine RNA-sequencing
Opmerking: Een kleine RNA Library prep Kit (tabel met materialen) werd gebruikt om cDNA-bibliotheken te genereren uit de geïsoleerde RNA-samples. De stappen voor het genereren van Bibliotheken, zuiveren en kwaliteit controleren ze voordat ze worden uitgevoerd op een sequencer zijn cruciaal voor een protocol voor sequentiëren als ze uiteindelijk bepalen de kwaliteit van de uitvoergegevens uit een uitvoering. Ga daarom zorgvuldig verder met elke stap. De richtlijnen van de fabrikant suggereren met behulp van een minimum van 50 ng van RNA. Gezien de slechte kwaliteit en lage hoeveelheden totaal RNA die gewoonlijk uit deze twee monsterbronnen worden verkregen, is dit protocol geoptimaliseerd voor RNA-concentraties zo laag als 100 ng. Het onderstaande protocol is voor één voorbeeld van een bibliotheek.
- Genereren van adapter-ligated cDNA.
- Gebruik 5 μL van een genormaliseerd RNA-monster (40 ng/μL). Voeg 1 μL 3 '-adapter toe. Verwarm de thermische cycler voor op 70 °C voordat u de monsters inbroed. Inbroed gedurende 2 min. Breng de monsters onmiddellijk over op ijs voordat u naar de volgende stap gaat.
- Meng in een aparte buis 2 μL ligatie buffer, 1 μL RNase-remmer en 1 μL T4-RNA ligase 2, een Mutante deletie. Meng door Pipetteer op en neer en voeg 4 μL van deze mix toe aan de buis met de RNA/3 '-adapter.
- Overdracht naar de thermische cycler die is voorverwarmd tot 28 °C en incuberen gedurende 1 uur.
- Voeg 1 μL stop oplossing toe terwijl u de monsters op het thermische blok houdt. Inincuberen bij 28 °C voor nog eens 15 minuten.
- Verwijder de buizen en blijf onmiddellijk na deze stap op ijs.
- Voeg in een aparte buis 1 μL 5 '-adapter toe.
- Breng over naar een thermische cycler die is voorverwarmd tot 70 °C en inbroed gedurende 2 min.
- Plaats de buis onmiddellijk op ijs om het opnieuw gloeien van de adapters te voorkomen.
- Voeg 1 μL 10 mM ATP toe aan de buis van de gedenatureerd 5 '-adapter. Meng door Pipetteer en voeg 1 μL T4 RNA ligase toe aan de mix. Meng door pipetteren en voeg 3 μL van deze mix toe aan de buis die het 3 ' met een adapter ligated RNA bevat. Overdracht op de thermische cycler die is voorverwarmd tot 28 ° c en incuberen voor 1 h.
- Breng onmiddellijk over naar ijs en ga verder met de monsters of Bewaar bij-20 °C voor toekomstig gebruik.
- Om RT-PCR uit te voeren, gebruikt u 6 μL van elke met een adapter ligated RNA en voegt u er 1 μL RNA RT primer aan toe. Overdracht naar de thermische cycler die is voorverwarmd tot 70 °C. Inincuberen gedurende 2 min.
- Meng in een aparte buis 2 μL 5x-streng buffer, 0,5 μL van 12,5 mM Dntp's, 1 μL van 100 mM DTT, 1 μL RNase-remmer en 1 μL reverse-transcriptase. Voeg 5,5 μL van deze mix toe aan het met een adapter ligated RNA en breng over naar de thermische cycler die is voorverwarmd tot 50 °C. Incuberen gedurende 1 uur.
- Breng de adapter-ligated cDNA onmiddellijk over naar ijs.
- Meng in een aparte buis 25 μL PCR-mengsel, 2 μL RNA-PCR-primer, 2 μL RNA-PCR-primer index en 8,5 μL RNase-vrij water. Voeg 37,5 μL van deze mix toe aan 12,5 μL adapter-ligated cDNA. Overdracht naar de thermische cycler die is voorverwarmd tot 98 °C. Program meer de thermische cycler zoals voorgesteld in het Protocol van de fabrikant met het cyclusnummer gewijzigd in 15 in plaats van 11.
Opmerking: Sequenties van alle gebruikte primers worden vermeld onder de tabel met materialen. - Bewaar de monsters na voltooiing bij 4 °C. Ga verder met hen of Bewaar bij-80 °C voor toekomstig gebruik.
- Reinig en voer de kwaliteitscontrole uit voor het geligeerd cDNA.
Opmerking: Versterkte cDNA werd gel-gezuiverd door het Protocol van de fabrikant te volgen, met uitzondering van enkele wijzigingen om de kwaliteit en opbrengst van gezuiverde cDNA-monsters te verbeteren, zoals hieronder wordt uitgelegd.- Gebruik 6% TBE Polyacrylamide gels om de versterkte cDNA te zuiveren. Verdun de hoge-resolutie ladder (HRL) en de aangepaste RNA ladder (CRL) met gelijke volumes DNA loading Dye.
- Voeg 10 μL DNA-laad kleurstof toe aan elk cDNA-monster. Voer 30 μL van elk monster in twee afzonderlijke rijstroken naast elkaar met CRL en HRL in de tussenliggende ruimte tussen de twee verschillende monsters.
- Voer de gel in 1x TBE buffer bij 145 V gedurende ongeveer 30 − 40 min.
Opmerking: Houd de onderste blauwe voorkant van de laad kleurstof bij. Stop de elektroforese wanneer het de bodem van de gel nadert. - Breng de gel over in 1x TBE buffer met ethidium bromide (EtBr) bij 0,5 μg EtBr/1 mL 1x TBE.
Let op: EtBr is een bekend kankerverwekkend en elke stap vanaf hier tot de excisie van de gel met uiterste voorzichtigheid moet worden uitgevoerd. - Visualiseer de gel in een transilluminator en snijd de gel precies tussen de 145 BP en 160 BP marker.
Opmerking: De adapter Dimeren lopen zeer dicht bij de 145 BP marker. Snijd daarom de gel iets boven de 145 BP marker om besmetting met adapter dimer te voorkomen. - Breng de gel over naar DNA-breek buisjes die in 2 mL opvang buizen worden gehouden. Spin bij 20.000 x g gedurende 2 min. Voeg 300 ΜL RNase-vrij water toe en laat het zachtjes draaien op een rocker 's nachts op rt.
- Om de DNA-neerslag uit te voeren, breng de volgende dag de inhoud van de buis over naar 5 μm filter buizen. Spin bij 600 x g voor 10 sec.
Opmerking: Laat de buizen niet langer draaien dan 10 sec. als de gel door het filter gaat. - Voeg 2 μL glycogeen, 30 μL 3 M NaOAc, 2 μL 0,1 x pelletverf en 975 μL 100% ethanol toe aan het geeleerde DNA. Spin bij 17.000 x g bij 4 °c gedurende 20 min.
- Gooi het supernatant weg en voeg 75% ethanol toe om de pellet te wassen. Spin bij 17.000 x g bij 4 °c gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en inbroed de buisjes bij 37 °c om de ethanol volledig te verdampen.
- Respendeer de pellet met 12 μL van 10 mM tris-HCl pH 8,5.
- Voer een kwaliteitscontrole van de bibliotheek uit door het gezuiverde cDNA te verdunnen met 10x (1:10) en 1 μL verdund cDNA te gebruiken om op een bio-Analyzer te draaien.
- Zorg ervoor dat de grootte van het cDNA-product overeenkomt met het bereik van klein RNA (136 − 160 BP) in het elektroferogram. Bereken de totale molariteit voor elk monster. Normaliseer elk monster tot 2 nM met tris-HCl pH 8,5.
- De gezuiverde cDNA te denatureren en te sequenties.
- Pool de bibliotheken door gelijke volumes van elk 2 nM-monster in één PCR-buis van 200 μL te mengen. Voeg 10 μL vers bereide 0,2 N NaOH toe aan 10 μL gepoolde bibliotheek.
- Meng onmiddellijk door vortexing en spin op 280 x g gedurende 1 min. INBROED bij RT gedurende 5 min.
- Voeg 10 μL 200 mM tris-HCl pH 7 tot 20 μL van de gedenatureerde bibliotheek toe. Meng door grondig en spin bij 280 x g gedurende 1 minuut.
- Voeg 970 μL voorgekoelde hybridisatie buffer toe aan de bibliotheek en meng goed door vortexing. De bibliotheek heeft een concentratie van 20 uur. Blijf op ijs totdat het uiteindelijk wordt verdund.
Opmerking: De uiteindelijke verdunning wordt gedaan vlak voor het uitvoeren van de sequencer. - Voeg 117 μL van de gedenatureerde bibliotheek toe aan 1.183 μL van de voorgekoelde hybridisatie buffer. Meng door de buis en pulscentrifuge te inverteren. De uiteindelijke concentratie van de bibliotheek is nu 1,8 pM.
- Voeg 1,3 μL PhiX toe aan de 1,3 mL eind bibliotheek. Om een run op een sequencer te starten, volgt u de stappen op het scherm op de software-interface, controleert u de parameters voor uitvoeren, inclusief Lees type (enkel lezen), lees lengte (aantal cycli voor elke Lees), bibliotheek-ID en selecteer Start.
5. gegevensanalyse
- Aan het einde van de sequencer uitvoeren, verkrijgen van de resulterende sequencing gegevens als fastQ bestanden. Gebruik de juiste software om de resulterende sequentie gegevens te analyseren.
- Open de fastQ Toolkit-applicatie en druk op de Start knop.
- Selecteer de bestanden in de lijst met voorbeelden in de software en selecteer waar de gegevens zullen worden opgeslagen.
- Voeg een tekenreeksnaam toe die van toepassing is op elke bijgesneden reeks. Houd de striktheid aan 0,9. Voer de adapter volgorde voor het bijsnijden als "TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG" uit de 3 ' einde van elk gesequentieerde voorbeeld. Vouw het tabblad filteren lezen uit en selecteer een minimale Lees lengte van "5". Selecteer het vak bevestigen en druk op de knop Doorgaan om het bijsnijden te starten. De bijgesneden bestanden worden na afloop van de analyse in de projectmap opgeslagen.
- Open de kleine RNA v. 1.0 applicatie op de software en druk op de Start knop.
- Selecteer het project waarin de bestanden zullen worden opgeslagen en verzonden na de analyse.
- Selecteer de nieuwe miRs-en differentiële miRs -functie in de toepassing. Scheiden van de groepen als "controle" en "test" voor differentiële analyse en voeg de bijgesneden bestanden worden geanalyseerd in hun respectieve groepen.
- Selecteer de knop starten om de analyse te starten. Download de resulterende bestanden na de analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bibliotheek werd voorbereid na RNA-isolatie en een kwaliteitscontrole werd uitgevoerd. Gel zuivering voor de versterkte cDNA-Bibliotheek, bereid uit RNA geïsoleerd uit micro ontleed weefsels en in serum afgeleide Ev's, wordt weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. De product grootte voor de adapter-ligated miRNAs kwam overeen met ongeveer 136 − 160 BP voor elk monster. Figuur 1A-B is gemarkeerd om het bereik van de gel te tonen dat precies moet worden uitgesneden voor kleine RNA-bibliotheek voorbereiding. Figuur 2A-B toont de Elektroforese van de gel en elektroftalgrammen voor het microdissected weefsel en de in serum afgeleide ev's. Aanvullend figuur 1 toont een representatief resultaat van de elektroforese machine en de methode om de molariteit te berekenen.
Stappen voor het verkrijgen van de bibliotheek metrische gegevens voorafgaand aan het uitvoeren op een sequencer zijn uitgevoerd. Afbeelding 3 toont de representatieve metrische gegevens van een kleine RNA sequentiëren uitvoeren demonstreren van de verwachte cluster dichtheid, QC-Score, cluster doorgeven filter percentage en geschatte opbrengst en foutpercentages. Figuur 3A en Figuur 3C tonen de tabellen met alle run parameters en grafiek voor QC Score over verschillende cycli. Figuur 3B, D zijn grafische weergaven van de foutpercentages voor PhiX-uitlijning over verschillende cycli. De verstrekte gegevens zijn afkomstig van de on-site analyse software.
Een in de handel verkrijgbare softwaretoepassing (tabel met materialen) werd gebruikt voor het analyseren van de gesequentieerde monsters van microdissected weefsel en door serum afgeleide ev's. De geordend samples werden afgesneden van de adapter sequenties met behulp van de fastq Toolkit gevolgd door analyse op de "kleine RNA v. 1.0" applicatie. Figuur 3 toont de resulterende gegevens bij analyse. Tabel 1 en tabel 2 tonen het totale aantal leesbewerkingen van door micro Dissected weefsel en uit serum afgeleide EVS-sequentiëren. Figuur 3A en Figuur 3B tonen de kleine RNA-lengte verdeling voor de twee monsterbronnen.
Figuur 1: bibliotheek voorbereiding voor het sequentiëren van kleine niet-coderings-RNA. Polyacrylamide cDNA gel voor de versterkte bibliotheken van (a) microdissected ffpe weefsel RNA en (B) RNA van gezuiverde serum-afgeleide ev's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: kwaliteitscontrole voor het sequentiëren van klein niet-CODERINGS RNA. Representatief beeld voor gel-elektroforese en elektroftalgram voor gezuiverde cDNA-Bibliotheek voor (A) microdissected ffpe-weefsel en (B) aan serum afgeleide ev's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 3: Voer metrische gegevens voor kleine RNA sequentiëren uitvoeren. Tabel-en grafische weergave van parameters voor uitvoeren% Q ≥ 30, cluster dichtheid, filter% doorgeven van clusters, geschatte opbrengst en Q-score voor sequentiëren uitgevoerd vanaf (A) microdissected ffpe-weefsel en (C) aan serum afgeleide ev's. Grafische weergave van foutpercentages voor PhiX-uitlijning over verschillende cycli voor sequentiëren uitgevoerd vanaf (B) microdissected ffpe-weefsel en (D) aan serum afgeleide ev's. Fouten balken vertegenwoordigen de standaarddeviatie voor de foutpercentages voor elke cyclus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: verwachte uitkomsten van een kleine niet-codering RNA sequentiëren run. Kleine RNA-Lees lengtes voor de bibliotheek van (a) microdissected ffpe-weefsel en (B) aan serum afgeleide ev's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Monster | Totale leesbewerkingen voor sequentiëren |
| 1 | 92, 68658 |
| 2 | 70, 00551 |
| 3 | 1, 56, 41204 |
| 4 | 1, 50, 46681 |
| 5 | 1, 42, 82756 |
| 6 | 1, 27, 38970 |
| 7 | 1, 57, 21318 |
| 8 | 88, 51578 |
| 9 | 1, 32, 16879 |
| 10 | 1, 14, 66162 |
| 11 | 1, 91, 14932 |
Tabel 1: totale sequentiëren leest voor een kleine RNA-sequencing uitvoeren van microdissected FFPE weefsel. Percentage van leesbewerkingen overeenkomend met kleine Rna's voor gesequentieerde FFPE-voorbeelden die zijn verkregen na analyse.
| Monster | Totale leesbewerkingen voor sequentiëren |
| 1 | 2, 30, 88960 |
| 2 | 1, 77, 69806 |
| 3 | 90, 37884 |
| 4 | 87, 26243 |
| 5 | 73, 23571 |
| 6 | 2, 89, 37388 |
| 7 | 76, 52149 |
| 8 | 1, 30, 07122 |
| 9 | 54, 34386 |
| 10 | 93, 05941 |
| 11 | 94, 53760 |
| 12 | 82, 79773 |
Tabel 2: totale sequentiëren leest voor een kleine RNA-sequencing uitgevoerd van gezuiverde serum-afgeleide Ev's. Percentage van leesbewerkingen overeenkomend met kleine Rna's voor gesequentieerde EV-monsters die na analyse zijn verkregen.
Aanvullend figuur 1: kwaliteitscontrole voor het sequentiëren van klein niet-CODEER RNA. Representatieve resultaten van een elektroforese machine die de totale molariteit van het aangegeven monster weergeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel beschrijven we een protocol om RNA te isoleren van FFPE-weefsels en door serum afgeleide Ev's met behulp van kits die zijn geoptimaliseerd om de opbrengst en kwaliteit van geïsoleerde Rna's te verhogen. Verder werden de gezuiverde Rna's gebruikt om cDNA-bibliotheken te genereren voor kleine RNA-sequencing. Beide van de vermelde stappen zijn essentieel voor het bepalen van de kwaliteit en de diepte van de sequentiëren leesbewerkingen die het eindresultaat van de run24zijn. Daarom is het optimaliseren van deze cruciale stappen essentieel voor een geslaagde sequentiëren uitvoeren.
Een belangrijke stap in de isolatie van op FFPE gebaseerd RNA is de spijsvertering met Proteïnurie K die het mogelijk maakt om kruislings gekoppelde formaline uit het weefsel te verwijderen. Deze stap is geoptimaliseerd door het monster te incuberen bij 55 °C en 80 °C gedurende ongeveer 16 − 18 minuten per stuk. Dit resulteerde in een effectieve toename van de kwaliteit van geïsoleerd RNA door een toename van de 260/280 ratio. Sequentiëren leesbewerkingen zijn vaak variabel voor een uitvoering met meerdere voorbeelden. Daarom zorgt het beheersen van de hoeveelheid RNA-ingangen aan het begin van de bibliotheek voorbereiding voor uniformiteit van de bibliotheek. Met behulp van genormaliseerd RNA helpt bij het nivelleren van een sequentiëren uniform worden uitgevoerd over verschillende monsters. De meest kritieke stap in de voorbereiding van de bibliotheek is de zuivering van versterkte adapter geligeerd cdna's. Het is zeer belangrijk om de gels goed te laten afgaan boven de 140 BP marker, omdat een lichte afwijking naar de onderkant van de marker leidt tot contaminatie van de adapter dimers. Ten slotte is het normaliseren van de cDNA-Bibliotheek de belangrijkste stap van het protocol voor sequentiëren en moet het nauwkeurig worden uitgevoerd op basis van de berekende normaliteit van de elektroforese machine.
In het geval van een adapter dimeer besmetting kan men de gezuiverde bibliotheek op een TBE gel opnieuw uitvoeren en het gewenste product herherzuiveren. De opbrengst van de cDNA-Bibliotheek in een dergelijke extractie is echter aanzienlijk afgenomen, wat de Lees lengte van het monster kan beïnvloeden. Voor een schatting van de concentratie van de gezuiverde cDNA-Bibliotheek kan men de monsters vóór het draaien op de elektroforese machine op basis van de product intensiteit in de TBE gels verdunnen en verschillende verdunningen voorbereiden (d.w.z. 5x, 10x of 25x). Om de schatting van de gezuiverde cDNA-bibliotheken verder te verbeteren, helpt het runnen van een qPCR naast elektroforese de sjabloon niveaus te evalueren en zorgt voor een nauwkeurigere normalisatie.
Hoewel ultracentrifugatie de gouden standaard is voor isolatie van EVs uit verschillende bronnen, beperkt een lagere opbrengst van de deeltjes uit een dergelijke extractie vaak het gebruik van deze methode bij het zuiveren van Ev's, waar het uitgangsmateriaal beperkt is en een aanzienlijke hoeveelheid van input RNA is nodig voor downstreamtoepassingen. Zo biedt het gebruik van de totale exosome isolatie reagens een veel snellere en hogere opbrengst methode voor EV-isolatie van beperkte bronnen zoals serum en plasma uit klinische monsters.
In totaal wordt in dit protocol de methoden voor het genereren van cDNA-bibliotheken op een meer tijd effectieve manier in overweging genomen, waarbij rekening wordt gehouden met de opbrengst en kwaliteit van de cDNA-bibliotheken om nauwkeurige en uitgebreide sequentiëren te krijgen. Gezien het potentieel van exosomen als bron van kanker biomarkers, zal deze methode voor de volgende generatie sequencing (NGS) analyses van exosomale miRNA-inhoud nuttig zijn voor onderzoek in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflict te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de US Army Medical Research acquisitie activity (USAMRAA) via de IDEA Development Award under Award No. W81XWH-18-1-303 en W81XWH-18-2-0013 en bovendien door Awardnr. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, en W81XWH-18-2-0019 prostaatkanker Biorepository netwerk (PCBN). Ook de financiering van steun aan auteurs laboratorium door het National Cancer Institute aan de National Institutes of Health (subsidie nummer RO1CA177984) wordt erkend. Rajvir Dahiya is een Senior Research Career Scientist bij de afdeling Veterans Affairs, BX004473 en gefinancierd door NIH-UO1CA199694 (RD). Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van defensie of het Amerikaanse leger. We zijn Judy Shigenaga, directeur van Core Facility in San Francisco VAMC, dankbaar voor haar hulp bij de NextSeq 500 sequencer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
