Summary
התנגדות תרפיה מתפתחת לעתים קרובות בחולים עם סרטן הערמונית מתקדם, ובמקרים מסוימים, סרטן מתקדם לסוג קטלני שנקרא סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים. הערכת קטן ללא קידוד RNA-תיווך שינויים מולקולריים המאפשרים מעבר זה יאפשר מחלות טוב יותר ריבוד וזיהוי של מנגנונים סיבתי המובילים לפיתוח של סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים.
Abstract
אבלציה של קולטן האנדרוגן (AR) איתות על ידי מניעת אנדרוגן היא המטרה של הקו הראשון של טיפול בסרטן הערמונית שגורמת בתחילה רגרסיה הסרטן. עם זאת, במספר משמעותי של מקרים, המחלה מתקדמת מתקדם, סירוס עמידים בסרטן הערמונית (CRPC), אשר יש אפשרויות טיפוליות מוגבלות הוא לעתים קרובות אגרסיבי. גרורות רחוקות נצפה בעיקר בשלב זה של המחלה האגרסיבית. CRPC מטופלת על ידי דור שני של מעכבי מסלול AR כי לשפר את ההישרדות בתחילה, ואחריו הופעתה של התנגדות תרפיה. סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים (NEPC) הוא גרסה נדירה של סרטן הערמונית (PCa) כי לעתים קרובות מתפתחת כתוצאה של התנגדות תרפיה דרך תהליך בידול המכונה בידול נוירואנדוקרינים (נד), שבו תאים PCa לעבור מעבר השושלת מ אדנוקרצינומות ולהראות ביטוי מוגבר של סמני השושלת הנוירואנדוקריניים (NE). בנוסף על שינויים גנומית המניע את ההתקדמות ואת השינויים כדי NEPC, גורמים אפיגנטיים ורמזים microenvironmental נחשבים שחקנים חיוניים התקדמות המחלה הנהיגה. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט כדי לזהות את הנהגים epigenetic (כלומר, RNAs קטנים שאינם קידוד) המשויכים PCa מתקדם. באמצעות מיקרורונאס מטוהרים מתוך formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) רקמות גרורתי מתאים הסרום הנגזר הנגזרות ושלפוחיות (EVs), הפרוטוקול מתאר כיצד להכין ספריות עם בקרת איכות המתאימה לרצף מיקרורונאס ממקורות אלה לדוגמה. בידוד רנ א משניהם FFPE ו EVs הוא לעתים קרובות מאתגרת, כי רוב זה מושפל או מוגבל בכמות. פרוטוקול זה יהיה להרחיב על שיטות שונות כדי לייעל את כניסות RNA וספריות cDNA כדי להניב קריאות ספציפיות ביותר ונתונים באיכות גבוהה על רצף.
Introduction
סרטן הערמונית מונע על ידי אנדרוגנים משחק דרך איתות AR. לכן, מיקוד מסלול AR הוא הטיפול הבעד של המחלה1. עם זאת, התנגדות לעתים קרובות מנסחלת כתוצאה של טיפולים ייעודיים והמחלה מתקדמת ל-CRPC גרורתית מתקדם2. Crpc הוא טיפל בדור השני של טיפול AR הכולל enzalutamide ו abiraterone2,3 אשר משפר את ההישרדות בתחילה. עם זאת, משתנים קטלניים כגון NEPC לעתים קרובות להגיח 25 ל 30% של מקרים CRPC מטופלים שיש להם אפשרויות טיפול מוגבלות, המוביל לתמותה מוגברת3. Nepc נוצר באמצעות תהליך בידול הפיך המכונה נד, שבו pca תאים לעבור מעבר השושלת אדנוקרצינומות ולהראות ירידה ביטוי של AR וביטוי מוגבר של סמני השושלת NE כולל אנולאז 2 (ENO2), כרומוגראנס a (chga), ו synaptophysin (syp)4. בהינתן כי אלה משתנים התנגדות להיווצר כתוצאה של התערבויות טיפוליות, זה חיוני לפענח מסלולים המובילים לדור של זה קטלני, קשה לטפל בצורה של PCa.
הגנומיקה של NEPC פוענח לאחרונה במחקר ממצה שנעשה על ידי באלטרן אל. לפיו העתקת מספר שינויים, מוטציות, נוקלאוטיד יחיד מערכת פולימורית (SNPs), ו-DNA מתילציה מ החולה-נגזר רקמות גרורתי נותחו5. למרות התקדמות משמעותית בהבנת הגנומיקה של צורה זו אגרסיבי של PCa, מעט ידוע על הגורמים האפיגנטיים, כולל RNAs קטן לא קידוד (microRNAs) כי הם מעורבים במעבר של CRPC-אדנוקרצינומה כדי NEPC. Micrornas (mirnas) הם 22 bp ארוך, כפול תקועים rnas כי לפעול בעיקר על ידי דיכוי ביטוי הגנים לאחר ההמרה על ידי אינטראקציות ספציפיות רצף עם 3 '-אזורים בלתי מתורגמים (utrs) של מטרות mrna הקנצוני6. כמה oncomirs ו דכאי הגידול כבר זוהו, ואת תפקידם בוויסות התפרצות המחלה גרורות כבר נחקרו היטב בסוגי סרטן שונים6,7. אלה שאינם קידוד קטן rnas לעתים קרובות משמשים מטרות חשובות מאוד בשליטה תמותת מחלות6,8,9. מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו הבנת ההשפעות הפרפרין של miRNAs בסרטן גרורות דרך התחבורה שלהם ב EVs, כגון אקסוזומים, כי זרימה במחזור הדם ולאפשר לתאי הגידול לשלוח אלה שליחים משניים למיקומים גרורתית בסביבה חופשית nuclease10,11,12. EVs לסחוב miRNAs מתאי הגידול כדי להעביר את ההשפעות שינוי צורה של תאים מארחים12. זיהוי של EVs כמו שליחים משניים של תאים סרטניים יכול אפוא להיות שימושי זיהוי לא פולשני של חומרת המחלה.
מיר-1246 הוא מאוד upregulated ב EVs מ אגרסיבי PCa, וזה מצביע על חומרת המחלה13. אלה miRNAs הקשורים EV לא רק לשמש בסמנים בלתי פולשנית של המחלה, אלא גם לשחק תפקידים חשובים פונקציונלית בנהיגה tuמוריגנזה. כך, חיוני להבין את המשמעות של רפרטואר miRNA כי הוא קשור לצורות עמידות של PCa כדי לאפשר זיהוי טוב יותר של סמנים שאינם פולשנית, כמו גם משמעותם הפונקציונלית.
הופעתו של רצף הדור הבא הציע את הפלטפורמה המקיפה ביותר כדי ללמוד את הפרטים של נוף הגידול מעורבים שינויים הגנום כגון מוטציות, מיקומים מחדש כרומוזום, כרומופרזיס, ו מתילציה, כולם תורמים באופן משמעותי לצורה ולטבע של סרטן14,15,16. כמו כן, הוא גם כלי חיוני כדי להבין את שינויים אפיגנומית המכריע המתרחשים בתא הגידול, כי הם לעתים קרובות שחקנים חשובים בחומרת המחלה17. במטרה להבין את הרפרטואר miRNA הקשורים הדור של NEPC, רצפי RNA קטן בוצע על רקמות הקרמד גרורות FFPE ואת הסרום המקביל שלהם נגזר EVs. RNA נגזר מכל אחד מאותם שני מקורות לדוגמה הוא (1) נמוך בתשואה ו (2) של איכות רעה בשל השפלה כי לעתים קרובות קורה בשל קיבעון פורמלין ו-EV בידוד. יתר על כן, יצירת ספריות cDNA היא קריטית, אבל מסורבלת, צעד של רצף הפעלה. כך, שיטות לבידוד RNAs אלה ושימוש בהם כדי ליצור ספריות עבור רצפי RNA קטנים דורשים אופטימיזציה כדי להפיק נתונים מדויקים ואמינים.
קיימות מספר שיטות לפרופיל ביטוי miRNA בדגימות שונות, כולל RT-PCR, מיקרו-מערכים והיברידיזציה באתרו (ISH). פרוטוקול המשתמש ב-RNA הנגזר מרקמות FFPE כדי להעריך את ביטוי miRNA על ידי RT-PCR ו-ISH פורסם לאחרונה18. טכנולוגיות עדכניות יותר מציעות פלטפורמות ממצה ומקיפות יותר ליצירת פרופיל ביטוי miRNA במדגם. ננו מחרוזת nCounter מציע פלטפורמת זיהוי miRNA רגיש19, אבל הזיהוי מוגבל לעתים קרובות על ידי מספר mirna הזמינים במערך (~ 2,000). בתרחיש כזה, פלטפורמה רגישה יותר וממצה כגון רצף הדור הבא מציעה עומק רחב בהרבה של זיהוי מירנא ויצירת פרופיל סימולטני בדגימות שונות20. השיטה שימש כדי לקבוע את החתימות mirna ב שתן או פלזמה מ-pca חולים21,22,23. במאמר הנוכחי, פרוטוקול מוצג להשתמש פלטפורמת רצף הדור הבא כדי לחקור פרופילי miRNA הקשורים CRPC אגרסיבי באמצעות רקמות FFPE ו-EV RNAs נגזר סרום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה נערך בהתאם להנחיות המוסריות של הכלל המקובל בארה ב ואושר על ידי הוועדה המוסדית לחקר האדם.
1. מיקרודיסקציה
הערה: הרקמות CRPC גרורות עם תכונות אדנוקרצינומה (CRPC-Adeno) או NE בידול (CRPC-NE) הושגו מסרטן הערמונית ביווריפוטורי רשת (PCBN). 10-מיקרון PCa סעיפים על שקופיות זכוכית הוכנו לחיתוך ידני כמתואר בעבר18. כדי לסכם בקצרה:
- מחלקים את הרקמה על ידי השרטת השקופיות ב קסילן (2x, 10 דקות כל אחד). לאחר מכן מימה מחדש את הסעיפים על-ידי דגירה השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורגים (100%, 95%, 90%, 80%, ו 70%), ואחריו שטיפת מים מזוקקים וכתמים עם המטאוקסילין (30 s להשרות).
- , בעקבות מכתים המטולין. שוטפים את חתכי הרקמה במים לאחר מכן מייבשים את חתכי הרקמה על ידי הצבת אותם באתנול מדורגים (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (5 דקות כל אחד) ואחריו קסילן (5 דקות).
- לנתח את המטאוקסילין המקביל ואת אאוזין (H & E) שקופיות כדי לזהות את אזורי הגידול (כלומר, אדנוקרצינומות או נד) ולסמן את אזורי הגידול האלה באזורים הסמוכים נורמלי בסיוע של הפתולוג מוסמך הלוח. שימוש אלה שקופיות H & E כמו מפות כגון, לסמן את המטאוקסילין רקמות מוכתם שהתקבלו בשלב הנ ל כדי להבדיל בין הגידול והאזורים הנורמליים.
- מתחת למיקרוסקופ. בעזרת להב אזמל
- לאסוף את רקמת לגזור מאזורים נורמליים וסרטניים בצינורות נפרדים באמצעות הג טעונה סטטי ג'ל טעינת הצינורות. הטיפ טעונה מושך את רקמת גזור ומאפשר שחזור רקמות מקסימלית לאחר הניתוח. ברגע שהרקמה מנדבקת לתשר הטעון, חותכים את הקצה לצינור הגבייה הריק של 2 מ ל.
2. סרום בידוד-EVs נגזר
הערה: סרום קפוא החולה דגימות שנאסף מחולים עם מאפייני CRPC גרורות עם מאפיינים אדנוקרצינומה (CRPC-adeno) או NE בידול (CRPC-NE) הושגו PCBN באמצעות פרוטוקול IRB מאושר מאוחסן ב-80 ° צ' לפני השימוש שלהם. דגימות סרום נאספו מאותה קבוצה של חולים כמו אלה המשמשים רקמות מיקרו כדי לאפשר השוואה בין הרקמות המתאימות ואת סרום נגזר EVs. סרום מסחרי זמין בבידוד EV בידוד שימש כדי לאסוף את EVs.
- הפשרת דגימות של נסיוב החולה הקפוא ב -4 ° c.
- השתמש 110 μL של דגימת סרום מופסדר וספין ב 2,000 x g עבור 30 דקות.
- לאסוף את supernatant עבור הבאים EV/אקסוקצת בידוד ולהשליך את הגלולה פסולת. הוסף 30 μL של סרום אקסוכמה בידוד מגיב הסופרנטאנט ו הדגירה ב 4 ° צ' עבור 30 דקות.
- ספין ב 10,000 x g עבור 10 דקות. לאסוף את הנסיוב EV-מרוקן בזהירות מבלי להפריע את הגלולה בצינור 1.5 mL נפרד וחנות ב-80 ° צ' לניתוח עתידי, במידת הצורך.
- השהה מחדש את גלולה EV ב 70 μL של מלוחים מואגור פוספט (PBS) המוכנים במים ללא שכירות. לשמור על מספר הטלפון עבור מערכת ניתוח מעקב אחר חלקיקים כדי להעריך את האיכות והמספר של החלקיקים. אחסן את שאר המדגם ב-80 ° צ' עד לניתוח נוסף.
3. רנ א בידוד מיקרוגזור רקמות הערמונית ו EVs
הערה: סה כ RNA היה מבודד מרקמות מיקרו ומטוהרים EVs באמצעות ערכה מסחרית זמין (טבלת חומרים) לכל הוראות היצרן עם כמה שינויים. הסעיפים הבאים מתארים בקצרה הליכים אלה עם דגש מיוחד על השלבים החשובים:
- לבודד את ה-RNA מרקמות המיקרוגזור.
- השהה מחדש את רקמת FFPE ב-150 μL של מאגר פרוטטינואז K. מערבבים על ידי הורטקנג ופיפטה. את שרידי הרקמה מהקצה ספין ב 11,000 x g עבור 1 דקות.
- הוסף 10 μL של פרוטאינאז K לתוך הגלולה. לחכות 2 דקות עד הגלולה הופך לבן. . פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים
- מודקון ב 56 ° צ' עבור 16 דקות מערבולת כל 3 דקות.
- הסירו דגימות ותנו לבלוק החום להגיע 80 ° c. מודקון את הדגימות על הבלוק עבור 16 דקות. מערבולת כל 3 דקות.
- דגירה על הקרח 3 דקות.
- ספין ב 20,000 x g עבור 15 דקות. להעביר את supernatant לצינור חדש 2 mL.
- הוסף 16 μL של מאגר המאיץ DNase ואחריו 10 μL של DNase I. מערבבים על ידי היפוך הצינור בעדינות ו-דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 15 דקות.
- הוסף 320 μL של מאגר הליזה של תא דם אדום (RBC). מערבבים על ידי היפוך הצינור ולאחר מכן להוסיף 1,120 μL של 100% אתנול. העברה מיידית על עמודות ספין המאוחסנות ב-4 ° c. ספין ב 8,000 x g עבור 30 s.
- לשטוף את העמודות 2x עם מאגר לשטוף ולסובב את העמודות ב 20,000 x g עבור 5 דקות כדי להסיר מאגר לשטוף שיורית.
- הניחו לעמודת הסחרור להתייבש לאוויר במשך 2 עד 3 דקות, ולאחר מכן לחלופין, עם 19 μL של מים ללא RNase. בקוונטייט רנ א מטוהרים על ספקטרוסקופיה ולנרמל את המדגם כדי 40 ng/μL.
- רנ א בידוד מ סרום נגזר EVs.
- לבודד את רנ א האקסוזומבית באמצעות ערכה. הוסף 75 μL של מאגר הליזה A ו 9.3 μL של מאגר הליזה B כדי 50 μL של ההשעיה EV מטוהרים.
הערה: להמשיך לערבב את המדגם על ידי היפוך הצינור עבור כ 10 דקות כדי לאפשר הליזה מלאה של EVs. - הוסף 130 μL של 100% אתנול ולערבב מיד על ידי היפוך המדגם. העבר על עמודת ספין ולאחר מכן ספין ב 3,300 x g עבור 1 דקות.
- שטוף את העמודה 2x עם מאגר הכביסה. ספין העמודה ב 1,300 x g עבור 3 דקות כדי להסיר לחלוטין את מאגר לשטוף.
- אפשר לעמודה להתייבש במשך 2 דקות. הוסף 18 μL של מאגר הימנעות לעמודה ולתת לו לשבת 2 דקות. ספין ב 400 x g עבור 1 דקות ואחריו ספין שני ב 5,800 x g עבור 3 דקות.
- חזור על השלב 3.2.4 עם מאגר החומק כלול בערכה כדי להגדיל את התשואה של ה-RNA מן המדגם.
- לכמת את המדגם על ספקטרוסקופיה ולנרמל אותו 40 ng/μL.
- לבודד את רנ א האקסוזומבית באמצעות ערכה. הוסף 75 μL של מאגר הליזה A ו 9.3 μL של מאגר הליזה B כדי 50 μL של ההשעיה EV מטוהרים.
4. הכנת הספרייה לרצפי RNA קטנים
הערה: ערכת הכנה קטנה של ספריית RNA (טבלת חומרים) שימש להפקת ספריות cdna מדגימות ה-rna הבודדות. השלבים כדי ליצור ספריות, לטהר, ואיכות לבדוק אותם לפני ריצה ברצף הם חיוניים לכל פרוטוקול רצף כפי שהם בסופו של דבר לקבוע את איכות נתוני הפלט מהפעלה. לכן, המשך בזהירות עם כל שלב. ההנחיות של היצרן מציע באמצעות מינימום של 50 ng של RNA. בהינתן איכות ירודה וכמויות נמוכות של RNA סה כ המתקבלים בדרך כלל אלה שני מקורות לדוגמה, פרוטוקול זה ממוטב עבור ריכוזי RNA נמוך כמו 100 ng. הפרוטוקול שלהלן מיועד לדוגמה אחת של ספריה.
- צור cDNA מתאם.
- השתמש ב-5 μL של דגימת RNA מנורמלת (40 ng/μL). הוסף 1 מתאם μL של 3. מחממים את הציקלר התרמי ל-70 ° צ' לפני הדגירה של הדגימות. דגירה עבור 2 דקות. העבר מיד את הדגימות על הקרח לפני המעבר אל השלב הבא.
- בצינור נפרד, מערבבים 2 μL של מאגר לחיץ, 1 μL של מעכב RNase, ו-1 μL של T4 ליגסה 2, מוטציה מחיקה. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה ולהוסיף 4 μL של תערובת זו לצינור עם מתאם RNA/3.
- העברה אל הציקלונט תרמית כי כבר מחומם מראש עד 28 ° c ו-דגירה של 1 h.
- הוסף 1 μL של פתרון עצירה תוך שמירה על הדגימות בבלוק התרמי. מודקון ב 28 ° צ' עבור עוד 15 דקות.
- להסיר את הצינורות ולשמור על קרח מיד לאחר שלב זה.
- בשפופרת נפרדת, הוסף 1 מתאם μL של 5.
- העברה לציקלונט תרמית כי כבר מחומם מראש עד 70 ° c ו דגירה עבור 2 דקות.
- מיד מניחים את השפופרת על הקרח כדי למנוע ריפוי מחדש של המתאמים.
- הוסף 1 μL של 10 מ"מ מ-ATP לצינור המתאם של 5. מערבבים על ידי ליטוף ולהוסיף 1 μl של T4 RNA ליגאז לערבב. מערבבים על ידי ליטוף ולהוסיף 3 μL של תערובת זו לצינור המכיל את 3 ' מתאם-RNA ligated. העברה על הציקלונט תרמית כי כבר מחומם מראש עד 28 ° c ו דגירה עבור 1 h.
- העבירו מיד לקרח והמשיכו עוד עם הדגימות או החנות ב-20 ° c לשימוש עתידי.
- כדי לבצע RT-PCR, השתמש 6 μL של כל מתאם-RNA ligated ולהוסיף 1 μL של RNA RT התחל אליו. העבר לציקלייר התרמי שחומם מראש ל-70 ° c. דגירה עבור 2 דקות.
- בתוך צינור נפרד, לערבב 2 μL של מאגר גדיל 5x, 0.5 μL של 12.5 mM dNTPs, 1 μL של 100 מ"מ DTT, 1 μL של מעכב RNase, ו 1 μL של היפוך הטרנססקריפט. הוסף 5.5 μL של תערובת זו לרנ א-ליגאט המתאם והעבר לציקלייר התרמי שחומם מראש ל-50 ° c. . מודטה לשעה
- העבר את המתאם מייד לקרח.
- בצינור נפרד, מערבבים 25 μL של שילוב PCR, 2 μL של RNA PCR פריימר, 2 μL של מדד ה-RNA PCR, ו-8.5 μL של מים בחינם RNase. הוסף 37.5 μL של תערובת זו ל 12.5 μL של מתאם cDNA ליגציה. העבר לציקלייר התרמי שחומם מראש ל-98 ° c. תכנת את הציקלייר התרמי כפי שהוצע בפרוטוקול היצרן עם מספר המחזור שהשתנה ל-15 במקום 11.
הערה: רצפים של כל התחל בשימוש רשומים תחת טבלת חומרים. - שמרו את הדגימות ב -4 מעלות צלזיוס לאחר השלמת. המשך איתם או אחסן ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.
- טיהור וביצוע של בקרת איכות עבור cDNA הליבטים.
הערה: CDNA מוגבר היה מטוהרים ג'ל על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן, למעט כמה שינויים כדי לשפר את איכות ותשואה של דגימות cDNA מטוהרים כפי שהוסבר להלן.- השתמש 6% שימוש בג אלקטרופורזה כדי לטהר את cdna מוגבר. לדלל את הסולם ברזולוציה גבוהה (HRL) ואת הסולם RNA מותאם אישית (CRL) עם כמויות שוות של צבע הטעינה DNA.
- הוסף 10 μL של צבע העמסה DNA לכל דגימת cDNA. הפעל 30 μL של כל מדגם בשני מסלולים נפרדים סמוכים זה לזה עם CRL ו HRL במרחב הביניים בין שתי דגימות שונות.
- הפעל את הג במאגר של 1x TBE ב-145 V בערך 30 עד 40 דקות.
הערה: עקוב אחר החזית הכחולה התחתונה של צבע הטעינה. הפסיקו את האלקטרופורזה כאשר היא מתקרבת לתחתית ג'ל. - העבר את הג במאגר של 1x TBE עם אתידיום ברומיד (EtBr) ב-0.5 μg/1 מ"ל 1x TBE.
זהירות: EtBr הוא גורם מסרטן ידוע וכל צעד מכאן עד הכיוון של ג'ל צריך להתבצע בזהירות מירבית. - המחש את ג'ל המשגר וחותכים את הג בדיוק בין 145 bp ו 160 לחץ דם.
הערה: דימרס מתאם לרוץ קרוב מאוד 145 לחץ דם. לכן, לחתוך את הג מעט מעל סמן 145 bp כדי למנוע זיהום עם dimer מתאם. - להעביר את ג'ל שבירת DNA צינורות שמרו 2 מ ל איסוף צינורות. ספין ב 20,000 x g עבור 2 דקות. להוסיף 300 Μl של RNase-מים חינם ולאפשר לו לסובב בעדינות על הנדנדה לילה ב-RT.
- כדי לבצע את משקעים DNA, ביום הבא להעביר את התוכן של הצינור כדי 5 יקרומטר מסנן צינורות. ספין ב 600 x g עבור 10 s.
הערה: אל תתנו הצינורות להסתחרר יותר מ 10 כמו ג'ל עובר דרך המסנן. - הוסף 2 μL של הגליקוגן, 30 μL של 3 M NaOAc, 2 μL של לצבוע את הגלולה 0.1 x, ו-975 μL של 100% אתנול אל ה-DNA להתחמק. ספין ב 17,000 x g ב 4 ° צ' עבור 20 דקות.
- להיפטר supernatant ולהוסיף 75% אתנול כדי לשטוף את הגלולה. ספין ב 17,000 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות. לבטל את supernatant ו מודלת את הצינורות ב 37 ° צ' כדי להתאדות לחלוטין את האתנול.
- השהה מחדש את הגלולה עם 12 μL של 10 mM טריס-HCl pH 8.5.
- ביצוע בדיקת איכות הספרייה על ידי דילול cDNA מטוהרים על ידי 10x (1:10) ושימוש 1 μL של cDNA מדולל לרוץ על ביו-מנתח.
- ודא כי גודל המוצר cDNA מתאים לטווח של RNA קטן (136-160 bp) ב electropherogram. חישוב המולכל הכולל עבור כל דוגמה. לנרמל כל דוגמה ל 2 ננומטר באמצעות טריס-HCl pH 8.5.
- . הספרות והרצף של ה-דנ א הטהור
- הצגת הספריות על-ידי ערבוב של כרכים שווים של כל אחת מ-2 מדגם ננומטר בצינור 200 μL יחיד. הוסף 10 μL של טרי מוכן 0.2 N NaOH עד 10 μL של ספריה במאגר.
- מערבבים מיד על ידי vortexing, ו ספין ב 280 x g עבור 1 דקות. דגירה ב RT עבור 5 דקות.
- הוסף 10 μL של 200 mM טריס-HCl pH 7 כדי 20 μL של הספרייה הדנית. מערבבים על ידי vortexing ו ספין ב 280 x g עבור 1 דקות.
- הוסף 970 μL של מאגר הכלאה מקורר לספריה וערבב היטב על ידי vortexing. הספרייה נמצאת בריכוז של 20 בבוקר. לשמור על הקרח עד שהוא לבסוף מדולל.
הערה: הדילול הסופי נעשה. לפני שהוא רץ ברצף - הוסף 117 μL של הספריה הנסבעת לפני 1,183 μL של מאגר הכלאה מקורר. מערבבים על ידי היפוך הצינור ואת צנטריפוגה הדופק. הריכוז הסופי של הספרייה. הוא עכשיו 1.8
- הוסף 1.3 μL של PhiX ל 1.3 mL של הספרייה הסופית. כדי ליזום הפעלה ברצף, בצע את השלבים על המסך בממשק התוכנה, סקור את פרמטרי ההפעלה, כולל סוג קריאה (קריאה בודדת), אורך קריאה (מספר מחזורים עבור כל קריאה), מזהה ספריה ובחר באפשרות התחל.
5. ניתוח נתונים
- בסוף לרוץ ברצף, להשיג את הנתונים ברצף שנוצר כקבצי fastQ. השתמש בתוכנה המתאימה כדי לנתח את נתוני הרצף המתקבל.
- פתח את יישום ערכת הכלים fastQ ולחץ על לחצן ההפעלה .
- בחר את הקבצים מרשימת הדגימות בתוכנה ובחר היכן יישמרו הנתונים.
- הוסף שם מחרוזת שיחול על כל רצף חתוך. . שמור על החריפות ל0.9 הקלט את רצף המתאם כדי לחתוך כ-"TGGAATTCTCCCAAGG" מהקצה השלישי של כל דגימת רצף. הרחיבו את הכרטיסייה ' קריאת סינון ' ובחרו אורך קריאה מינימלי של '5'. בחר את תיבת האישור ולחץ על לחצן ' המשך ' כדי להתחיל בקיטום. הקבצים הגזומים יישמרו בתיקיית הפרוייקט בתום הניתוח.
- פתח את היישום הקטן RNA v. 1.0 על התוכנה ולחץ על כפתור ההשקה .
- בחר את הפרוייקט שבו יישמרו הקבצים ויישלחו לאחר הניתוח.
- בחר ביישום הרומן מירס והפונקציה הדיפרנציאלית מירס . ביניהם "שליטה" ו-"בדיקה" לניתוח דיפרנציאלי והוספת הקבצים הגזומים שיש לנתח בקבוצות המתאימות.
- בחר את כפתור השיגור לייזום הניתוח. לאחר הניתוח, הורד את הקבצים שיתקבלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הספרייה הוכנה לאחר בידוד רנ א ובדיקת איכות בוצעה. ג'ל טיהור עבור הספרייה cDNA מוגבר הכין מ RNA מבודדים מרקמות microdissected ו-סרום נגזר EVs מוצג באיור 1 ואיור 2. גודל המוצר עבור מתאם-ligated מקשר התכתב על 136-160 bp עבור כל מדגם. איור 1א-ב מסומנים כדי להציג את הטווח של הג כי צריך להיות מגורש בדיוק עבור הכנה קטנה של ספריית RNA. איור 2א-ב להראות את האלקטרופורזה ג'ל ו electropherograms עבור רקמת מיקרו ו סרום-נגזר EVs. איור משלים 1 מציג תוצאה מייצגת ממכונת האלקטרופורזה והשיטה לחישוב מולד.
שלבים להשגת מדדי הספרייה לפני הפעלת ברצף בוצעו. איור 3 מראה את מדדי הנציג מתוך רצף RNA קטן הממחיש את צפיפות האשכול הצפוי, הציון QC, אשכול העברת אחוז מסנן, התשואה המשוער שיעורי השגיאה. איור 3A ו- איור 3ג להראות את הטבלאות עם כל הפרמטרים להפעיל את הגרף עבור ציון QC על מחזורים שונים. איור 3B, D הם ייצוגים גרפיים של שיעורי השגיאה עבור היישור phix על מחזורים שונים. הנתונים שסופקו הם מתוכנת הניתוח שבאתר.
יישום תוכנה זמין מסחרית (טבלה של חומרים) שימש כדי לנתח את הדגימות רצף של רקמת מיקרו ו-סרום נגזר EVs. הדגימות הרצף נחתכו מרצפי המתאם באמצעות ערכת הכלים FASTq ולאחריה ניתוח ביישום "הקטן RNA v. 1.0". איור 3 מציג את הנתונים שיתקבלו במהלך הניתוח. טבלה 1 וטבלה 2 הצג סה כ קריאות מתוך רקמת מיקרוגזור ו-EVs הנגזרת סרום-רצף הפעלה. איור 3A ו איור 3B הצג את התפלגות באורך RNA קטן עבור שני מקורות לדוגמה.
איור 1: הכנת הספרייה לרצפי RNA קטנים ללא קידוד. פוליאקרילאמיד cDNA ג'ל עבור ספריות מוגבר מ (A) רקמות ffpe מיקרו rna ו (ב) rna מ סרום מטוהרים-נגזר EVs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בדיקת איכות עבור רצפי RNA קטן ללא קידוד. דימוי מייצג של ג'ל לאלקטרופורזה וelectropherogram לספריית cDNA מטוהרים (A) מיקרופיקציה רקמות ffpe ו (ב) סרום-נגזר EVs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הפעל מדדים עבור הפעלת רצפי RNA קטנים. ייצוג טבלאי וגרפי של פרמטרי הפעלה% Q ≥ 30, צפיפות אשכול, מסנן העברת האשכולות%, תשואה מוערכת וציון Q עבור רצף הפעלה מ-(A) רקמות ffpe ו-(ג) סרום-נגזר EVs. ייצוג גרפי של שיעורי שגיאה עבור יישור PhiX על פני מחזורים שונים עבור רצף הפעלה מ (ב) רקמות ffpe ו-(ד) סרום-נגזר EVs. סרגלי שגיאות מייצגים סטיית תקן עבור תעריפי השגיאה עבור כל מחזור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התוצאות הצפויות של הפעלת רצפי RNA קטנה ללא קידוד. מרחק קריאה של רנ א קטן עבורהספרייהמ (A) רקמת ffpe ו-(ב) סרום-נגזר EVs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| דוגמה | סה כ קריאות רצף |
| 1 | 92, 68658 |
| 2 | 00551, 70 |
| 3 | 1, 56, 41204 |
| 4 | 1, 50, 46681 |
| מיכל 5 | 1, 42, 82756 |
| 6 | 1, 27, 38970 |
| 7 | 1, 57, 21318 |
| 8 | 88, 51578 |
| 9 | 1, 32, 16879 |
| 10 | 1, 14, 66162 |
| 11 | 1, 91, 14932 |
טבלה 1: ברצף הכולל קריאות עבור רצף RNA קטן לרוץ מתוך רקמת FFPE מיקרוגזור. אחוז הקריאות המתאימות ל-RNAs קטן עבור דגימות FFPE שעברו רצף שהתקבלו לאחר הניתוח.
| דוגמה | סה כ קריאות רצף |
| 1 | 2, 30, 88960 |
| 2 | 1, 77, 69806 |
| 3 | 90, 37884 |
| 4 | 87, 26243 |
| מיכל 5 | 73, 23571 |
| 6 | 2, 89, 37388 |
| 7 | 76, 52149 |
| 8 | 1, 30, 07122 |
| 9 | 54, 34386 |
| 10 | 93, 05941 |
| 11 | 94, 53760 |
| 12 | 82, 79773 |
טבלה 2: רצף כולל קריאות עבור רצף RNA קטן לרוץ מ סרום מטוהרים-נגזר EVs. אחוז הקריאות המתאימות ל-RNAs קטן עבור דגימות EV שעברו רצף המתקבלות לאחר הניתוח.
איור משלים 1: בדיקת איכות עבור רצפי RNA קטן ללא קידוד. תוצאות הנציג ממכונת האלקטרופורזה מראה את המולגינה הכולל של המדגם שצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לבודד RNA מ-FFPE רקמות ו-סרום נגזר EVs באמצעות ערכות שהיו ממוטבת כדי להגדיל את התשואה והאיכות של RNAs מבודדים. עוד, RNAs מטוהרים שימשו כדי ליצור ספריות cDNA עבור רצפי RNA קטן. שני השלבים המפורטים הם הכרחיים בקביעת האיכות והעומק של קריאות הרצף הבאות הן התוצאה הסופית מהפעלת24. לכן, אופטימיזציה של צעדים קריטיים אלה היא קריטית להפעלת רצף מוצלחת.
צעד חשוב בבידוד של ה-RNA הנגזר FFPE הוא העיכול עם פרוטטינואז K המאפשר הסרה של פורמאלין מקושרות מתוך הרקמה. שלב זה ממוטב על ידי העברת המדגם ב55 ° c ו-80 ° צ' במשך כ-16 עד 18 דקות כל אחד. זה הביא לעלייה אפקטיבית באיכות של RNA מבודדים על ידי עלייה ביחס 260/280. קריאות רצף הן לעתים קרובות משתנה עבור הפעלה הכוללת מספר דוגמאות. לכן, שליטה על כמות כניסות RNA בתחילת הכנת הספרייה מאפשרת אחידות של הספרייה. שימוש ב-RNA מנורמל מסייע בהחלקת רצף של הפעלה אחידה בין דגימות שונות. השלב הקריטי ביותר בהכנה של הספריה הוא טיהור של cDNAs של מתאם מוגבר. חשוב מאוד לבלו בזהירות את הג מעל לסמן 140 bp, מכיוון שסטייה קלה כלפי החלק התחתון של הסמן מובילה לזיהום של מתאם המתאם. לבסוף, נרמול הספרייה cDNA הוא הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול רצף וצריך להיעשות באופן מדויק על הנורמליות המחושבת ממכונת האלקטרופורזה.
במקרה של זיהום דיימר מתאם, ניתן להפעיל מראש את הספרייה הטהורה על ג'ל tbe ומוניטין המוצר הרצוי. עם זאת, התשואה של ספריית cDNA בחילוץ כזה הוא ירד באופן משמעותי, אשר עשוי להשפיע על אורך הקריאה מתוך המדגם. להערכת הריכוז של ספריית cDNA מטוהרים, אחד יכול לדלל את הדגימות לפני הפעלת על מכונת האלקטרופורזה מבוסס על עוצמת המוצר ב-TBE ג'לים ולהכין מדלל שונים (כלומר, 5x, 10x, או 25x). כדי לשפר עוד יותר את הערכה של ספריות cDNA מטוהרים, הפעלת qPCR בנוסף האלקטרופורזה עוזר להעריך את רמות התבנית ומאפשר נורמליזציה מדויקת יותר.
למרות שהניתוק הוא תקן הזהב לבידוד של EVs ממקורות שונים, תשואה נמוכה יותר של החלקיקים מחילוץ כזה מגבילה לעתים קרובות את השימוש בשיטה זו בטיהור EVs היכן שהחומר ההתחלתי מוגבל וכמות משמעותית של קלט RNA נדרש עבור יישומים במורד הזרם. כך, השימוש הכולל אקסודי בידוד מגיב מספק שיטת תשואה מהירה וגבוהה יותר עבור בידוד EV ממקורות מוגבלים כמו סרום פלזמה מדגימות קליניות.
בסך הכל, פרוטוקול זה מפרט את השיטות ליצירת ספריות cDNA באופן יעיל יותר זמן תוך נטילת בחשבון את התשואה והאיכות של ספריות cDNA כדי לקבל מדויק ומקיף קריאות רצף. בהינתן הפוטנציאל של אקסוזומים כמקור של סרטן בסמנים, שיטה זו עבור רצפי הדור הבא (NGS) ניתוחים של תוכן מירזומלית יהיה מועיל עבור מחקר בתחום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד אינטרסים להכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על-ידי הפעילות הרפואית של הצבא האמריקאי לחקר המחקר (USAMRAA) באמצעות פרס התפתחות הרעיון של הפרס לא. W81XWH-18-1-303 ו W81XWH-18-2-0013 ובנוסף על ידי הפרס לא. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH 18-2-0018, ו W81XWH-18-2-0019 סרטן הערמונית ביווריפוטורי רשת (PCBN). מימון תמיכה המחברים ' מעבדה על ידי המכון הלאומי לסרטן במוסדות הלאומי לבריאות (גרנט מספר RO1CA177984) מוכרת גם. רג'ביר דהיי הוא מדען בכיר בקריירה מחקר במחלקה לענייני ותיקי, BX004473 וממומן על ידי NIH-UO1CA199694 (RD). דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחבר והן לא בהכרח אושרו על ידי משרד הביטחון או צבא ארה ב. אנו מודים לג Shigenaga, מנהל מתקן הליבה בסן פרנסיסקו VAMC, עבור עזרתה עם NextSeq 500 ברצף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
