Summary
치료 저항은 수시로 향상된 전립선암을 가진 환자에서 발전하고, 어떤 경우에는, 암은 신경 내분비 전립선암에게 불린 치명적인 특수형으로 점진합니다. 이 전이를 촉진하는 작은 비 코딩 RNA 매개 분자 변경을 평가하면 신경 내분비 전립선암의 발달로 이어지는 인과 메커니즘의 더 나은 질병 계층화 및 식별이 가능합니다.
Abstract
안 드로 겐 수용 체의 절제 (AR) 안 드로 겐 박탈에 의해 신호는 처음 암 회귀 결과 전립선 암에 대 한 치료의 첫 번째 라인의 목표. 그러나 상당수의 경우, 이 질병은 치료 옵션이 제한되어 있고 종종 공격적인 고급 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로 진행됩니다. 먼 전이는 주로 공격적인 질병의이 단계에서 관찰됩니다. CRPC는 초기에 생존을 향상시키는 2세대 AR 통로 억제제에 의해 치료되고, 치료 저항성의 출현이 뒤따랐다. 신경 내분비 전립선암 (NEPC)은 종종 신경 내분비 분화 (NED)로 알려진 분화 과정을 통해 치료 저항의 결과로 발생하는 전립선 암 (PCa)의 드문 변이체이며, PCa 세포는 계보 스위치를 겪는다. 선암에서 신경 내분비 (NE) 계보 마커의 증가 된 발현을 보여줍니다. NEPC에 진행및 분화를 유도하는 게놈 변경 이외에, 후성 유전학 요인 및 미세 환경 단서는 질병 진행을 구동에 필수적인 선수로 간주됩니다. 이 원고는 고급 PCa와 연관된 후성 유전학 드라이버(즉, 작은 비코딩 RNA)를 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE) 전이성 조직과 그에 상응하는 혈청 유래 세포외 소포(EV)의 정제된 마이크로RNA를 사용하여 시퀀싱에 적합한 품질 관리를 통해 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 샘플 소스에서 microRNA. FFPE와 EV 모두에서 RNA를 분리하는 것은 종종 도전적이다 그것의 대부분은 저하 또는 수량에 제한되기 때문에. 이 프로토콜은 RNA 입력 및 cDNA 라이브러리를 최적화하여 시퀀싱 시 가장 구체적인 판독 및 고품질 데이터를 산출하는 다양한 방법에 대해 자세히 설명합니다.
Introduction
전립선암은 AR 신호를 통해 작용하는 안드로겐에 의해 구동됩니다. 따라서, AR 통로를 표적으로 하는 것은 질병1에대한 주된 치료이다. 그러나, 저항은 표적으로 한 치료의 결과로 수시로 계속되고 질병은 향상된 전이성 CRPC2로점진합니다. CRPC는 엔잘루타미드와 아비라테론2,3을 포함하는 2세대 AR 요법에 의해 치료되며, 이는 초기에 생존을 향상시킨다. 그러나, NEPC와 같은 치명적인 이체는 수시로 증가한사망3로이끌어 내는 한정된 처리한 CRPC 케이스의 25-30%에서 나타납니다. NEPC는 NED로 알려진 가역적 분화 과정을 통해 발생하며, 여기서 PCa 세포는 선암으로부터 계보 전환을 거치고 AR의 대사감소 및 에놀라제 2(ENO2), 염색그라닌 A(CHGA) 및 시냅토피신(SYP)을 포함하는 NE 계보 마커의 발현 증가를 보여준다. 이러한 저항 변이체는 치료 적 개입의 결과로 발생 감안할 때, PCa의 형태를 치료하기 어려운이 치명적인 의 생성으로 이어지는 경로를 해독하는 것이 필수적이다.
NEPC의 유전체학은 최근 Beltran 등에서 수행한 철저한 연구에서 해독되었으며, 이에 의해 카피 수 변경, 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs), 및 환자 유래 전이성 조직으로부터의 DNA 메틸화를 분석하였다5. PCa의 이 공격적인 양식의 유전체학의 이해에 있는 중요한 전진에도 불구하고, NEPC에 CRPC 선암의 전환에 관여하는 작은 비코딩 RNA (microRNAs)를 포함하여 후성적인 요인에 관하여 거의 알려지지 않습니다. MicroRNAs(miRNAs)는 22 bp 길이, 이중 가닥 RNA로, 코그네이트 mRNA 표적의 3'-번역되지 않은 영역(UTRs)과의 서열 특이적 상호작용에 의해 유전자 발현 후 전사를 억제함으로써 주로 작용한다6. 몇몇 oncomirs 및 종양 억제제는 지금 확인되고, 질병 개시 및 전이 조절에 있는 그들의 역할은 다른암6,7에서잘 공부되었습니다. 이러한 작은 비코딩 RNA는 종종 질병 사망률6,8,9를조절하는 데 매우 중요한 표적으로 작용한다. 보다 최근의 연구는 엑소좀과 같은 엑소좀에서의 수송을 통해 암 전이에서 miRNAs의 파라크린 효과를 이해하는 데 초점을 맞추고 있으며, 이는 혈류에서 흐르고 종양 세포가 이러한 이차 메신저를 뉴클레아제 없는 환경에서 전이성 위치로 보낼 수 있도록하는 10,11,12. EV는 숙주세포(12)로부터형질전환 효과를 전달하기 위해 종양 세포로부터 miRNAs를 운반한다. 따라서 종양 세포의 이차 메신저로서 EV의 식별은 질병 중증도의 비침습적 검출에 유용할 수 있다.
miR-1246은 공격적인 PCa로부터 전기자동차에서 고도로 상승조절되며, 질병 중증도13을나타낸다. 이 EV 관련 miRNAs는 질병의 비침범성 biomarkers로 봉사할 뿐 아니라, 또한 종양 발생을 운전에 있는 기능적으로 중요한 역할을 합니다. 따라서, 비침습적 바이오마커의 더 나은 식별뿐만 아니라 그들의 기능적 중요성을 더 잘 식별할 수 있도록 PCa의 내성 형태와 연관되는 miRNA 레퍼토리의 중요성을 이해하는 것이 필수적이다.
차세대 염기서열 분석의 출현은 돌연변이, 염색체 재배치, 염색체 및 메틸화와 같은 게놈의 변경을 수반하는 종양 경관의 세부 사항을 연구하는 가장 포괄적인 플랫폼을 제공했으며, 이들 모두는 암의 형태와 특성에 크게 기여하고있다 14,15,16. 마찬가지로, 종양 세포에서 발생하는 광대한 후성 유전체 학적 변화를 이해하는 데 필수적인 도구이며 질병 중증도17에서종종 중요한 선수입니다. NEPC의 생성과 관련된 miRNA 레퍼토리를 이해하기 위한 목적으로, FFPE 전이성 CRPC 조직 및 이들의 상응하는 혈청 유래 EV에서 작은 RNA 염기서열 분석이 수행되었습니다. 이들 두 샘플 공급원 중 어느 하나에서 유래된 RNA는 (1) 수율이 낮고 (2) 포르말린 고정 및 EV 격리로 인해 종종 발생하는 열화로 인한 품질 불량이다. 또한 cDNA 라이브러리를 생성하는 것은 중요하지만 번거로운 순서 실행 단계입니다. 따라서 이러한 RNA를 격리하고 이를 사용하여 작은 RNA 시퀀싱을 위한 라이브러리를 생성하는 방법은 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하기 위한 최적화가 필요합니다.
RT-PCR, 마이크로어레이 및 인-시트 혼성화(ISH)를 포함하여 상이한 샘플에서 miRNA 발현을 프로파일화하는 몇 가지 방법이 있다. RT-PCR 및 ISH에 의한 miRNA 발현을 평가하기 위해 FFPE 조직 유래 RNA를 이용한 프로토콜은 최근18일발표되었다. 최신 기술은 샘플에서 miRNA 발현을 프로파일링하기 위한 보다 철저하고 포괄적인 플랫폼을 제공합니다. NanoString nCounter는 민감한 miRNA 검출플랫폼(19)을제공하지만, 검출은 종종 어레이에서 이용 가능한 miRNAs의 수에 의해 제한된다(~2,000). 이러한 시나리오에서, 차세대 시퀀싱과 같은 보다 민감하고 철저한 플랫폼은 상이한 샘플20에서훨씬 더 넓은 깊이의 miRNA 식별 및 동시 프로파일링을 제공한다. 상기 방법은 PCa환자21,22,23으로부터소변 또는 혈장에서 miRNA 서명을 결정하는 데 사용되어 왔다. 현재 기사에서, 프로토콜은 FFPE 조직 및 혈청 유래 EV RNA를 사용하여 공격적인 CRPC와 관련된 miRNA 프로파일을 연구하기 위해 차세대 염기서열 분석 플랫폼을 사용하여 제시된다.
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Protocol
이 연구는 미국 공통 규칙의 윤리 적 지침에 따라 수행되었으며 인간 연구에 대한 기관위원회의 승인을 받았습니다.
1. 미세 해부
참고: 선암 기능(CRPC-Adeno) 또는 NE 분화(CRPC-NE)를 가진 FFPE 전이성 CRPC 조직은 전립선암 생체 분석 네트워크(PCBN)로부터 수득되었다. 유리 슬라이드에 10 미크론 PCa 섹션은 이전에 논의 된 바와 같이 수동 미세 해부를 위해 제조되었다18. 간략하게 요약하려면 다음을 수행하십시오.
- 자일렌 (2 x, 10 분 각)에 슬라이드를 담가 조직 섹션을 분리합니다. 그런 다음 등급이 매겨진 에탄올 (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %)에서 슬라이드를 5 분 동안 인큐베이팅한 다음 증류수 세척및 헤마톡실린 (30 s soak)으로 염색하여 섹션을 재수화합니다.
- 헤마톡실린 염색 후 조직 부분을 물로 씻으하십시오. 그런 다음 등급이 매겨진 에탄올 (70 %, 80 % 90 %, 95 %, 100 %)에 배치하여 조직 섹션을 탈수 (각 5 분) 자일렌 (5 분).
- 해당 헤마톡신 및 에오신(H&E) 슬라이드를 분석하여 종양 부위(즉, 선암 또는 NED)를 식별하고 보드 인증 병리학자의 도움을 받아 이러한 종양 영역과 정상적인 인접 부위를 표시합니다. 이러한 H&E 슬라이드를 로드맵으로 사용하여, 종양과 정상 영역을 구별하기 위해 위의 단계에서 얻은 헤마톡실린 염색 조직을 표시합니다.
- 메스 블레이드를 사용하여 현미경 으로 표시된 조직 슬라이드를 조심스럽게 해부하십시오.
- 정전기 충전 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 별도의 튜브에서 정상 및 암 영역에서 해부 된 조직을 수집합니다. 충전 된 팁은 해부 된 조직을 끌어 당기고 해부 후 최대 조직 회복을 허용합니다. 티슈가 충전된 팁에 달라붙으면 팁을 빈 2mL 수집 튜브로 자릅니다.
2. 세럼 유래 EV 분리
참고: 선암 특성(CRPC-adeno) 또는 NE 분화(CRPC-NE)를 가진 전이성 CRPC 환자로부터 채취한 냉동 환자 혈청 샘플을 승인된 IRB 프로토콜을 사용하여 PCBN으로부터 조달하고 사용 전에 -80°C에서 저장하였다. 혈청 샘플은 해당 조직과 혈청 유래 EV 사이의 비교를 허용하기 위해 미세 해부 조직에 사용되는 것과 동일한 환자 세트로부터 수집되었다. 시판되는 혈청 EV 절연 시약을 사용하여 EV를 수집하였습니다.
- 4 °C에서 냉동 환자 혈청 샘플을 해동.
- 해동 된 혈청 샘플 110 μL을 사용하고 30 분 동안 2,000 x g에서 돌루습니다.
- 후속 EV / 엑소좀 격리에 대한 상류를 수집하고 파편 펠릿을 폐기. 30 μL의 혈청 엑소좀 분리 시약을 상체에 넣고 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 10,000 x g에서 10분 간 회전합니다.
- 뉴클레아제 없는 물에 제조된 인산완충식염수(PBS)의 70 μL에서 EV 펠릿을 다시 중단시켰다. 파티클 추적 분석 시스템에 대한 알리쿼트상태를 유지하여 파티클의 품질과 수를 평가합니다. 나머지 시료는 추가 분석이 될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
3. 미세 해부 된 전립선 조직 및 전기 자동차로부터의 RNA 분리
참고: 총 RNA는 몇 가지 수정으로 제조자의 지시에 따라 시판되는키트(표의 재료)를 사용하여 미세 제해 조직 및 정제된 전기 자동차로부터 분리하였다. 다음 섹션에서는 중요한 단계를 특히 강조하여 이러한 절차를 간략하게 설명합니다.
- 미세 해부 조직에서 RNA를 분리하십시오.
- 150 μL의 단백질분해제 K 완충액에서 미세 해부된 FFPE 조직을 재중단시. 팁에서 잔류 조직을 소용돌이와 파이펫으로 섞어 넣습니다. 1분 동안 11,000 x g에서 회전합니다.
- 펠릿에 10 μL의 단백질나아제 K를 넣습니다. 펠릿이 하얗게 변할 때까지 2분 동안 기다립니다. 피펫을 위아래로 몇 번.
- 56°C에서 16분 동안 소용돌이를 3분간격으로 배양합니다.
- 샘플을 제거하고 열 블록이 80 °C에 도달하게하십시오. 3분마다 16분 동안 블록에 샘플을 배양합니다.
- 얼음에 3분 동안 배양합니다.
- 15 분 동안 20,000 x g에서 회전.
- DNase 부스터 버퍼 16 μL을 넣고 10 μL의 DNase I. 튜브를 부드럽게 반전시키고 실온(RT)에서 15분 동안 배양하여 혼합합니다.
- 적혈구 (RBC) 라시스 완충액의 320 μL을 추가합니다. 튜브를 뒤집어 섞은 다음 100% 에탄올 1,120 μL을 첨가합니다. 4 °C에 저장된 스핀 컬럼에 즉시 전달하십시오. 30s에 대한 8,000 x g에서 회전.
- 세척 버퍼로 컬럼을 2x 세척하고 20,000 x g에서 5분 동안 컬럼을 회전하여 잔류 세척 버퍼를 제거합니다.
- 스핀 컬럼을 2-3분 동안 공기 건조시키면 19 μL의 RNase 불물로 용해됩니다. 분광광도계에서 정제된 RNA를 정량화하고 샘플을 40 ng/μL로 정규화합니다.
- 혈청 유래 전기 자동차로부터의 RNA 분리.
- 키트를 사용하여 외형 RNA를 분리합니다. 75 μL의 용해 완충액 A 및 9.3 μL의 용해 완충액 B를 정제된 EV 현탁액의 50 μL에 첨가한다.
참고: EV의 완전한 용해가 허용되도록 약 10 분 동안 튜브를 반전시켜 샘플을 혼합하십시오. - 100% 에탄올 130 μL을 넣고 시료를 뒤집어 즉시 섞습니다. 스핀 컬럼에서 옮긴 다음 3,300 x g에서 1분 동안 회전합니다.
- 세척 버퍼로 컬럼을 2x 세척합니다. 1,300 x g에서 3분 동안 열을 회전하여 세척 버퍼를 완전히 제거합니다.
- 컬럼이 2분 동안 공기 건조되도록 허용 버퍼 18 μL을 추가하고 2분 동안 2분 간 기다립니다. 400 x g에서 1분 간 회전한 다음 5,800 x g에서 3분 동안 두 번째 스핀을 합니다.
- 3.2.4 단계를 샘플로부터 RNA의 수율을 높이기 위해 키트에 포함된 용출 버퍼를 반복한다.
- 분광광도계에서 시료를 정량화하고 40 ng/μL로 정규화합니다.
- 키트를 사용하여 외형 RNA를 분리합니다. 75 μL의 용해 완충액 A 및 9.3 μL의 용해 완충액 B를 정제된 EV 현탁액의 50 μL에 첨가한다.
4. 작은 RNA 염기서열 분석용 도서관 준비
참고: 작은 RNA 라이브러리 준비키트(표 오브 머티리얼)를사용하여 단리된 RNA 샘플로부터 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 시퀀서에서 실행하기 전에 라이브러리를 생성하고, 정화하고, 품질을 확인하는 단계는 결국 실행에서 출력 데이터의 품질을 결정할 때 모든 시퀀싱 프로토콜에 매우 중요합니다. 따라서 각 단계를 신중하게 진행하십시오. 제조 업체에서 지침 RNA의 최소 50 ng를 사용 하 여 제안. 이 두 샘플 소스에서 일반적으로 얻은 총 RNA의 품질이 좋지 않으며 낮은 양을 감안할 때, 이 프로토콜은 100 ng의 낮은 RNA 농도에 최적화되어 있습니다. 아래 프로토콜은 라이브러리의 한 샘플에 대한 것입니다.
- 어댑터 결찰 cDNA를 생성합니다.
- 정규화된 RNA 샘플(40 ng/μL)의 5 μL을 사용하십시오. 3' 어댑터 1μL을 추가합니다. 샘플을 인큐베이션하기 전에 열 사이클러를 70°C로 예열합니다. 2 분 동안 배양. 다음 단계로 이동하기 전에 즉시 얼음에 샘플을 전송합니다.
- 별도의 튜브에서, 결찰 완충제 2 μL, RNase 억제제의 1 μL, 및 T4 RNA Ligase 2의 1 μL, 결실 돌연변이를 혼합한다. 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고 RNA/3' 어댑터로 튜브에 이 혼합물의 4 μL을 추가합니다.
- 28°C로 예열된 열 사이클러로 전달하고 1시간 동안 배양한다.
- 열 블록에 샘플을 유지하면서 스톱 솔루션 1 μL을 추가합니다. 28°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 튜브를 제거하고 이 단계 직후얼음을 유지하십시오.
- 별도의 튜브에 5' 어댑터 1 μL을 추가합니다.
- 70°C로 예열된 열 사이클러로 옮기고 2분 동안 배양하였다.
- 즉시 어댑터의 재어닐링을 방지하기 위해 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 변성된 5' 어댑터 튜브에 1μL의 10mMATP를 추가합니다. 파이펫팅하여 혼합하고 혼합에 T4 RNA 리가제 1 μL을 첨가한다. 파이펫팅으로 혼합하고 3'어댑터 결찰 RNA를 함유하는 튜브에 이 혼합물의 3 μL을 첨가한다. 28°C로 예열된 열 사이클러상에 전사하고 1시간 동안 배양한다.
- 즉시 얼음으로 옮기고 시료를 더 진행하거나 향후 사용을 위해 -20°C에 보관하십시오.
- RT-PCR을 수행하려면 각 어댑터 결찰 RNA의 6 μL을 사용하고 RNA RT 프라이머 1 μL을 추가하십시오. 70°C로 예열된 열 사이클러로 이송합니다. 2 분 동안 배양하십시오.
- 별도의 튜브에서 5x 스트랜드 버퍼의 2 μL, 0.5 μL의 12.5 mM dNTP, 100 mM DTT의 1 μL, RNase 억제제 1 μL 및 역전사 1 μL을 혼합합니다. 이 혼합물의 5.5 μL을 어댑터 결찰 RNA에 넣고 50°C로 예열된 열 사이클러로 옮니다. 1 시간 동안 배양하십시오.
- 어댑터 결찰된 cDNA를 즉시 얼음으로 옮김을 옮김을 옮김.
- 별도의 튜브에서, PCR 혼합물 25 μL, RNA PCR 프라이머 2 μL, RNA PCR 프라이머 지수 2 μL, 그리고 8.5 μL의 RNase-free 물을 혼합합니다. 이 혼합물의 37.5 μL을 12.5 μL의 어댑터 결찰 cDNA에 추가합니다. 98°C로 예열된 열 사이클러로 이송합니다. 제조업체의 프로토콜에 제안된 대로 열 주기기를 11대신 15로 수정하여 프로그래밍합니다.
참고: 사용된 모든 프라이머의 시퀀스는 재료 표아래에 나열됩니다. - 완료 후 샘플을 4 °C에서 유지합니다. 계속 진행하거나 -80°C에서 보관하여 나중에 사용하십시오.
- 결찰된 cDNA에 대한 품질 관리를 정화하고 수행한다.
참고: 증폭된 cDNA는 아래에 설명된 바와 같이 정제된 cDNA 샘플의 품질 및 수율을 개선하기 위한 몇 가지 변형을 제외하고 제조자의 프로토콜을 따짐으로써 겔 정제되었다.- 증폭 된 cDNA를 정화하기 위해 6 % TBE 폴리 아크릴 아미드 젤을 사용합니다. DNA 로딩 염료의 동일한 부피로 고해상도 사다리 (HRL) 및 사용자 정의 RNA 사다리 (CRL)를 희석하십시오.
- 각 cDNA 샘플에 DNA 로딩 염료 10 μL을 추가합니다. CRL 및 HRL과 인접한 두 개의 개별 차선에서 각 샘플의 30 μL을 두 개의 서로 다른 샘플 사이의 중간 공간에서 실행합니다.
- 젤을 1x TBE 버퍼에서 약 30-40분 동안 145V로 실행합니다.
참고: 적재 염료의 낮은 파란색 앞면을 추적합니다. 젤의 바닥에 접근 할 때 전기 동극을 중지합니다. - 0.5 μg EtBr/1 mL 1x TBE에서 에티듐 브로마이드(EtBr)로 1x TBE 완충액으로 겔을 옮긴다.
주의 사항: EtBr은 알려진 발암 물질이며 여기에서 부터 겔에서 절제 될 때까지 각 단계는 극도의주의를 기울여 수행해야합니다. - 트랜스일루미에이터에서 겔을 시각화하고 145 bp 및 160 bp 마커 사이에 겔을 정밀하게 절단하였다.
참고: 어댑터 다이머는 145bp 마커에 매우 가깝게 실행됩니다. 따라서 어댑터 이디머로 오염을 방지하기 위해 겔을 145 bp 마커 위로 약간 잘라냅니다. - 겔을 2 mL 수집 튜브에 보관된 DNA 브레이킹 튜브로 옮긴다. 20,000 x g에서 2분 간 회전합니다. RNase가 없는 물 300 μL을 추가하고 RT에서 밤새 로커에서 부드럽게 회전할 수 있습니다.
- DNA 침전을 수행하기 위해, 다음날 튜브의 내용물 5 μm 필터 튜브로 옮김을 옮김을 전달한다. 10s에 대한 600 x g에서 회전.
참고: 겔이 필터를 통과할 때 튜브가 10s 이상 회전하지 않도록 하십시오. - 글리코겐 2 μL, 3M NaOAc 30 μL, 0.1x 펠릿 페인트 2 μL, 용출 된 DNA에 100 % 에탄올 975 μL을 추가합니다. 4°C에서 17,000 x g에서 20분 간 회전합니다.
- 상급제를 버리고 75% 에탄올을 첨가하여 펠릿을 세척합니다. 4°C에서 17,000 x g에서 5분 간 회전합니다.
- 10 mM Tris-HCl pH 8.5의 12 μL로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
- 정제된 cDNA를 10x(1:10)로 희석하고 희석된 cDNA 1 μL을 사용하여 바이오 분석기에서 실행하여 라이브러리 품질 검사를 수행합니다.
- cDNA 제품 크기가 전기 전형체내의 작은 RNA(136-160 bp)의 범위에 해당하는지 확인합니다. 각 샘플에 대한 총 몰치를 계산합니다. Tris-HCl pH 8.5를 사용하여 각 샘플을 2 nM으로 정규화합니다.
- 정제된 cDNA를 변성하고 서열화한다.
- 단일 200 μL PCR 튜브에 각 2 nM 샘플의 동일한 볼륨을 혼합하여 라이브러리를 풀링합니다. 새로 준비된 0.2 N NaOH 의 10 μL을 풀린 라이브러리의 10 μL에 추가합니다.
- 소용돌이로 즉시 섞고, 280 x g에서 1분 동안 1분 간 회전합니다.
- 변성 라이브러리의 200 mM Tris-HCl pH 7 ~ 20 μL의 10 μL을 추가합니다. 소용돌이로 섞어서 1분 동안 280 x g으로 돌이면서 섞으세요.
- 라이브러리에 970 μL의 미리 냉각된 하이브리드화 버퍼를 추가하고 소용돌이로 잘 혼합합니다. 라이브러리는 20 pM의 농도입니다. 마침내 희석될 때까지 얼음을 유지하십시오.
참고: 최종 희석은 시퀀서에서 실행하기 직전에 수행됩니다. - 변성 라이브러리의 117 μL을 미리 냉각된 혼성화 버퍼의 1,183 μL에 추가합니다. 튜브와 펄스 원심분리기를 뒤집어 혼합합니다. 라이브러리의 최종 농도는 이제 1.8 pM입니다.
- 최종 라이브러리의 1.3 mL에 PhiX 의 1.3 μL을 추가합니다. 시퀀서에서 실행을 시작하려면 소프트웨어 인터페이스의 화면 단계를 따르고 읽기 유형(단일 읽기), 읽기 길이(각 읽기주기 수), 라이브러리 ID 를 비롯한 실행 매개 변수를 검토하고 시작을선택합니다.
5. 데이터 분석
- 시퀀서 실행의 끝에서, fastQ 파일로 결과 시퀀싱 데이터를 가져옵니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 결과 시퀀싱 데이터를 분석합니다.
- fastQ 툴킷 응용 프로그램을 열고 시작 버튼을 누릅니다.
- 소프트웨어의 샘플 목록에서 파일을 선택하고 데이터가 저장될 위치를 선택합니다.
- 잘린 각 시퀀스에 적용되는 문자열 이름을 추가합니다. 엄격성을 0.9로 유지합니다. 어댑터 시퀀스를 입력하여 각 시퀀스 샘플의 3' 끝에서 "TGGAATTCTCGGGCCAAGG"로 트리밍합니다. 필터링 읽기 탭을 확장하고 최소 읽기 길이를"5"로선택합니다. 승인 상자를 선택하고 계속 버튼을 눌러 트리밍을 시작합니다. 잘린 파일은 분석이 끝나면 프로젝트 폴더에 저장됩니다.
- 소프트웨어에서 작은 RNA v.1.0 응용 프로그램을 열고 시작 버튼을 누릅니다.
- 분석 후 파일을 저장하고 전송할 프로젝트를 선택합니다.
- 응용 프로그램에서 신규 miRs 및 차동 miRs 함수를 선택합니다. 차동 분석을 위해 그룹을"제어"및"테스트"로분리하고 해당 그룹에서 분석할 잘린 파일을 추가합니다.
- 해석을 시작할 시작 단추를 선택합니다. 분석 후 결과 파일을 다운로드합니다.
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Representative Results
라이브러리는 RNA 격리 후 제조되었고 품질 검사를 수행하였다. 미세 해부 조직 및 혈청 유래 EV로부터 분리된 RNA로부터 제조된 증폭된 cDNA 라이브러리에 대한 겔 정제는 도 1 및 도 2에나타내고 있다. 어댑터-결찰 miRNAs의 제품 크기는 각 샘플에 대해 약 136-160 bp에 해당합니다. 도 1A-B는 작은 RNA 라이브러리 준비를 위해 정밀하게 절제되어야 하는 겔의 범위를 나타내기 위해 표시된다. 도 2A-B는 미세 해부 조직 및 혈청 유래 EV에 대한 겔 전기 영동 및 전기 전형체를 나타낸다. 보충도 1은 전기영동기계로부터의 대표적인 결과와 몰도를 계산하는 방법을 나타낸다.
시퀀서에서 실행하기 전에 라이브러리 메트릭을 획득하는 단계가 수행되었습니다. 그림 3은 예상 클러스터 밀도, QC 점수, 클러스터 통과 필터 백분율 및 예상 수율 및 오류율을 보여주는 작은 RNA 시퀀싱 실행의 대표적인 메트릭을 보여 주다. 그림 3A 및 그림 3C는 서로 다른 사이클에 걸쳐 QC 점수에 대한 모든 실행 매개 변수 및 그래프가 있는 테이블을 보여 준다. 그림 3B, D는 서로 다른 사이클에 걸쳐 PhiX 정렬에 대한 오류 율의 그래픽 표현입니다. 제공된 데이터는 현장 분석 소프트웨어에서 제공한 것입니다.
시판되는 소프트웨어 어플리케이션(표오브 머티리얼)을사용하여 미세 해부 조직 및 혈청 유래 EV로부터 시퀀스된 샘플을 분석하였다. 시퀀스된 샘플을 FASTq 툴킷을 사용하여 어댑터 서열을 잘라낸 다음"소형 RNA v.1.0"응용 분야에 대한 분석을 수행하였다. 그림 3은 분석 시 결과 데이터를 보여줍니다. 표 1 및 표 2는 미세 해부조직 및 혈청 유래 EV 시퀀싱 실행으로부터의 총 판독을 보여준다. 도 3A 및 도 3B는 두 샘플 소스에 대한 작은 RNA 길이 분포를 나타낸다.
도 1: 작은 비코딩 RNA시퀀싱을 위한 라이브러리 준비. 폴리아크릴아미드 cDNA 겔은 정제된 혈청 유래 EV로부터(A)미세 해부된 FFPE 조직 RNA 및(B)RNA로부터 증폭된 라이브러리를 위한 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 작은 비코딩 RNA 시퀀싱에 대한 품질 검사. (A)미세 해부 FFPE 조직 및(B)혈청 유래 EV에 대한 정제된 cDNA 라이브러리용 겔 전기영동 및 일렉트로로그램에 대한 대표적인 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 작은 RNA 시퀀싱 실행에 대한 메트릭을 실행합니다. 실행 파라미터 % Q ≥30, 클러스터 밀도, 클러스터 전달 필터 %, 추정 수율, 및(A)미세 화 FFPE 조직 및(C)혈청 유래 EV에서 실행시퀀싱에 대한 Q 점수의 표 형 및 그래픽 표현. (B)미세 해부 된 FFPE 조직 및(D)혈청 유래 전기 자동차에서 시퀀싱 실행을위한 상이한 사이클에 걸쳐 PhiX 정렬에 대한 오차 율의 그래픽 표현. 오류 막대는 각 주기의 오류 율에 대한 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 작은 비코딩 RNA 시퀀싱 실행에서 예상되는 결과. 작은 RNA 는(A)미세 해부 된 FFPE 조직 및(B)혈청 유래 전기 전기 체에서 라이브러리에 대한 길이를 읽습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 샘플 | 총 시퀀싱 읽기 |
| 1 | 92,68,658 |
| 2 | 70,00,551 |
| 3 | 1,56,41,204 |
| 4 | 1,50,46,681 |
| 5 | 1,42,82,756 |
| 6 | 1,27,38,970 |
| 7 | 1,57,21,318 |
| 8 | 88,51,578 |
| 9 | 1,32,16,879 |
| 10 | 1,14,66,162 |
| 11 | 1,91,14,932 |
표 1: 미세 해부된 FFPE 조직으로부터의 작은 RNA 염기서열 분석에 대한 총 염기서열 분석. 분석 후 수득된 순량FFPE 샘플에 대한 작은 RNA에 해당하는 판독률.
| 샘플 | 총 시퀀싱 읽기 |
| 1 | 2,30,88,960 |
| 2 | 1,77,69,806 |
| 3 | 90,37,884 |
| 4 | 87,26,243 |
| 5 | 73,23,571 |
| 6 | 2,89,37,388 |
| 7 | 76,52,149 |
| 8 | 1,30,07,122 |
| 9 | 54,34,386 |
| 10 | 93,05,941 |
| 11 | 94,53,760 |
| 12 | 82,79,773 |
표 2: 정제된 혈청 유래 EV로부터의 작은 RNA 염기서열 분석에 대한 총 염기서열 분석. 분석 후 수득된 시퀀스 EV 샘플에 대한 작은 RNA에 해당하는 판독률입니다.
보조 그림 1: 작은 비코딩 RNA 시퀀싱에 대한 품질 검사. 표시된 샘플의 총 몰치를 나타내는 전기 영동 기계 실행의 대표적인 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서는, 우리는 격리된 RNA의 수율 그리고 질을 증가시키기 위하여 최적화된 키트를 사용하여 FFPE 조직 및 혈청 유래 EV에서 RNA를 격리하는 프로토콜을 기술합니다. 또한, 정제된 RNA는 작은 RNA 염기서열 분석용 cDNA 라이브러리를 생성하는데 사용되었다. 나열된 두 단계는실행(24)의최종 결과인 시퀀싱 판독의 품질 및 깊이를 결정하는 데 필수적이다. 따라서 이러한 중요한 단계를 최적화하는 것은 성공적인 시퀀싱 실행에 매우 중요합니다.
FFPE 유래 RNA의 격리에 있는 중요한 단계는 조직에서 가교된 포르말린의 제거를 허용하는 단백질분해제 K를 가진 소화입니다. 이 단계는 각각 약 16-18분 동안 55°C 및 80°C에서 샘플을 배양함으로써 최적화되었다. 이것은 260/280 비율에 있는 증가에 의해 고립된 RNA의 질에 있는 효과적인 증가 귀착되었습니다. 시퀀싱 읽기는 여러 샘플을 포함하는 런에 대해 종종 변수입니다. 따라서, 라이브러리 준비의 시작 시 RNA 입력의 양을 제어하면 라이브러리의 균일성을 허용한다. 정규화된 RNA를 사용하면 다양한 샘플에서 시퀀싱 런을 균일하게 평준화하는 데 도움이 됩니다. 라이브러리 준비에서 가장 중요한 단계는 증폭 된 어댑터 의 정제 cDNAs입니다. 마커의 바닥을 향한 약간의 편차가 어댑터 이이머의 오염을 초래하기 때문에 140 bp 마커 위의 겔을 신중하게 절제하는 것이 매우 중요합니다. 마지막으로, cDNA 라이브러리를 정규화하는 것은 시퀀싱 프로토콜의 가장 중요한 단계이며 전기 영동 기계로부터 계산된 정상성에 기초하여 정확하게 수행되어야 한다.
어댑터 이량체 오염의 경우, 하나는 TBE 젤에 정제 라이브러리를 다시 실행하고 원하는 제품을 재정화 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 추출에서 cDNA 라이브러리의 수율은 현저히 감소하며, 이는 샘플로부터의 판독 길이에 영향을 미칠 수 있다. 정제된 cDNA 라이브러리의 농도에 대한 추정치를 위해, 하나는 TBE 겔의 제품 강도에 기초하여 전기 동공 기계에서 실행하기 전에 샘플을 희석하고 다른 희석물(즉, 5x, 10x, 또는 25x)을 준비할 수 있다. 정제된 cDNA 라이브러리의 추정을 더욱 개선하기 위해 전기 동공 이외에 qPCR을 실행하면 템플릿 수준을 평가하고 보다 정확한 정규화를 할 수 있습니다.
초원심분리는 다른 소스에서 전기 EV를 분리하는 금 본위제이지만, 이러한 추출에서 입자의 낮은 수율은 종종 시작 물질이 제한되고 상당한 양의 전기 를 정화하는이 방법의 사용을 제한합니다. 입력 RNA는 다운스트림 애플리케이션에 필요합니다. 따라서, 총 엑소좀 절연 시약의 사용은 임상 샘플로부터혈청 및 플라즈마와 같은 제한된 공급원으로부터 EV 절연을 위한 훨씬 더 빠르고 높은 수율 방법을 제공한다.
전체적으로, 이 프로토콜은 정확하고 포괄적인 시퀀싱 판독을 얻기 위해 cDNA 라이브러리의 수율과 품질을 고려하면서 보다 시간 효율적인 방식으로 cDNA 라이브러리를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 암 바이오마커의 근원으로서 엑소좀의 잠재력을 감안할 때, 외아체 miRNA 함량의 차세대 염기서열 분석(NGS) 분석법은 이 분야의 연구에 도움이 될 것이다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미 육군 의학 연구 획득 활동 (USAMRAA)에 의해 지원된다 아이디어 개발 상을 통해 수상 번호. W81XWH-18-1-303 및 W81XWH-18-2-0013 및 추가 로 수상 번호. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, W81XWH-18-2-0018, 및 W81XWH-18-2-0019 전립선암 바이오리포시토리 네트워크(PCBN). 건강의 국가 학회에 있는 국립 암 학회에 의해 저자의 실험실에 자금 지원 (그랜트 번호 RO1CA177984) 또한 인정됩니다. Rajvir Dahiya는 재향 군인 업무부, BX004473의 수석 연구 경력 과학자이며 NIH-UO1CA199694 (RD)의 지원을 받습니다. 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국방부 또는 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 샌프란시스코 VAMC의 핵심 시설 책임자인 주디 시게나가(Judy Shigenaga)가 NextSeq 500 시퀀서에 도움을 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
