Summary
Terapi resistens utvecklas ofta hos patienter med avancerad prostatacancer, och i vissa fall, cancer fortskrider till en dödlig subtyp kallas neuroendokrina prostatacancer. Att bedöma de små icke-kodning RNA-medierade molekylära förändringar som underlättar denna övergång skulle möjliggöra bättre sjukdoms stratifiering och identifiering av kausala mekanismer som leder till utveckling av neuroendokrina prostatacancer.
Abstract
Ablation av androgenreceptorn (AR) signalering av androgen deprivation är målet för den första raden av behandling för prostatacancer som initialt resulterar i cancer regression. Emellertid, i ett stort antal fall, sjukdomen fortskrider till avancerad, kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), som har begränsade terapeutiska alternativ och är ofta aggressiv. Avlägsen metastaser observeras främst i detta skede av den aggressiva sjukdomen. CRPC behandlas av en andra generation av AR-utbildningshämmare som förbättrar överlevnaden initialt, följt av uppkomsten av behandlingsresistens. Neuroendokrina prostatacancer (NEPC) är en sällsynt variant av prostatacancer (PCa) som ofta utvecklas som ett resultat av terapi resistens via en transdifferentiering process som kallas neuroendokrina differentiering (NED), vari PCa celler genomgår en Lineage switch från adenocarcinom och Visa ökat uttryck för neuroendokrina (NE) härstamning markörer. Förutom de genomiska förändringar som driver utvecklingen och transdifferentieringen till NEPC, epigenetiska faktorer och mikromiljö signaler anses vara viktiga aktörer för att driva sjukdomsprogression. Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för att identifiera de epigenetiska drivrutinerna (dvs. små icke-kodning RNAs) som är förknippade med Advanced PCa. Med hjälp av renad mikroRNAs från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) metastatiska vävnader och motsvarande serumhärledda extracellulära blåsor (EVs), beskriver protokollet hur man förbereder bibliotek med lämplig kvalitetskontroll för sekvensering mikroRNAs från dessa provkällor. Isolera RNA från både FFPE och EVs är ofta utmanande eftersom de flesta av det är antingen försämrad eller är begränsad i kvantitet. Detta protokoll kommer att utveckla olika metoder för att optimera RNA-ingångar och cDNA-bibliotek för att ge mest specifika läsningar och data av hög kvalitet vid sekvensering.
Introduction
Prostatacancer drivs av androgener som agerar via AR-signalering. Därför, inriktning på AR vägen är stöttepelaren behandling för sjukdomen1. Emellertid, resistens uppstår ofta som ett resultat av riktade terapier och sjukdomen fortskrider till en avancerad metastaserad CRPC2. CRPC behandlas av andra generationen av ar-behandling som inkluderar enzalutamid och abirateron2,3 vilket förbättrar överlevnaden initialt. Men dödliga varianter som NEPC uppstår ofta i 25 − 30% av behandlade CRPC fall som har begränsade behandlingsalternativ, vilket leder till ökad dödlighet3. Nepc uppstår via en reversibel transdifferentieringsprocess som kallas ned, vari PCa celler genomgår en härstamnings växling från adenocarcinom och visar minskat uttryck av ar och ökat uttryck av ne Lineage markörer inklusive knäck 2 (ENO2), chromogranin a (chga), och synaptophysin (SYP)4. Med tanke på att dessa resistens varianter uppstår som ett resultat av terapeutiska interventioner, är det viktigt att dechiffrera vägar som leder till generering av denna dödliga, svårt att behandla form av PCa.
Genomik av nepc var nyligen dechiffreras i en uttömmande studie som gjorts av Beltran et al. där kopior antal förändringar, mutationer, enstaka nukleotid polymorfismer (SNP), och DNA-metylering från patient-derived metastatiska vävnader analyserades5. Trots betydande framsteg i förståelsen av genomik av denna aggressiva form av PCa, är lite känt om epigenetiska faktorer, inklusive den lilla icke-kodning RNAs (microRNAs) som är inblandade i övergången av CRPC-adenocarcinom till NEPC. Micrornas (mirnas) är 22 BP lång, dubbelsträngad rnas som agerar främst genom att undertrycka genuttryck efter transkriptionellt genom sekvens-specifika interaktioner med 3 '-oöversatta regioner (utrs) av besläktat mRNA mål6. Flera oncomirs och tumörsuppressorer har nu identifierats, och deras roll i regleringen av sjukdomsdebut och metastaser har studerats väl i olika cancerformer6,7. Dessa små icke-kodbara rnas fungerar ofta som mycket viktiga mål för att kontrollera sjukdoms dödligheten6,8,9. Nyare forskning har fokuserat på att förstå parakrin effekterna av mirnas i cancermetastaser via deras transport i EVS, såsom exosomes, att flödet i blodet och låta tumörceller att skicka dessa sekundära budbärare till metastaserande platser i en nukleasfri miljö10,11,12. EVs bär miRNAs från tumörcellerna för att överföra omformande effekterna från värdcellerna12. Identifiering av EVs som sekundära budbärare av tumörceller kan därför vara användbara i noninvasiv detektion av sjukdoms svårighetsgrad.
MiR-1246 är mycket uppreglerad i EVs från aggressiva PCa, och det indikerar sjukdomens svårighetsgrad13. Dessa EV-associerade miRNAs inte bara fungera som noninvasiv biomarkörer för sjukdomen, men också spela funktionellt viktiga roller i körningen tumorigenesis. Därför är det viktigt att förstå betydelsen av miRNA-repertoaren som är förknippad med resistenta former av PCa för att möjliggöra bättre identifiering av noninvasiv biomarkörer samt deras funktionella betydelse.
Tillkomsten av nästa generations sekvensering har erbjudit den mest omfattande plattform för att studera detaljerna i tumör landskap med förändringar i genomet såsom mutationer, kromosomala omlokaliseringar, kromothripsis, och metylering, som alla bidrar avsevärt till formen och arten av cancer14,15,16. Likaså, det är också ett viktigt verktyg för att förstå de stora epigenomiska förändringar som sker i en tumör cell och som ofta är viktiga aktörer i sjukdomens svårighetsgrad17. I syfte att förstå miRNA repertoar i samband med generering av NEPC, liten RNA sekvensering utfördes på FFPE metastaserad CRPC vävnader och deras motsvarande serum-derived EVs. RNA som härrör från någon av dessa två provkällor är (1) låg i avkastning och (2) av dålig kvalitet på grund av nedbrytningen som ofta sker på grund av formalin fixering och EV isolering. Dessutom är generering av cDNA-bibliotek en kritisk, men besvärlig, steg i en sekvenserings körning. Metoder för att isolera dessa RNAs och använda dem för att generera bibliotek för små RNA-sekvensering kräver därför optimering för att generera korrekta och tillförlitliga data.
Det finns flera metoder för att profilera miRNA uttryck i olika prover, inklusive RT-PCR, Microarrays, och in situ hybridisering (ISH). Ett protokoll som använder FFPE vävnad-härledda RNA för att utvärdera miRNA uttryck av RT-PCR och ISH publicerades nyligen18. Nyare teknik erbjuder mer uttömmande och omfattande plattformar för profilering miRNA uttryck i ett prov. NanoString nCounter erbjuder en känslig miRNA detekterings plattform19, men upptäckten är ofta begränsad av antalet mirnas som är tillgängliga i matrisen (~ 2 000). I ett sådant scenario, en känsligare och uttömmande plattform som nästa generations sekvensering erbjuder mycket bredare djup av miRNA identifiering och samtidig profilering i olika prover20. Metoden har använts för att bestämma Mirna-signaturer i urin eller plasma från PCa-patienter21,22,23. I den nuvarande artikeln presenteras ett protokoll för att använda en nästa generations sekvenserings plattform för att studera miRNA-profiler i samband med aggressiv CRPC med hjälp av FFPE-vävnader och serum-härledda EV-RNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i enlighet med de etiska riktlinjerna i USA common Rule och godkändes av den institutionella kommittén för mänsklig forskning.
1. microdissection
Anmärkning: FFPE metastaserad CRPC vävnader med adenocarcinom funktioner (CRPC-Adeno) eller NE differentiering (CRPC-NE) erhölls från prostata cancer Biorepository nätverk (PCBN). Tio-micron PCa sektioner på glas diabilder var förberedda för manuell microdissection som diskuterats tidigare18. För att kortfattat sammanfatta:
- Deparaffinize vävnaden sektioner genom blötläggning bilderna i xylen (2x, 10 min vardera). Sedan rehydrera sektionerna genom inkuberande bilderna för 5 min vardera i graderad etanol (100%, 95%, 90%, 80%, och 70%), följt av en destillerat vattentvätt och färgning med hematoxylin (30 s blöt).
- Efter hematoxylin färgning, tvätta vävnads sektionerna med vatten. Torka sedan av vävnads sektionerna genom att placera dem i graderad etanol (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (5 min vardera) följt av xylen (5 min).
- Analysera motsvarande hematoxylin och eosin (H & E) diabilder för att identifiera tumör områden (dvs., adenocarcinom eller NED) och markera dessa tumör områden och normala angränsande områden med hjälp av en styrelse-certifierad patolog. Med hjälp av dessa H & E bilder som färdplaner, markera hematoxylin-färgade vävnader som erhållits i ovanstående steg för att skilja mellan tumören och normala områden.
- Dissekera den markerade vävnaden glida försiktigt under Mikroskop med hjälp av en skalpell blad.
- Samla dissekerade vävnad från normala och cancerogena områden i separata rör med hjälp av elektrostatiskt laddade gel lastning pipettspetsar. Den laddade spetsen lockar dissekerade vävnad och möjliggör maximal vävnads återhämtning efter dissektion. När vävnaden fastnar på den laddade spetsen, skär spetsen i en tom 2 mL uppsamlings rör.
2. isolering av serum-derived EVs
Anmärkning: Frysta patientserumprov som samlats in från patienter med metastaserad CRPC med adenocarcinom (CRPC-Adeno) eller NE-differentiering (CRPC-NE) upphandlades från PCBN med hjälp av ett godkänt IRB-protokoll och lagrades vid-80 ° c före användningen. Serumprover samlades in från samma uppsättning patienter som de som användes för mikrodissekerade vävnader för att möjliggöra jämförelser mellan motsvarande vävnader och det serum som härrör från EVs. Ett kommersiellt tillgängligt serum-EV-isoleringsreagens användes för att samla in EVs.
- Tina frysta patientserumprov vid 4 ° c.
- Använd 110 μL upptinat serumprov och snurra på 2 000 x g i 30 min.
- Samla supernatanten för efterföljande EV/exosome isolering och kassera skräp pellets. Tillsätt 30 μL serum exosome-isoleringsreagens till supernatanten och inkubera vid 4 ° c i 30 minuter.
- Snurra på 10 000 x g i 10 min. samla EV-utarmat serum försiktigt utan att störa pelleten i en separat 1,5 ml tub och förvara vid-80 ° c för framtida analys, om det behövs.
- Omsuspendera EV-pelleten i 70 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) beredd i nukleasfritt vatten. Håll en alikvot för partikel spårningsanalys systemet för att bedöma kvaliteten och antalet partiklar. Förvara resten av provet vid-80 ° c tills ytterligare analys.
3. RNA-isolering från Mikrodissekerade prostata vävnader och EVs
Anmärkning: Totalt RNA isolerades från mikrodissekerade vävnader och renas EVs med ett kommersiellt tillgängligt Kit (tabell över material) enligt tillverkarens instruktioner med några ändringar. I följande avsnitt beskrivs kortfattat dessa procedurer med särskild tonvikt på de viktiga stegen:
- Isolera RNA från mikrodissekerade vävnader.
- Omsuspendera den mikrodissekerade FFPE-vävnaden i 150 μl proteinas K-buffert. Blanda genom vortexa och Pipettera ut den kvarvarande vävnaden från spetsen. Snurra på 11 000 x g i 1 min.
- Tillsätt 10 μL av proteinas K till pelleten. Vänta i 2 minuter tills pelleten blir vit. Pipettera upp och ner några gånger.
- Inkubera vid 56 ° c i 16 min. Vortex varje 3 min.
- Ta bort proverna och låt värmeblocket nå 80 ° c. Inkubera proverna på blocket för 16 min. Vortex var 3 min.
- Inkubera på isen i 3 min.
- Snurra på 20 000 x g i 15 min. överför supernatanten till en ny 2 ml tub.
- Tillsätt 16 μL DNase booster-buffert följt av 10 μL DNase I. Blanda genom att vända röret försiktigt och inkubera i rumstemperatur (RT) i 15 minuter.
- Tillsätt 320 μL av röda blodkroppar (RBC) lysis buffert. Blanda genom att invertera röret och tillsätt sedan 1 120 μL 100% etanol. Överför omedelbart på spinkolonner som förvaras vid 4 ° c. Snurra på 8 000 x g i 30 s.
- Tvätta kolumnerna 2x med tvättbuffert och snurra kolumnerna på 20 000 x g i 5 min för att ta bort kvarvarande tvättbuffert.
- Låt rotations kolonnen lufttorka i 2 − 3 min, och sedan eluera med 19 μL RNase-fritt vatten. Kvantitera det renade RNA på en spektrofotometer och normalisera provet till 40 ng/μL.
- RNA-isolering från serum-derived EVs.
- Isolera exosomalt RNA med hjälp av ett kit. Tillsätt 75 μL lyseringsbuffert A och 9,3 μL av lyseringsbufferten B till 50 μL av den renade EV-suspensionen.
Anmärkning: Fortsätt att blanda provet genom att invertera röret i ca 10 min för att möjliggöra fullständig lys av EVs. - Tillsätt 130 μL 100% etanol och blanda genast genom att invertera provet. Överför på en snurrande kolonn och snurra sedan på 3 300 x g i 1 min.
- Tvätta kolonnen 2x med tvättbufferten. Snurra kolonnen på 1 300 x g i 3 min för att helt ta bort tvättbufferten.
- Låt kolonnen lufttorka i 2 min. Tillsätt 18 μL elueringbuffert till kolonnen och låt den sitta i 2 min. snurra på 400 x g i 1 min följt av en andra spinn på 5 800 x g i 3 min.
- Upprepa steg 3.2.4 med den eluerade bufferten som ingår i satsen för att öka avkastningen av RNA från provet.
- Kvantifiera provet på en spektrofotometer och normalisera det till 40 ng/μL.
- Isolera exosomalt RNA med hjälp av ett kit. Tillsätt 75 μL lyseringsbuffert A och 9,3 μL av lyseringsbufferten B till 50 μL av den renade EV-suspensionen.
4. biblioteks förberedelse för små RNA-sekvensering
Anmärkning: Ett litet RNA Library prep Kit (tabell över material) användes för att generera cDNA-bibliotek från isolerade RNA-prover. Stegen för att skapa bibliotek, rena och kvalitet kontrollera dem innan du kör på en sequencer är avgörande för alla sekvenserings protokoll som de så småningom avgöra kvaliteten på utdata från en körning. Fortsätt därför noggrant med varje steg. Riktlinjerna från tillverkaren föreslår att du använder ett minimum av 50 ng av RNA. Med tanke på den dåliga kvaliteten och låga mängder av totalt RNA som vanligtvis erhålls från dessa två provkällor, är detta protokoll optimerat för RNA-koncentrationer så låga som 100 ng. Protokollet nedan är ett exempel på ett bibliotek.
- Generera adapterligated cDNA.
- Använd 5 μL av ett normaliserat RNA-prov (40 ng/μL). Tillsätt 1 μL 3-adapter. Värm upp termocykleren till 70 ° c innan proverna inkuberas. Inkubera i 2 min. omedelbart överföra proverna på isen innan du går vidare till nästa steg.
- I ett separat rör, blanda 2 μL ligeringsbuffert, 1 μL Rnashämmare, och 1 μL T4 RNA Ligase 2, en deletion Mutant. Blanda genom att Pipettera upp och ner och tillsätt 4 μL av denna blandning till röret med RNA/3-adaptern.
- Överför till den termiska cycleren som har förvärmd till 28 ° c och inkubera i 1 h.
- Tillsätt 1 μL stopplösning samtidigt som proverna hålls på värmeblocket. Inkubera vid 28 ° c i ytterligare 15 minuter.
- Ta bort rören och håll på isen omedelbart efter detta steg.
- Tillsätt 1 μL 5-adapter i ett separat rör.
- Överför till en värmecyklare som förvärmd till 70 ° c och inkubera i 2 minuter.
- Placera omedelbart röret på isen för att förhindra återglödgning av adaptorerna.
- Tillsätt 1 μl 10 mm ATP till röret av denaturerat 5 ' adaptern. Blanda genom att Pipettera och tillsätt 1 μL T4 RNA Ligase till blandningen. Blanda genom att Pipettera och tillsätt 3 μL av denna blandning till röret som innehåller 3 ' adapter-ligated RNA. Överföring på den termiska cykleren som förvärmd till 28 ° c och inkubera i 1 h.
- Omedelbart övergå till is och antingen gå vidare med proverna eller förvara vid-20 ° c för framtida bruk.
- För att utföra RT-PCR, Använd 6 μL av varje adapter-ligated RNA och tillsätt 1 μL RNA RT primer till den. Till termocyklern som förvärmd till 70 ° c. Inkubera i 2 minuter.
- Blanda 2 μL 5x strandbuffert i ett separat rör, 0,5 μL 12,5 mM dNTPs, 1 μL 100 mM DTT, 1 μL RNase-hämmare och 1 μL omvänt transkriptas. Tillsätt 5,5 μL av denna blandning till det adapterligerade RNA och överför till den termiska cyklern som förvärmd till 50 ° c. Inkubera i 1 h.
- Överför adaptern-ligated cDNA omedelbart till is.
- Blanda 25 μL PCR-blandning i ett separat rör, 2 μL RNA-PCR-primer, 2 μL RNA PCR-primerindex och 8,5 μL av RNase-fritt vatten. Tillsätt 37,5 μL av denna blandning till 12,5 μL av adaptern-ligated cDNA. Till termocyklern som förvärmd till 98 ° c. Program mera termocykleren enligt tillverkarens anvisningar med cykel numret modifierat till 15 i stället för 11.
Anmärkning: Sekvenser av alla primers som används är listade under tabell över material. - Förvara proverna vid 4 ° c efter avslutad. Fortsätt med dem eller förvara vid-80 ° c för framtida bruk.
- Rena och utföra kvalitetskontroll för det ligerade cDNA.
Anmärkning: Amplified cDNA var gel-renas genom att följa tillverkarens protokoll med undantag för några ändringar för att förbättra kvaliteten och avkastningen av renade cDNA prover som förklaras nedan.- Använd 6% TBE polyakrylamidgeler för att rena det amplifierade cDNA. Späd högupplöst stege (HRL) och anpassad RNA-stege (CRL) med samma volymer av DNA-lastfärg.
- Tillsätt 10 μL DNA-lastfärg till varje cDNA-prov. Kör 30 μL av varje prov i två separata köer som gränsar till varandra med CRL och HRL i mellanrummet mellan de två olika proverna.
- Kör gelen i 1x TBE buffert vid 145 V i ca 30 − 40 min.
Anmärkning: Håll koll på den undre blå framsidan av laddnings färgen. Stoppa elektrofores när den närmar sig botten av gel. - Överför gelen i 1x TBE-buffert med Ethidium bromid (EtBr) vid 0,5 μg EtBr/1 mL 1x TBE.
Försiktighet: Etbr är en känd cancerframkallande och varje steg härifrån tills excision från gelen bör utföras med extrem försiktighet. - Visualisera gelen i en transilluminator och skär gelen exakt mellan 145 BP och 160 BP markör.
Anmärkning: Adapterdimers kör mycket nära 145 BP markör. Skär därför gelen något över 145 BP-markören för att undvika kontaminering med adaptern dimer. - Överför gelen till DNA-brytande rör som förvaras i 2 mL uppsamlings rör. Snurra på 20 000 x g i 2 min. Tillsätt 300 μl av RNase-fritt vatten och låt det rotera försiktigt på en rocker över natten vid RT.
- För att utföra DNA-nederbörden, på följande dag överföra innehållet i röret till 5 μm filter rör. Snurra på 600 x g i 10 s.
Anmärkning: Låt inte rören snurra längre än 10 s när gelen passerar genom filtret. - Tillsätt 2 μL glykogen, 30 μL 3 M NaOAc, 2 μL 0,1 x pelletfärg och 975 μL 100% etanol till det eluerade DNA. Snurra på 17 000 x g vid 4 ° c i 20 min.
- Kassera supernatanten och tillsätt 75% etanol för att tvätta pelleten. Snurra på 17 000 x g vid 4 ° c i 5 min. Kassera supernatanten och inkubera rören vid 37 ° c för att helt avdunlla etanol.
- Omsuspendera pelleten med 12 μL 10 mM Tris-HCl pH 8,5.
- Utföra en biblioteks kvalitetskontroll genom att späda ut det renade cDNA med 10X (1:10) och använda 1 μL utspädd cDNA för att köras på en bio-analysator.
- Se till att cDNA-produktens storlek motsvarar utbudet av små RNA (136 − 160 BP) i elektropherogrammet. Beräkna den totala Molarity för varje prov. Normalisera varje prov till 2 nM med hjälp av Tris-HCl pH 8,5.
- Och sekvensera det renade cDNA.
- Pool biblioteken genom att blanda lika volymer av varje 2 nM prov i ett enda 200 μL PCR-rör. Tillsätt 10 μL nypreparerade 0,2 N NaOH till 10 μL poolbibliotek.
- Blanda omedelbart genom vortexing, och snurra på 280 x g för 1 min. Inkubera vid RT i 5 min.
- Tillsätt 10 μL 200 mM Tris-HCl pH 7 till 20 μL av det denaturerade biblioteket. Blanda genom vortexa och snurra på 280 x g i 1 min.
- Tillsätt 970 μL prekyld hybridiseringsbuffert till biblioteket och blanda väl genom vortexing. Biblioteket är i en koncentration av 20 pM. Håll på is tills det är äntligen utspädd.
Anmärkning: Den slutliga utspädningen görs precis innan den körs på Sequencer. - Tillsätt 117 μL av det denaturerade biblioteket till 1 183 μL prekyld hybridiseringsbuffert. Blanda genom att invertera röret och pulcentrifugen. Den slutliga koncentrationen av biblioteket är nu 1,8 pM.
- Tillsätt 1,3 μL PhiX till 1,3 mL bibliotek. Om du vill initiera en körning på en sequencer följer du stegen på skärmen i programvarugränssnittet, granskar körnings parametrarna, inklusive Läs typ (enkel läsning), Läs längd (antal cykler för varje läsning), biblioteks-ID och välj Start.
5. analys av data
- I slutet av sekvenseraren kör, Hämta resulterande sekvenserings data som fastQ-filer. Använd lämplig programvara för att analysera resulterande sekvenserings data.
- Öppna fastQ Toolkit-programmet och tryck på Launch -knappen.
- Markera filerna i listan med exempel i programvaran och välj var data ska sparas.
- Lägg till ett sträng namn som gäller för varje trimmad sekvens. Behåll stränghet till 0,9. Mata in adaptersekvensen för att trimma som "tggaattctcgggtgccaagg" från 3 ' slutet av varje sekvenserade prov. Expandera fliken Läs filtrering och välj en minsta Läs längd på "5". Välj bekräftelse rutan och tryck på knappen Fortsätt för att börja trimma. De trimmade filerna sparas i projektmappen vid slutet av analysen.
- Öppna det lilla RNA v. 1.0 -programmet på programvaran och tryck på Start -knappen.
- Välj det projekt där filerna ska sparas och skickas efter analysen.
- Välj funktionen roman Mirs och differentiell Mirs i programmet. Segregera grupperna som "kontroll" och "test" för differentiell analys och lägga till trimmade filer som ska analyseras i sina respektive grupper.
- Välj Start knappen för att initiera analysen. Efter analyserna, Ladda ner de resulterande filerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biblioteket utarbetades efter RNA-isolering och en kvalitetskontroll utfördes. Gel rening för det förstärkta cDNA-biblioteket som framställs av RNA som isolerats från mikrodissekerade vävnader och serum-derived EVs visas i figur 1 och figur 2. Den produkt storlek för adapter-ligated miRNAs motsvarade cirka 136 − 160 BP för varje prov. Figur 1A-B är markerade för att visa det sortiment av gelen som ska vara exakt uppretad för små RNA-biblioteksberedning. Figur 2A-B visar gel elektrofores och elektroftalogram för mikrodissekerade vävnader och serum-derived EVS. Kompletterande figur 1 visar ett representativt resultat från elektrofores maskinen och metoden för att beräkna Molarity.
Steg för att hämta bibliotekets mått innan du kör på en sequencer utfördes. Figur 3 visar representativa mått från en liten RNA sekvensering kör demonstrera den förväntade kluster TÄTHETEN, QC-poäng, kluster som passerar filter procent och beräknad avkastning och felfrekvenser. Figur 3A och figur 3C visar tabellerna med alla Run-parametrar och diagram för QC-poäng över olika cykler. Figur 3B, D är grafiska representationer av felfrekvenser för phix-justering över olika cykler. De tillhandahållna uppgifterna är från analysprogram varan på plats.
En kommersiellt tillgänglig programvara (tabell över material) användes för att analysera sekvenserade prover från microdissekerade vävnad och serum-derived EVS. De sekvenserade proverna klipptes av adaptersekvenserna med hjälp av FASTq Toolkit följt av analys på applikationen "Small RNA v. 1.0". Figur 3 visar de resulterande data vid analys. Tabell 1 och tabell 2 visar totala läsningar från microdissekerade vävnad och serum-derived EVS sekvensering Run. Figur 3A och figur 3B visar den lilla RNA-längdfördelningen för de två Provkällorna.
Figur 1: biblioteks förberedelse för sekvensering av små icke-KODNINGRNA. CDNA-gel för polyakrylamid för de förstärkta biblioteken från (a) mikrodissekerat FFPE-vävnadrna och (B) RNA från renad serum-derived EVS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kvalitetskontroll för sekvensering av små icke-kodningrna. Representativ bild för gelelektrofores och elektrofoniogram för renat cDNA-bibliotek för (a) mikrodissekerat FFPE-vävnad och (B) serumframställda EVS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: kör mått för små RNA sekvenserings körning. Tabell-och grafisk representation av kör parametrar% Q ≥ 30, kluster täthet, kluster som skickar filter%, beräknad avkastning och Q-Poäng för sekvensering kör från (a) microdissekerade FFPE-vävnad och (C) serumframställda EVS. Grafisk representation av felfrekvenser för PhiX-justering över olika cykler för sekvensering kör från (B) mikrodissekerade FFPE-vävnad och (D) serum-derived EVS. Felstaplarna representerar standardavvikelsen för felfrekvenserna för varje cykel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: förväntat utfall från en liten icke-kodning RNA sekvenserings körning. Små RNA-läslängder för bibliotek från (a) mikrodissekerade FFPE-vävnad och (B) serumframställda EVS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Totalt antal sekvenserings läsningar |
| 1 | 92, 68658 |
| 2 | 70, 00551 |
| 3 | 1, 56, 41204 |
| 4 | 1, 50, 46681 |
| 5 | 1, 42, 82756 |
| 6 | 1, 27, 38970 |
| 7 | 1, 57, 21318 |
| 8 | 88, 51578 |
| 9 | 1, 32, 16879 |
| 10 | 1, 14, 66162 |
| 11 | 1, 91, 14932 |
Tabell 1: totalt sekvensering läsningar för en liten RNA-sekvensering kör från microdissected FFPE vävnad. Procentandel läsningar som motsvarar små rnas för sekvenserade FFPE-prover som erhölls efter analys.
| Prov | Totalt antal sekvenserings läsningar |
| 1 | 2, 30, 88960 |
| 2 | 1, 77, 69806 |
| 3 | 90, 37884 |
| 4 | 87, 26243 |
| 5 | 73, 23571 |
| 6 | 2, 89, 37388 |
| 7 | 76, 52149 |
| 8 | 1, 30, 07122 |
| 9 | 54, 34386 |
| 10 | 93, 05941 |
| 11 | 94, 53760 |
| 12 | 82, 79773 |
Tabell 2: totalt sekvenserings läsningar för en liten RNA-sekvensering kör från renat serum från EVs. Procentandel läsningar som motsvarar små RNAs för sekvenserade EV-prov erhållna efter analys.
Kompletterande figur 1: kvalitetskontroll för sekvensering av små icke-KODNINGRNA. Representativa resultat från en elektrofores maskin körning som visar den totala molaritet av det angivna provet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att isolera RNA från FFPE-vävnader och serumbaserade EVs med hjälp av satser som optimerats för att öka avkastningen och kvaliteten på isolerade RNAs. Vidare användes de renade RNAs-biblioteken för att generera cDNA-bibliotek för små RNA-sekvensering. Båda de listade stegen är viktiga för att bestämma kvaliteten och djupet av sekvensering läsningar som är slutresultatet från körningen24. Därför är det viktigt att optimera dessa viktiga steg för en lyckad sekvensering körning.
Ett viktigt steg i isoleringen av FFPE-härledda RNA är matsmältningen med proteinas K som möjliggör avlägsnande av tvärbunden formalin från vävnaden. Detta steg har optimerats genom inkuberande av provet vid 55 ° c och 80 ° c i ca 16 − 18 min vardera. Detta resulterade i en effektiv ökning av kvaliteten på isolerat RNA genom en ökning av förhållandet 260/280. Sekvenserings läsningar är ofta variabla för en körning som innehåller flera exempel. Därför, kontrollera mängden RNA-ingångar i början av biblioteket förberedelse möjliggör enhetlighet i biblioteket. Använda normaliserade RNA hjälper i utjämning en sekvensering köras jämnt över olika prover. Det mest kritiska steget i biblioteket förberedelse är rening av förstärkt adapter och ligaturer cdnas. Det är mycket viktigt att noggrant punktskatter gelerna ovanför 140 BP markör, eftersom en liten avvikelse mot botten av markören leder till kontaminering av adaptern dimers. Slutligen, normalisering av cDNA biblioteket är det viktigaste steget i sekvenserings protokollet och bör göras noggrant baserat på Beräknad normalitet från elektrofores maskin.
I händelse av en adapter dimer förorening, kan man köra det renade biblioteket på en TBE gel och repurify önskad produkt. Utbytet av cDNA-biblioteket i en sådan extraktion minskar dock signifikant, vilket kan påverka läslängd från provet. För en uppskattning av koncentrationen av det renade cDNA-biblioteket kan man späda ut proverna innan de körs på elektrofores-maskinen baserat på produktens intensitet i TBE Gels och förbereda olika utspädningar (d.v.s. 5x, 10X eller 25x). För att ytterligare förbättra uppskattningen av de renade cDNA-biblioteken, kör en qPCR utöver elektrofores hjälper till att utvärdera mallnivåer och möjliggör mer exakt normalisering.
Även om ultracentrifugering är den gyllene standarden för isolering av EVS från olika källor, begränsar en lägre avkastning av partiklarna från en sådan extraktion ofta användningen av denna metod vid rening av EVS där utgångsmaterialet är begränsat och en betydande mängd behövs för nedströmsapplikationer. Således ger användning av den totala exosome isoleringsreagens en mycket snabbare och högre avkastning metod för EV isolering från begränsade källor som serum och plasma från kliniska prover.
I detta protokoll beskrivs metoderna för generering av cDNA-bibliotek på ett mer effektivt sätt samtidigt som man beaktar avkastningen och kvaliteten på cDNA-biblioteken för att få noggranna och omfattande sekvenserings läsningar. Med tanke på exosomernas potential som källa till cancer biomarkörer, kommer denna metod för nästa generations sekvensering (NGS) analyser av exosomalt miRNA-innehåll att vara till hjälp för forskning inom området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den amerikanska armén medicinsk forskning förvärvsverksamhet (USAMRAA) genom idéutveckling Award underAward No. W81XWH-18-1-303 och W81XWH-18-2-0013 och dessutom genom tilldelning nr. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, och W81XWH-18-2-0019 prostata cancer Biorepository nätverk (PCBN). Finansieringsstöd till författar labbet av National Cancer Institute vid National Institutes of Health (bidrags nummer RO1CA177984) erkänns också. Rajvir Dahiya är en senior forskarkarriär forskare vid Institutionen för Veterans Affairs, BX004473 och finansieras av NIH-UO1CA199694 (RD). Yttranden, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är de av författaren och är inte nödvändigtvis godkändes av Department of Defense eller US Army. Vi är tacksamma till Judy Shigenaga, chef för Core facility på San Francisco VAMC, för hennes hjälp med NextSeq 500 Sequencer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
