Summary
Tedavi direnci genellikle ileri prostat kanseri olan hastalarda gelişir, ve bazı durumlarda, kanser nöroendokrin prostat kanseri denilen ölümcül bir alt tip ilerler. Bu geçişi kolaylaştıran küçük kodlamayan RNA aracılı moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi, daha iyi hastalık tabakalaşmasına ve nöroendokrin prostat kanserigelişimine yol açan nedensel mekanizmaların tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.
Abstract
Androjen reseptörünün ablasyon (AR) androjen yoksunluğu ile sinyal başlangıçta kanser regresyon ile sonuçlanan prostat kanseri için tedavinin ilk satırının hedefidir. Ancak, vakaların önemli sayıda, hastalık ileri ilerlemiş ilerler, hadım dirençli prostat kanseri (CRPC), hangi sınırlı tedavi seçenekleri vardır ve genellikle agresif. Uzak metastaz çoğunlukla agresif hastalığın bu aşamasında gözlenir. CRPC başlangıçta sağkalımı artırmak AR yol inhibitörleri ikinci nesil tarafından tedavi edilir, tedavi direnci ortaya çıkması takip. Nöroendokrin prostat kanseri (NEPC), nöroendokrin farklılaşma (NED) olarak bilinen bir transfarklısiasyon süreci ile tedavi direnci nin bir sonucu olarak sıklıkla gelişen prostat kanserinin (PCa) nadir bir çeşididir ve pca hücreleri bir soy değişimine uğrar. adenokarsinomlardan ve nöroendokrin (NE) soy belirteçlerinin artmış ekspresyonu gösterir. NEPC'ye ilerleme ve transdifferentiasyonu yönlendiren genomik değişikliklere ek olarak, epigenetik faktörler ve mikroçevresel ipuçları hastalığın ilerlemesini niçin yönlendiren temel oyuncular olarak kabul edilir. Bu el yazması, gelişmiş PCa ile ilişkili epigenetik sürücüleri (yani, kodlamayan küçük RNA'ları) tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) metastatik dokulardan ve buna karşılık gelen serum kaynaklı ekstrasellüler veziküllerden (EVs) saflaştırılmış mikroRNA'lar kullanan protokol, sıralama için uygun kalite kontrolüne sahip kütüphanelerin nasıl hazırlanacağını açıklar. bu örnek kaynaklardan mikroRNA'lar. RNA'yı hem FFPE hem de EVs'den yalıtmak genellikle zordur, çünkü çoğu bozulmuş tur veya miktar olarak sınırlıdır. Bu protokol, sıralama da en özel okumave yüksek kaliteli verileri elde etmek için RNA girişlerini ve cDNA kitaplıklarını optimize etmek için farklı yöntemler üzerinde ayrıntılı olacaktır.
Introduction
Prostat kanseri AR sinyalizasyon yoluyla hareket androjenler tarafından tahrik edilir. Bu nedenle, AR yolu hedefleme hastalık için dayanak tedavi1. Ancak, direnç genellikle hedeflenen tedaviler in bir sonucu olarak ortaya çıkar ve hastalık ileri metastatik CRPC2ilerler. CRPC başlangıçta sağkalımı artırır enzalutamide ve abiraterone2,3 içeren AR tedavisinin ikinci nesil tarafından tedavi edilir. Ancak, NEPC gibi öldürücü varyantlar genellikle tedavi seçenekleri sınırlı olan tedavi edilen CRPC olgularının %25−30'unda ortaya çıkar ve mortalite artışına yol açar3. NEPC NED olarak bilinen bir geri dönüşümlü transfarklısyon süreci ile ortaya çıkar, PCa hücreleri adenokarsinomlardan bir soy anahtarı geçmesi ve AR azalmış ekspresyonu ve enolase 2 dahil OLMAK ÜZERE NE soy belirteçleri artan ekspresyonu göstermek 2 (ENO2), kromogranin A (CHGA), ve sinaptophysin (SYP)4. Bu direnç varyantları terapötik müdahaleler sonucunda ortaya çıkar göz önüne alındığında, bu ölümcül nesil yol açan yolları deşifre etmek esastır, PCa formu tedavi etmek zor.
NEPC'nin genomik leri yakın zamanda Beltran ve arkadaşları tarafından yapılan kapsamlı bir çalışmada deşifre edilmiştir ve kopya numarası değişiklikleri, mutasyonlar, tek nükleotit polimorfizmleri (SNP) ve hasta kaynaklı metastatik dokulardan DNA metilasyon 5 analizedilmiştir. PCa'nın bu agresif formunun genomiklerinin anlaşılmasında ki önemli ilerlemeye rağmen, CRPC-adenokarsinomunun NEPC'ye geçişinde rol oynayan küçük kodlamayan RNA'lar (mikroRNA'lar) dahil olmak üzere epigenetik faktörler hakkında çok az şey bilinmektedir. MicroRNA'lar (miRNA'lar) 22 bp uzunluğunda, çift iplikli RNA'lardır ve öncelikle gen ekspresyonunu transkripsiyon eliyle baskılayarak 3'-çevrilmemiş bölgelerle (UTR) diziye özgü etkileşimler yaparak hareket eden mRNA hedefleri6'dır. Birkaç oncomiRs ve tümör baskılayıcılar şimdi tespit edilmiştir, ve hastalık başlangıçlı ve metastaz düzenleyen rollerini de farklı kanserlerde çalışılmıştır6,7. Bu küçük kodlamaz RNA'lar genellikle hastalık mortalite6,8,9kontrolünde çok önemli hedefler olarak hizmet vermektedir. Daha yeni araştırmalar, kanser metastazında miRNA'ların parakrin etkilerini anlamak üzerine odaklanmıştır, örneğin ekzozomlar, kan dolaşımında akan ve tümör hücrelerinin bu ikincil habercileri çekirdeksiz bir ortamda metastatik yerlere göndermesine izin vermek10,11,12. EVs ev sahibi hücrelerden dönüştürücü etkileri aktarmak için tümör hücrelerinden miRNA'lar taşır12. Bu nedenle, tümör hücrelerinin ikincil habercileri olarak EVs belirlenmesi hastalığın şiddetinin noninvaziv tespitiyararlı olabilir.
MiR-1246 agresif PCa'lardan evs son derece upregulated, ve hastalığın şiddetini gösterir13. Bu EV ilişkili miRNA'lar sadece hastalığın noninvaziv biyobelirteçleri olarak hizmet değil, aynı zamanda tümörigenez sürüş işlevsel olarak önemli roller oynamaktadır. Bu nedenle, noninvaziv biyobelirteçlerin daha iyi tanımlanmasına ve işlevsel önemine olanak sağlamak için PCa'nın dirençli formları ile ilişkili miRNA repertinin önemini anlamak önemlidir.
Yeni nesil sıralama gelişiyle mutasyonlar, kromozomal tehsülasyonlar, kromotomal tehkisler ve metilasyon gibi genom değişiklikleri içeren tümör manzara ayrıntılarını incelemek için en kapsamlı platform sundu, bunların hepsi kanser in formu ve doğasına önemli ölçüde katkıda14,15,16. Aynı şekilde, aynı zamanda bir tümör hücresinde meydana gelen ve genellikle hastalık şiddeti önemli oyuncular olan büyük epigenomik değişiklikleri anlamak için önemli bir araçtır17. NEPC üretimi ile ilişkili miRNA repertuarının anlaşılması amacıyla FFPE metastatik CRPC dokuları ve buna karşılık gelen serum kaynaklı EV'lerde küçük RNA dizilimi yapılmıştır. Bu iki örnek kaynaktan birinden elde edilen RNA verimi (1) düşük ve (2) formalin fiksasyonu ve EV izolasyonu nedeniyle sıklıkla oluşan bozulmanedeniyle kötü kalitededir. Ayrıca, cDNA kitaplıkları oluşturmak kritik, ama hantal, bir sıralama çalışmasının adımıdır. Bu nedenle, bu RNA'ları yalıtmak ve bunları küçük RNA sıralamaiçin kitaplıkoluşturmak için kullanmak için yöntemler doğru ve güvenilir veri oluşturmak için optimizasyon gerektirir.
RT-PCR, mikrodiziler ve yerinde hibridizasyon (ISH) dahil olmak üzere farklı örneklerde miRNA ekspresyonu profillemek için çeşitli yöntemler vardır. RT-PCR ve ISH tarafından miRNA ekspresyonu değerlendirmek için FFPE doku kaynaklı RNA kullanarak bir protokol son zamanlarda18yayınlandı . Daha yeni teknolojiler, bir örnekte miRNA ifadesini profilleme için daha kapsamlı ve kapsamlı platformlar sunar. NanoString nCounter hassas bir miRNA algılama platformu19sunar, ancak algılama genellikle dizi (~ 2.000) mevcuttur miRNA sayısı ile sınırlıdır. Böyle bir senaryoda, yeni nesil sıralama gibi daha hassas ve ayrıntılı bir platform miRNA tanımlama ve farklı örneklerde eşzamanlı profilleme çok daha geniş bir derinlik sunuyor20. Yöntem PCa hastalarından idrar veya plazma da miRNA izlerini belirlemek için kullanılmıştır21,22,23. Mevcut makalede, ffpe dokuları ve serum kaynaklı EV RNA'lar kullanarak agresif CRPC ile ilişkili miRNA profillerini incelemek için yeni nesil bir sıralama platformu kullanmak üzere bir protokol sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, ABD Ortak Kuralı'nın etik kurallarına uygun olarak yürütülmüş ve Kurumsal İnsan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Mikrodiseksiyon
NOT: Adenokarsinom (CRPC-Adeno) veya NE farklılaşması (CRPC-NE) olan FFPE metastatik CRPC dokuları Prostat Kanseri Biyorepozitory Network'ten (PCBN) alındı. Cam slaytlar üzerinde on mikron PCa bölümleri daha önce18tartışıldığı gibi manuel mikrodiseksiyon için hazırlanmıştır. Kısaca özetlemek gerekirse:
- Slaytları ksilene (her biri 2x, 10 dk) ıslatarak doku bölümlerini deparafinize edin. Daha sonra dereceli etanolde 5 dakika boyunca slaytları kuluçkaya yatırarak bölümleri yeniden sulandırın (%100, %95, %90, %80 ve %70), ardından damıtılmış su yıkama ve hematoksilin (30 s Soak) ile boyama.
- Hematoksilin boyama sını takiben doku kesitlerini su ile yıkayın. Daha sonra dereceli etanol yerleştirerek doku bölümlerini dehydrate (70%, 80%90, 95%, 100%) (5 dk her) ksilene (5 dk) takip.
- Tümör bölgelerini (yani adenokarsinomlar veya NED) tanımlamak için ilgili hematoksilin ve eozin (H&E) slaytlarını analiz edin ve bu tümör bölgelerini ve normal komşu bölgeleri tahta sertifikalı bir patolog yardımıyla işaretleyin. Bu H&E slaytlarını yol haritası olarak kullanarak, tümör ile normal bölgeleri ayırt etmek için yukarıdaki adımda elde edilen hematoksilin lekeli dokuları işaretleyin.
- Neşter bıçağı kullanarak işaretli doku kaydırağı dikkatle mikroskop altında inceleyin.
- Elektrostatik yüklü jel yükleme pipet uçları kullanarak ayrı tüplerde normal ve kanserli alanlardan parçalanmış doku toplamak. Şarj lı uç, parçalanmış dokuyu çeker ve diseksiyon dan sonra maksimum doku iyileşmesine olanak tanır. Doku yüklü uca yapışır sonra, boş bir 2 mL toplama tüpü içine ucu kesti.
2. Serum türetilmiş EV'lerin izole
NOT: Adenokarsinom (CRPC-adeno) veya NE farklılaşması (CRPC-NE) olan metastatik CRPC'li hastalardan alınan dondurulmuş hasta serum örnekleri, onaylı bir IRB protokolü kullanılarak PCBN'den temin edildi ve kullanılmadan önce -80 °C'de saklandı. Serum örnekleri, mikrodissected dokular için kullanılan larla aynı hasta kümesinden, ilgili dokular ile serum kaynaklı EVs arasında karşılaştırma sağlamak amacıyla toplanmıştır. Evv'leri toplamak için ticari olarak kullanılabilen bir serum EV izolasyon reaktifi kullanıldı.
- Dondurulmuş hasta serum örneklerini 4 °C'de eritin.
- 110 μL çözülmüş serum numunesi kullanın ve 30 dakika boyunca 2.000 x g'de döndürün.
- Sonraki EV / ekzozom izolasyon için supernatant toplamak ve enkaz pelet atın. Supernatant'a 30 μL serum ekzozom izolasyon reaktifi ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- 10 dakika boyunca 10.000 x g.'de spin verin. EV'in tüketen serumu ayrı bir 1,5 mL tüpte peleti rahatsız etmeden dikkatlice toplayın ve gerekirse ileride analiz için -80 °C'de saklayın.
- Çekirdeksiz suda hazırlanan 70 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde EV peletyeniden askıya. Parçacıkların kalitesini ve sayısını değerlendirmek için parçacık izleme analiz sistemi için bir aliquot tutun. Numunenin geri kalanını bir sonraki analize kadar -80 °C'de saklayın.
3. Mikrodissected Prostat Doku ve Evlerinden RNA İzolasyon
NOT: Toplam RNA mikrodissected dokular ve saflaştırılmış EV'ler birkaç değişiklik ile üreticinin talimatları na göre ticari olarak kullanılabilir bir kit(Malzeme Tablosu)kullanılarak izole edildi. Aşağıdaki bölümlerde bu yordamlar önemli adımlara özel olarak açıklayınız:
- RNA'yı mikrodiskoplu dokulardan ayırın.
- 150 μL proteinaz K tamponunda mikrodiskoplu FFPE dokusunu yeniden askıya alın. Uçtan kalan dokuyu girdap ve pipet le karıştırın. 1 dk için 11.000 x g spin.
- Pelete 10 μL proteinaz K ekleyin. Pelet beyaz dönene kadar 2 dk bekleyin. Pipet birkaç kez yukarı ve aşağı.
- 56 °C'de 16 dk. Girdap her 3 dakikada bir kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri çıkarın ve ısı bloğunun 80 °C'ye ulaşmasına izin verin. Bloktaki numuneleri her 3 dakikada bir 16 dk. Girdap'a inküler.
- 3 dakika buz üzerinde kuluçka.
- 15 dk. Süpernatant'ı yeni bir 2 mL tüpe aktarın.
- 16 μL DNase güçlendirici tampon ekleyin ve ardından 10 μL DNase I. Mix tüpü hafifçe ters çevirerek ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kırmızı kan hücresi (RBC) lisis tampon 320 μL ekleyin. Tüpü ters çevirerek karıştırın ve sonra 1.120 μL% 100 etanol ekleyin. 4 °C'de depolanan spin kolonlar üzerinde hemen aktarın. 30 s için 8.000 x g spin.
- Kolonları 2kat yıkayın tamponuyla yıkayın ve artık yıkama tamponunu çıkarmak için 20.000 x g'de sütunları 5 dk çevirin.
- Spin sütununun 2−3 dakika kurumasını bekleyin, ardından 19 μL RNase içermeyen su ile erteleyin. Saflaştırılmış RNA'yı bir spektrofotometrede ölçün ve numuneyi 40 ng/μL'ye normalleştirin.
- Serum kaynaklı EV'lerden RNA izolasyonu.
- Bir kit kullanarak ekzozomal RNA'yı izole edin. Saflaştırılmış EV süspansiyonunun 75 μL'lik lysis tampon A ve 9.3 μL'lik lysis tamponU B'yi 50 μL'ye ekleyin.
NOT: EVs tam lysis sağlamak için yaklaşık 10 dakika için tüp ters bırakarak örnek karıştırma tutun. - 130 μL %100 etanol ekleyin ve numuneyi ters çevirerek hemen karıştırın. Bir spin sütununa aktarın ve sonra 1 dk için 3.300 x g'de döndürün.
- Sütun2x'i yıkama tamponuyla yıkayın. Yıkama tamponu tamamen kaldırmak için 3 dk için 1.300 x g sütun spin.
- Sütunun 2 dk kurumasını bekleyin. Kolona 18 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 2 dk. Spin'de 400 x g'da 1 dk'da oturun ve ardından 3 dk için 5.800 x g'da ikinci bir dönüş yapalım.
- RNA'nın numuneden verimini artırmak için kitte bulunan eluted arabellek ile 3.2.4 adımını tekrarlayın.
- Numuneyi bir spektrofotometre üzerinde ölçün ve 40 ng/μL'ye normalleştirin.
- Bir kit kullanarak ekzozomal RNA'yı izole edin. Saflaştırılmış EV süspansiyonunun 75 μL'lik lysis tampon A ve 9.3 μL'lik lysis tamponU B'yi 50 μL'ye ekleyin.
4. Küçük RNA Sıralamaiçin Kütüphane Hazırlama
NOT: İzole Edilmiş RNA örneklerinden cDNA kitaplıkları oluşturmak için küçük bir RNA kitaplık hazırlık kiti(Malzeme Tablosu)kullanılmıştır. Kitaplıklar oluşturmak, arındırmak ve kalite kontrol etmek için adımlar bir sıralayıcı üzerinde çalışan önce herhangi bir sıralama protokolü için çok önemlidir onlar sonunda bir çalışma çıktı verilerinin kalitesini belirlemek gibi. Bu nedenle, her adımile dikkatle devam edin. Üreticiden gelen kurallar, en az 50 ng RNA kullanmanızı önerir. Genellikle bu iki örnek kaynaktan elde edilen toplam RNA'nın kalitesiz liği ve düşük miktarları göz önüne alındığında, bu protokol 100 ng'ye kadar düşük RNA konsantrasyonları için optimize edilebiyir. Aşağıdaki protokol bir kitaplığın bir örneği içindir.
- Adaptör-ligated cDNA oluşturun.
- Normalleştirilmiş (40 ng/μL) RNA numunesinin 5 μL'sini kullanın. 1 μL 3' adaptör ekleyin. Numuneleri kuluçkaya yatırmadan önce termal döngüciyi 70 °C'ye önceden ısıtın. 2 dk. Bir sonraki adıma geçmeden önce numuneleri buz üzerinde hemen aktarın.
- Ayrı bir tüpte, 2 μL ligasyon tamponu, 1 μL RNase inhibitörü ve 1 μL T4 RNA Ligase 2, bir silme mutantı karıştırın. Yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırın ve RNA/3' adaptörü ile bu karışımın 4 μL'sini tüpe ekleyin.
- Önceden ısıtılmış olan termal döngüye 28 °C'ye ve 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri termal blokta tutarken 1 μL stop çözeltisi ekleyin. 28 °C'de 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.
- Tüpleri çıkarın ve bu adımdan hemen sonra buz üzerinde tutun.
- Ayrı bir tüpe 1 μL 5' adaptör ekleyin.
- Önceden ısıtılmış bir ısı döngüsüne 70 °C'ye ve 2 dakika kuluçkaya yatırın.
- Adaptörlerin yeniden annealing önlemek için hemen buz üzerine tüp yerleştirin.
- Denatüre 5' adaptör tüpüne 1 μL 10 mM ATP ekleyin. Pipetleme ile karıştırın ve karışıma 1 μL T4 RNA ligase ekleyin. Pipetleme ile karıştırın ve 3' adaptör-ligated RNA içeren tüp için bu karışımın 3 μL ekleyin. Önceden ısıtılmış olan termal döngücün 28 °C'ye ve 1 saat kuluçkaya yatırılmasına yol aç.
- Hemen buza aktarın ve numunelerle daha fazla ilerleyin veya ileride kullanım için -20 °C'de saklayın.
- RT-PCR gerçekleştirmek için, her adaptörle bağlı RNA'dan 6 μL kullanın ve 1 μL RNA RT astar ekleyin. Önceden ısıtılmış olan ısı lösi kvericibine 70 °C'ye aktarın. 2 dk kuluçka.
- Ayrı bir tüpte 2 μL 5x iplikçik tamponu, 0,5 μL 12,5 mM dNTPs, 1 00 mM DTT 1L, 1 μL RNase inhibitörü ve 1 μL ters transkriptaz karıştırın. Adaptörle bağlanan RNA'ya bu karışımın 5,5°L'sini ekleyin ve önceden ısıtılmış olan termal döngüye 50°C'ye aktarın. 1 saat kuluçka.
- Adaptörle bağlanan cDNA'yı hemen buza aktarın.
- Ayrı bir tüpte 25 μL PCR karışımı, 2 μL RNA PCR astar, 2 μL RNA PCR astar indeksi ve 8,5 μL RNase içermeyen suyu karıştırın. Adaptör-liglenmiş cDNA 12,5 μL bu karışımın 37,5 μL ekleyin. Önceden ısıtılmış olan termal döngüye 98 °C'ye aktarın. Termal çevrimciyi üreticiprotokolünde önerildiği gibi, çevrim numarası 11 yerine 15 olarak değiştirildiğinde programla.
NOT: Kullanılan tüm astarların dizileri Tablo Malzemelertablosu altında listelenmiştir. - Numuneleri tamamlandıktan sonra 4 °C'de saklayın. Onlarla devam edin veya ileride kullanmak için -80 °C'de saklayın.
- ArındırMak ve ligated cDNA için kalite kontrol yapmak.
NOT: Güçlendirilmiş cDNA, aşağıda açıklandığı gibi saflaştırılmış cDNA örneklerinin kalitesini ve verimini artırmak için birkaç değişiklik dışında üreticinin protokolüne uygun olarak jel-saflaştırılmıştı.- Güçlendirilmiş cDNA arındırmak için% 6 TBE poliakrilamid jelleri kullanın. Yüksek çözünürlüklü merdiveni (HRL) ve özel RNA merdiveni (CRL) eşit hacimlerde DNA yükleme boyası ile seyreltin.
- Her cDNA örneğine 10 μL DNA yükleme boyası ekleyin. Her numunenin 30 μL'sini iki farklı örnek arasındaki ara boşlukta CRL ve HRL ile birbirine bitişik iki ayrı şeritte çalıştırın.
- Jeli 1x TBE tamponunda yaklaşık 30−40 dk çalıştırın.
NOT: Yükleme boyasının alt mavi ön kısmını takip edin. Jelin dibine yaklaştığında elektroforezi durdurun. - Jeli Ethidium Brommide (EtBr) ile 1x TBE tamponuna 0,5 μg EtBr/1 mL 1x TBE'de aktarın.
DİkKAT: EtBr bilinen bir karsinojendir ve jelden eksizyonun anına kadar buradan her adım çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. - Jeli bir transilluminator'da görselleştirin ve jeli tam olarak 145 bp ile 160 bp marker arasında kesin olarak kesin olarak kesin.
NOT: Adaptör dimer'leri 145 bp işaretleyiciye çok yakın çalışır. Bu nedenle, adaptör dimer ile kontaminasyonu önlemek için jeli 145 bp markerin biraz üzerinde kesin. - Jeli 2 mL toplama tüpünde tutulan DNA kırma tüplerine aktarın. 2 dk. 2 dakika boyunca 20.000 x g'de spin. 300 μL RNase içermeyen su ekleyin ve rt'de bir rocker üzerinde yavaşça dönmesini bekleyin.
- DNA çökeltisi gerçekleştirmek için, ertesi gün tüpün içeriğini 5 μm filtre tüpüne aktarın. 10 s için 600 x g spin.
NOT: Jel filtreden geçerken tüplerin 10 s'den uzun süre dönmesine izin vermeyin. - Eluted DNA'ya 2°L glikojen, 30 μL 3 M NaOAc, 2 0,1x pelet boya ve 975°L %100 etanol ekleyin. 20 dakika boyunca 4°C'de 17.000 x g'de döndürün.
- Supernatant atın ve pelet yıkamak için% 75 etanol ekleyin. 17.000 x g 4 °C'de 5 dakika boyunca döndü.
- 10 mM Tris-HCl pH 8.5 ile 12 μL pelet resuspend.
- Saflaştırılmış cDNA'yı 10x (1:10) ile seyrelterek ve biyo-analizörde çalıştırmak için 1 μL seyreltilmiş cDNA kullanarak kütüphane kalite kontrolü yapın.
- CDNA ürün boyutunun elektroferogramdaki küçük RNA (136−160 bp) aralığına karşılık gelen denemin olun. Her örnek için toplam azı lılığını hesaplayın. Tris-HCl pH 8.5 kullanarak her numuneyi 2 nM'ye normalleştirin.
- Arındırılmış cDNA'yı denatüre ve sırala.
- Kütüphaneleri, her 2 nM numunenin eşit hacimlerini tek bir 200 μL PCR tüpte karıştırarak havuzlayın. 10 μL'lik taze hazırlanmış 0,2 N NaOH'u 10 μL havuzlu kütüphaneye ekleyin.
- Girdap ile hemen karıştırın ve 1 dk. RT'de 5 dk için 280 x g'de döndürün.
- Denatüre kitaplığın 10 μL 200 mM Tris-HCl pH 7 ila 20 μL ekleyin. Girdap ile karıştırın ve 1 dakika için 280 x g spin.
- Kütüphaneye 970 μL önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponu ekleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın. Kütüphane 20 pM konsantrasyonu bulunmaktadır. Sonunda seyreltilene kadar buz üzerinde tutun.
NOT: Son seyreltme sequencer üzerinde çalışan hemen önce yapılır. - 1.183 μL önceden soğutulmuş hibridizasyon arabelleği için denatüre kitaplık 117 μL ekleyin. Tüp ve darbe santrifüj ters karıştırArak. Kütüphanenin son konsantrasyonu şu anda 1.8 pM'dir.
- Son kitaplığın 1,3 mL'sine 1,3 μL PhiX ekleyin. Bir sıralayıcıda çalıştırmayı başlatmak için, yazılım arabirimindeki ekrandaki adımları izleyin, okuma türü (tek okuma), okuma uzunluğu (her okuma için döngü sayısı), kitaplık kimliği ve Başlat'ıseçin dahil olmak üzere çalışma parametrelerini gözden geçirin.
5. Veri Analizi
- Sıralayıcı çalışmasının sonunda, elde edilen sıralama verilerini fastQ dosyaları olarak elde edin. Elde edilen sıralama verilerini çözümlemek için uygun yazılımı kullanın.
- fastQ araç seti uygulamasını açın ve Başlat düğmesine basın.
- Yazılımdaki örnekler listesindeki dosyaları seçin ve verilerin nerede kaydedileceğini seçin.
- Kesilmiş her dizi için geçerli olan bir dize adı ekleyin. Sıkılığı 0.9'a tutun. Adaptör sırasını, her dizili örneğin 3' ucundan "TGGAATCTCGGGTGCCAAGG" olarak kırpmak için giriş leyin. Okuma Filtreleme sekmesini genişletin ve "5" en az okundu uzunluğunu seçin. Onay kutusunu seçin ve kırpmabaşlatmak için Devam düğmesine basın. Kırpılan dosyalar, çözümlemenin sonunda proje klasörüne kaydedilir.
- Yazılımdaki küçük RNA v.1.0 uygulamasını açın ve Başlat düğmesine basın.
- Dosyaların kaydedilip analizden sonra gönderilecek projeyi seçin.
- Uygulamada Roman miR'leri ve Diferansiyel miR işlevini seçin. Grupları diferansiyel analiz için "Control" ve "Test" olarak ayırın ve kırpılan dosyaları kendi gruplarında analiz etmek üzere ekleyin.
- Çözümlemesi başlatmak için Başlat düğmesini seçin. Analizleri takiben, ortaya çıkan dosyaları indirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kütüphane RNA izolasyonundan sonra hazırlandı ve kalite kontrolü yapıldı. Mikrodiskoplu dokulardan ve serum türetilmiş EV'lerden izole edilen RNA'dan hazırlanan güçlendirilmiş cDNA kütüphanesi için jel arınması Şekil 1 ve Şekil 2'degösterilmiştir. Adaptör-ligated miRNA'ların ürün boyutu her numune için yaklaşık 136−160 bp'ye karşılık gelmektedir. Şekil 1A-B, küçük RNA kitaplığı hazırlığı için hassas bir şekilde çıkarılmalıdır jel aralığı göstermek için işaretlenir. Şekil 2A-B, mikrodissected doku ve serum kaynaklı EV'ler için jel elektroforezi ve elektroferogramları göstermektedir. Ek Şekil 1 elektroforez makinesi ve mularite hesaplamak için yöntem temsili bir sonucu gösterir.
Bir sıralayıcı üzerinde çalışmadan önce kitaplık ölçümlerini elde etmek için adımlar gerçekleştirildi. Şekil 3, beklenen küme yoğunluğunu, QC puanını, küme geçme filtre yüzdesini ve tahmini verim ve hata oranlarını gösteren küçük bir RNA sıralama çalışmasındaki temsili ölçümleri gösterir. Şekil 3A ve Şekil 3C, farklı döngüler boyunca QC skoru için tüm çalışma parametrelerini ve grafiği olan tabloları gösterir. Şekil 3B,D, PhiX hizalaması için farklı döngüler üzerinde hata oranlarının grafik gösterimleridir. Sağlanan veriler yerinde analiz yazılımından elde edilir.
Mikrodissected doku ve serum kaynaklı EVs dizili örnekleri analiz etmek için ticari olarak kullanılabilir bir yazılım uygulaması(Tablo Malzemeler)kullanılmıştır. Sıralı örnekler, FASTq araç seti kullanılarak adaptör dizilerinden kesilerek "Small RNA v.1.0" uygulaması üzerinde analiz yapıldı. Şekil 3 analiz üzerine elde edilen verileri gösterir. Tablo 1 ve Tablo 2, mikrodissected doku ve serum kaynaklı EVs sıralama çalışmalarından toplam okuma gösterir. Şekil 3A ve Şekil 3B, iki örnek kaynağın küçük RNA uzunluk dağılımını göstermektedir.
Şekil 1: Küçük kodlamayan RNA dizilimi için kütüphane hazırlığı. (A) mikrodissected FFPE doku RNA ve (B) Arınmış serum kaynaklı EVs gelen amplifiye kütüphaneler için poliakrilamid cDNA jel. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Küçük kodlamayan RNA dizilimi için kalite kontrolü. (A) mikrodissected FFPE dokusu ve (B) serum kaynaklı EVs için saflaştırılmış cDNA kütüphanesi için jel elektroforez ve elektrofromogram için temsili görüntü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Küçük RNA sıralama çalışması için ölçümleri çalıştırın. Çalışma parametrelerinin % Q ≥30, küme yoğunluğu, küme geçme filtresi %, tahmini verim ve (A) mikrodissected FFPE dokusu ndan ve(C)serumdan türetilen EV'lerden sekerlik için Q Skoru'nun tabular ve grafik gösterimleri. (B) mikrodissected FFPE doku ve (D) serum kaynaklı EVs'den sekanslama için phiX hizalaması için hata oranlarının farklı döngüler üzerinde grafik gösterimi. Hata çubukları, her döngü için hata oranları için standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kodlamayan küçük bir RNA sıralama çalışmasından beklenen sonuçlar. Küçük RNA kütüphane uzunluklarını (A) Mikrodissected FFPE dokusundan ve (B)serum dan türetilmiş EV'lerden okur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek | Toplam sıralama okuma |
| 1 | 92,68,658 |
| 2 | 70,00,551 |
| 3 | 1,56,41,204 |
| 4 | 1,50,46,681 |
| 5 | 1,42,82,756 |
| 6 | 1,27,38,970 |
| 7 | 1,57,21,318 |
| 8 | 88,51,578 |
| 9 | 1,32,16,879 |
| 10 | 1,14,66,162 |
| 11 | 1,91,14,932 |
Tablo 1: Mikrodissecte FFPE dokusundan küçük bir RNA sıralama çalışması için toplam sıralama okumaları. Analizden sonra elde edilen sıralı FFPE örnekleri için küçük RNA'lara karşılık gelen okuma yüzdesi.
| Örnek | Toplam sıralama okuma |
| 1 | 2,30,88,960 |
| 2 | 1,77,69,806 |
| 3 | 90,37,884 |
| 4 | 87,26,243 |
| 5 | 73,23,571 |
| 6 | 2,89,37,388 |
| 7 | 76,52,149 |
| 8 | 1,30,07,122 |
| 9 | 54,34,386 |
| 10 | 93,05,941 |
| 11 | 94,53,760 |
| 12 | 82,79,773 |
Tablo 2: Saflaştırılmış serum türemiş EV'lerden küçük bir RNA sıralama çalışması için toplam sıralama okumaları. Analizden sonra elde edilen sıralı EV örnekleri için küçük RNA'lara karşılık gelen okuma yüzdesi.
Ek Şekil 1: Küçük kodlamayan RNA dizilimi için kalite kontrolü. Belirtilen numunenin toplam azılılığını gösteren bir elektroforez makinesi nin temsilcisi sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, izole RNA'ların verimini ve kalitesini artırmak için optimize edilmiş kitleri kullanarak RNA'yı FFPE dokularından ve serum kaynaklı EV'lerden izole eden bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, saflaştırılmış RNA'lar küçük RNA dizilimi için cDNA kitaplıkları oluşturmak için kullanılmıştır. Listelenen adımların her ikisi de,24'ünnihai sonucu olan sıralama okumalarının kalitesini ve derinliğini belirlemede gereklidir. Bu nedenle, bu önemli adımları optimize etmek başarılı bir sıralama çalışması için çok önemlidir.
FFPE türetilmiş RNA izolasyonönemli bir adım doku çapraz bağlı formalin çıkarılması için izin proteinaz K ile sindirim. Bu adım, numunenin her biri yaklaşık 16−18 dakika boyunca 55 °C ve 80 °C'de kuluçkaya yatırılarak optimize edilmiştir. Bu da 260/280 oranında bir artışla izole RNA kalitesinde etkili bir artışile sonuçlandı. Sıralama okumaları genellikle birden çok örnek içeren bir çalışma için değişkendir. Bu nedenle, kitaplık hazırlama başında RNA girdilerinin miktarını kontrol kütüphanenin tekdüzelik sağlar. Normalleştirilmiş RNA kullanmak, farklı numuneler arasında düzgün bir şekilde çalışan bir sıralamayı eşit olarak seviyelandırmaya yardımcı olur. Kütüphane hazırlığındaki en kritik adım, güçlendirilmiş adaptör ligated cDNA'ların saflaştırılmasıdır. 140 bp markerin üzerindeki jelleri dikkatlice çıkarmak çok önemlidir, çünkü markerın altına doğru hafif bir sapma adaptör dimerlerinin kirlenmesine yol açar. Son olarak, cDNA kitaplığının normalleştirilmesi sıralama protokolünün en önemli adımıdır ve elektroforez makinesinden hesaplanan normalliğe göre doğru bir şekilde yapılmalıdır.
Adaptör dimer kontaminasyonu durumunda, bir TBE jel üzerinde saflaştırılmış kütüphane yeniden ve istenilen ürünü repurify olabilir. Ancak, böyle bir çıkarma cDNA kitaplığı verimi önemli ölçüde azalır, bu da örnekten okuma uzunluğunu etkileyebilir. Saflaştırılmış cDNA kitaplığı konsantrasyonu hakkında bir tahmin için, bir TBE jelleri ürün yoğunluğuna göre elektroforez makinesi üzerinde çalışan önce örnekleri seyreltmek ve farklı seyreltme hazırlamak (yani, 5x, 10x, veya 25x). Saflaştırılmış cDNA kitaplıklarının tahminini daha da iyileştirmek için, elektroforeze ek olarak bir qPCR çalıştırmak şablon düzeylerinin değerlendirilmesine yardımcı olur ve daha doğru normalleştirme sağlar.
Ultracentrifugation farklı kaynaklardan EVs izolasyonu için altın standart olmasına rağmen, böyle bir çıkarma parçacıkların daha düşük verim genellikle başlangıç malzemesi sınırlı ve önemli miktarda evs arındırıcı bu yöntemin kullanımını sınırlar giriş RNA downstream uygulamaları için gereklidir. Böylece, total ekzozom izolasyon reaktifinin kullanımı, klinik örneklerden serum ve plazma gibi sınırlı kaynaklardan EV izolasyonu için çok daha hızlı ve daha yüksek verim yöntemi sağlar.
Bu protokol, cDNA kitaplıklarının doğru ve kapsamlı sıralama okumalarını elde etmek için verim ve kaliteyi göz önünde bulundurarak, cDNA kitaplıklarını daha etkin bir şekilde oluşturma yöntemlerini ayrıntılı olarak ortaya konur. Kanser biyobelirteçlerinin kaynağı olarak ekzozomların potansiyeli göz önüne alındığında, ekzozomal miRNA içeriğinin yeni nesil dizilemesi (NGS) analizleri için bu yöntem, bu alanda araştırma için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan etmek için çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Edinme Aktivitesi (USAMRAA) tarafından Fikir Geliştirme Ödülü altında Ödül No ile desteklenir. W81XWH-18-1-303 ve W81XWH-18-2-0013 ve ayrıca Ödül no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 ve W81XWH-18-2-0019 Prostat Kanseri Biyorepozitory Network (PCBN). Ulusal Sağlık Enstitüleri (Grant Number RO1CA177984) ulusal kanser enstitüsü tarafından yazarların laboratuvarına finansman desteği de kabul edilmektedir. Rajvir Dahiya, BX004473 Gazi İşleri Bölümü'nde Kıdemli Araştırma Kariyer BilimCisi dir ve NIH-UO1199694 (RD) tarafından finanse edilmektedir. Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve öneriler yazarın görüşleridir ve Mutlaka Savunma Bakanlığı veya ABD Ordusu tarafından onaylanmaz. Biz Judy Shigenaga, San Francisco VAMC de çekirdek tesis müdürü, NextSeq 500 sequencer ile ona yardım için müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
