Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

Published: December 7, 2019 doi: 10.3791/60550

Summary

Het doel van dit protocol is om twee verschillende celtypen te fuseren om hybride cellen te maken. Fluorescentiemicroscopie analyse van gesmolten cellen wordt gebruikt om de cel van oorsprong van cellulaire organellen te volgen. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe cellulaire structuur en functie reageren op perturbatie door celfusie.

Abstract

Het leven is ruimtelijk gepartitioneerd binnen lipide membranen om de geïsoleerde vorming van verschillende moleculaire toestanden binnen cellen en organellen mogelijk te maken. Celfusie is de fusie van twee of meer cellen om een enkele cel te vormen. Hier bieden we een protocol voor celfusie van twee verschillende celtypen. Gesmolten hybride cellen worden verrijkt door flow cytometrie-gebaseerde sortering, gevolgd door fluorescentiemicroscopie van hybride celstructuur en-functie. Fluorescerend gelabelde eiwitten gegenereerd door genoom bewerking worden in gesmolten cellen afgebeeld, waardoor cellulaire structuren kunnen worden geïdentificeerd op basis van fluorescentie emissie en waarnaar wordt verwezen terug naar het celtype van oorsprong. Deze robuuste en algemene methode kan worden toegepast op verschillende celtypen of organellen van belang, om de cellulaire structuur en functie over een scala van fundamentele biologische vragen te begrijpen.

Introduction

Homeostatisch onderhoud van cellulaire structuur is essentieel voor het leven. Cellen hebben karakteristieke morfologieën, sub-cellulaire organel getallen, en interne biochemische samenstelling. Inzicht in hoe deze fundamentele eigenschappen worden gegenereerd en hoe ze gaan mis tijdens de ziekte vereist laboratorium gereedschap om hen te perturb.

Celfusie is het samenvoegen van twee of meer afzonderlijke cellen. Celfusie kan cruciaal zijn geweest voor de opkomst van eukaryotische leven1. In het menselijk lichaam is celfusie relatief zeldzaam, die optreedt tijdens beperkte ontwikkelingsomstandigheden en weefsel typen, zoals tijdens de bevruchting of de vorming van spieren, botten en de placenta2. Dit protocol beschrijft de inductie van celcelfusie in weefselkweek cellijnen met differentieel fluorescently gelabelde organellen, als een instrument om de mechanismen te begrijpen die de celstructuur en-functie beheersen.

In vitro geïnduceerde celcelfusie staat centraal in de productie van monoklonale antilichamen3, een belangrijk hulpmiddel voor biologisch onderzoek en ziekte behandeling. Cell Fusion is ook gebruikt om te vragen veel verschillende fundamentele cel biologische vragen over celcyclus dominantie4, aneuploïdie5,6, cellulaire herprogrammering7,8, de reparatie van beschadigde neuronen9, virale proliferatie10, apoptosis11, tumorvorming12, cytoskelet Dynamics13, en membraan fusie14,15. Laboratorium gebaseerde methoden voor het opwekken van celcelfusie16,17,18,19 induceren lipide membraan coalescentie door de fysieke samenvoeging van twee bilayers in één. Celfusie kan worden geïnduceerd door elektriciteit18, virale gebaseerdemethoden 17, thermsmonic verwarming20, transgen expressie19, en chemicaliën met inbegrip van polyethyleenglycol (PEG)16,21,22.

Centrosomes zijn microtubulus organiserende centra die cellulaire vorm, beweeglijkheid, polarisatie en divisie23beheersen. Centrosomale wortels zijn vezelachtige structuren die zich uitstrekken van nucleotiderende met het eiwit rootletin24 (gecodeerd door het gen crocc). We hebben onlangs gebruikt cel-cel fusie om te begrijpen hoe centrosoom positie en het aantal varieert binnen heterokaryons ten opzichte van ouderlijke cellen24. De beweegreden achter het gebruik van deze methode is om de cel van oorsprong van wortels binnen een heterokaryon te volgen na fusie van differentieel fluorescendig gelabelde ouderlijke cellen, en dus voorbeeld organel fusie en splijting. De fluorescently gelabelde eiwitten rootletin-meGFP of rootletin-mScarlet-ik zijn gemaakt door genoom Editing in afzonderlijke cellijnen die vervolgens worden gesmolten door PEG-gemedieerde celfusie. We beschrijven het gebruik van celkleurstoffen (tabel met materialen) om gesmolten cellen te identificeren door Flowcytometrie en daaropvolgende fluorescentiemicroscopie-identificatie van centroeen cel van oorsprong en morfologie (Figuur 1). Deze aanpak is een robuuste en unieke methode om te bestuderen hoe belangrijke veranderingen in cellulaire toestand, met inbegrip van organel nummer afbreuk aan op cel homeostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. differentiële fluorescerende Celetikettering

  1. Gentagging met CRISPR Cas9
    1. Gebruik CRISPR Cas9 genoom Editing te labelen rootletin (of andere genen van belang) met de fluorescerende eiwitten meGFP of mScarlet-I in menselijke kanker cellijnen.
      Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor genoom bewerking worden elders behandeld24,25,26.
  2. Fluorescerende kleurstof etikettering
    1. Groeien Cal51 menselijke kankercellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), L-glutamine, en 100 μg/mL penicillaire/streptomycine bij 37 °C en 5% CO2 in een bevoficeerde incubator.
      Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat cellen regelmatig worden gecontroleerd op de afwezigheid van mycoplasma besmetting, en voor de identiteit van de cellijn. Gebruik geen cellen die op grote schaal zijn doorgangen in de cultuur (> 15 passages). Cellen moeten gezond zijn en exponentieel groeien. Vermijd onderconfluentie of overconfluentie.
    2. Zaai elk celtype (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I en niet-gecodeerde Cal51 cellen van de ouders), zodat ~ 6 x 106 cellen de volgende dag voor elk monster aanwezig zijn, met een confluentie van 70 − 90%.
      Opmerking: Dit is ongeveer één T75 weefselkweek kolf of 1 10 cm schaal per celtype. De niet-gelabelde cellen van ouderlijk toezicht zijn vereist als negatieve controle verderop in het protocol. Dit protocol maakt de productie van ~ 20.000 gesmolten cellen mogelijk, maar dit aantal kan worden verhoogd door het uitbreiden van het protocol met een verhoogd aantal batches.
    3. De volgende dag, prewarme DMEM, trypsine en 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen.
    4. Was rootletin-meGFP en rootletin-mScarlet-I cellen 2x in PBS door het gieten of aspireren off medium en vervangen door 10 mL PBS.
    5. Label Cal51 rootletin-meGFP cellen door toevoeging van 500 nM Violet Cell Dye (tabel van de materialen) in PBS gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT).
    6. Label Cal51 rootletin-mScarlet-I cellen door toevoeging van 200 nM Far Red Cell Dye (tabel van de materialen) in PBS gedurende 1 minuut bij RT.
      Opmerking: Houd voorbeelden afgeschermd van licht, waar mogelijk na fluorescerende kleuring, om foto bleken van fluorescentie te voorkomen.
    7. Stop de kleurstof etiketteringreacties door 10 mL DMEM gedurende 5 minuten toe te voegen.
    8. Verwijder niet-gelabelde ouderlijke Cal51 cellen uit de incubator (vanaf stap 1.2.2).
      Opmerking: Deze cellen zullen later worden gebruikt als niet-gelabelde negatieve besturingselementen (stap 3.3.2).
    9. Was alle cellen één keer door groeimedium te gieten en te vervangen door 10 mL PBS.
    10. Giet PBS af en inbroed gedurende 5 minuten bij kweek condities met 1 mL voorverwarmde 1x trypsine.
    11. Breng cellen over naar een plastic conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 5 minuten.
    12. Verwijder en gooi trypsine voorzichtig uit de celpellet met een pipet.
    13. Breng de Violet en Far Red gelabelde celpellets voorzichtig in 1 mL PBS.
    14. Breng de ouder (niet-fluorescerende) celpellet voorzichtig in 1 mL DMEM aan en keer terug naar de incubator.
      Opmerking: Dit voorbeeld zal geen celcelfusie ondergaan, maar zal later worden gebruikt tijdens de Flowcytometrie.

2. Celcelfusie

  1. Meng 3 x 106 Violet gelabelde cellen met 3 x 106 ver rood gelabelde cellen in een buis van 15 ml door zachtjes met een pipet van 1 ml samen 0,5 ml van elk celtype te pipetteren.
  2. Centrifugeer de overgebleven niet-gemengde cellen van stap 2,1 bij 1.000 x g gedurende 5 minuten, giet vervolgens PBS af, hervat de pellet in 1 ml DMEM en keer terug naar de incubator.
    Opmerking: Deze overgebleven niet-gemengde enkelvoudige gelabelde monsters zullen later worden gebruikt als negatieve en compensatie controles in sectie 3 van het protocol.
  3. Centrifugeer de gemengde cellen van stap 2,1 bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en zuig voorzichtig PBS op met een pipet van 1 ml.
  4. Voeg 0,7 ml 50% 1450 Peg-oplossing op druppelsgewijs wijze toe aan de celpellet (stap 2,3) met behulp van een pipet van 1 ml over een periode van 30 sec.
  5. Laat 3,5 min bij RT.
    Opmerking: Incubatietijd met PEG kan worden geoptimaliseerd afhankelijk van het celtype, hoewel merk op dat langere incubatietijd de celtoxiciteit verhoogt.
  6. Voeg 10 ml serum vrije DMEM druppelsgewijs toe voor 30 sec. en laat 10 minuten in de incubator staan.
  7. Spin naar beneden bij 1.000 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en regeer voorzichtig in 1 ml volledig medium (DMEM met FBS).
    Opmerking: Ga rechtstreeks naar sectie 3. Er is toxiciteit in verband met PEG blootstelling gevolgd door flow cytometrie en beeldvorming, dus houd cellen in cultuuromstandigheden zo veel mogelijk door snel te gaan tussen de stappen.

3. fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om gesmolten cellen te verrijken

  1. Maak alle cellen klaar voor Flowcytometrie door elk monster voorzichtig afzonderlijk te pipetteren via een 70 μm filter in een FACS buis.
    Opmerking: Er zijn vier monsters nodig: gesmolten cellen, enkel gelabelde Far Red-cellen, enkelvoudig gelabelde Violette cellen, niet-gelabelde ouderlijke cellen. Eenmaal verwijderd uit de steriele weefselcultuur Hood, cellen hebben de capaciteit om besmet te raken, dus Minimaliseer de blootstellingsduur van monsters naar een niet-steriele omgeving vanaf hier. Cellen worden gesorteerd in volledig DMEM-medium.
  2. Gebruik een cytometer die geschikt is voor het sorteren van één cel.
    1. Stel de celsorteerder in voor een aseptische sortering. Voer de kwaliteitscontrole van het instrument uit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Teken een plot van forward Scatter versus side Scatter en een Doublet discriminatie plot.
  3. Creëer poorten om gesmolten cellen te identificeren.
    1. Prikkelen de fluorescerende kleurstoffen bij golflengten van 405 nm en 635 nm. Detecteren op 450 nm en 660 nm (respectievelijk Violet en verre rode golflengten). Plot Far Red versus Violet golflengten.
    2. Voer ongegelabelde ouderlijke cellen uit via de cytometer en noteer de intensiteit van de fluorescentie.
      Opmerking: Waarden boven deze basislijn definiëren positiviteit voor kleurstof kleuring.
    3. Voer enkele gelabelde Violette cellen uit via de cytometer. Bevestig dat Violet niet in het verre rode kanaal is gemorst.
    4. Voer enkele gelabelde Far Red-cellen uit via de cytometer en bevestig dat er geen morsen van ver rood in het Violet kanaal zit.
      Opmerking: Voor de getoonde representatieve gegevens werden de cellen gesorteerd op 20 psi op een sorteerder uitgerust met een 100 μm nozzle.
    5. Voer kort het fusie monster uit om te bevestigen dat gesmolten cellen zichtbaar zijn met de poorten die in stap 3,3 zijn gemaakt.
  4. Lijn de sorteer stroom centraal uit in een 8-well Imaging Dish.
  5. FACS sorteren gesmolten cellen, presenteren als dubbele positieve Violet en ver rood gelabelde cellen rechtstreeks in een 8-well Imaging Dish met 100 μL groeimedium.
    Opmerking: Het maximaal aanbevolen aantal cellen is ~ 50.000 per 8-well Dish. Zorg voor celstatus tijdens het sorteren. Celconfluentie kan de celstatus beïnvloeden, dus houd cellen tussen 20 − 90% confluentie na sortering door een geschikt aantal cellen voor de beeldvormings schaal te sorteren. Elke gesorteerde druppel bevat ongeveer 3 nL van de mantel vloeistof. Zorg ervoor dat de mantel vloeistof het groeimedium tijdens het sorteren niet significant verdunnen.
  6. Direct na het sorteren, neem de cellen terug naar de incubator en laat > 2 uur of 's nachts.
    Opmerking: Aanhandende cellen zullen geleidelijk aan de dekslip in deze periode, vanaf het sorteren, en dus hun morfologie zal veranderen in de tijd als rechtstreeks naar de Microscoop.

4. immunofluorescentie kleuring en beeldvorming van Celcelfusies

Opmerking: Gesmolten cellen kunnen live of na fixatie en verdere fluorescerende kleuring (of beide) worden afgebeeld, afhankelijk van de vereiste experimenten en metingen.

  1. Live-celbeeldvorming
    1. Vervang het groeimedium door Imaging medium zonder fenolrood (tabel met materialen) en ga direct naar Imaging.
  2. Fixatie en kleuring
    1. Bereid verse 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS.
    2. Repareer cellen door ze in 100 μL van 4% PFA gedurende 15 minuten bij RT te inbroed. Verwijder PFA na 15 min.
      Let op: PFA is giftig bij inademing, dus deze stap moet worden uitgevoerd in een rook afzuigkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
      Opmerking: Na fixatie kan het experiment worden onderbroken en later opnieuw worden gestart, indien nodig. Bewaar het monster bij 4 °C, indien nodig beschermd tegen licht.
    3. Was cellen 3x in 200 μL PBS bij RT.
    4. Permeabilize cellen gedurende 10 min bij RT in 200 μL van 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof (tabel met materialen) en 0,1% nonionisch reinigingsmiddel (tabel metmaterialen), verdund in PBS.
    5. In 200 μL van 3% boviene serumalbumine in PBS gedurende 30 min bij RT.
    6. Inbroed met antilichamen in 150 μL PBS met 3% boviene serumalbumine en 0,1% nonionisch oppervlakteactieve stof en 0,05% nonionisch reinigingsmiddel gedurende 1 uur bij RT.
      Opmerking: De primaire antilichamen die worden gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten zijn fluorescendig geconjugeerd anti-GFP nanobody (gebruikt bij 1:400 verdunning), en fluorescently geconjugeerde anti-mScarlet-I nanobody (gebruikt bij 1:500 verdunning). Deze versterken het signaal van de reeds fluorescerende eiwitten.
    7. Was 2x gedurende 5 minuten in 300 μL PBS en laat vervolgens in 200 μL PBS.
      Opmerking: Voorbeelden worden in PBS afgebeeld. Monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C beschermd tegen licht.
  3. Image Acquisition
    1. Verkrijg afbeeldingen met een geschikte fluorescentiemicroscoop die geschikt is voorbeeld vorming in vier kleuren (bijv. confocale, Widefield, gestructureerde belichting).
    2. Excite meGFP-en mScarlet-I-kanalen met respectievelijk 488 nm en 561 nm-golflengte lasers. Stel detectoren in om op ~ 505 − 550 nm en ~ 590 − 650 nm te detecteren. Excite Violet en Far Red Dye kanalen met 405 nm en 633 nm lasers, respectievelijk. Stel detectoren in op detectie bij ~ 430 − 500 nm en ~ 660 − 750 nm.
    3. Empirisch bepalen de laserintensiteit zodanig dat significante photobleaching niet optreedt en dat cellen gezond blijven (als Live-celbeeldvorming).
    4. Empirisch bepalen Gain zodanig dat signaal wordt verkregen zonder verzagende of kunstmatig knippen pixelwaarden.
    5. Verzamel Z-stack gegevens, zodat afbeeldingen driedimensionaal zijn, met een bereik van 20 − 60 μm met een stapgrootte van ~ 500 μm.
      Opmerking: De afbeeldingen getoond in representatieve gegevens werden verkregen door ofwel confocale(figuur 2B), airyscan (Figuur 2C) of gestructureerde verlichtings microscopie (Figuur 2D). Elke cel is een bonafide heterokaryon als het zowel Violet als veel rode kleurstoffen bevat die elkaar overlappen in het cytoplasma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Correct gelabelde cellen zijn zichtbaar tijdens de stromings cytometrie door een fluorescentie signaal dat hoger is dan de niet-gelabelde controle cellen (Figuur 2A). Gates zijn ingesteld voor het sorteren van dubbele positieve cellen, die deze populatie rechtstreeks verrijken in beeldvormings gerechten voor verdere microscopische analyses. Gesmolten cellen zijn detecteerbaar als verschillende dubbele fluorescentienpositieve cellen en vormen ongeveer ~ 1% van de populatie.

Fusion induceert belangrijke herschikking van cellulaire architectuur door menging van twee cellen in één (Figuur 2B). Heterokaryonen worden op de Microscoop geïdentificeerd als cellen met beide fluorescerende kleurstof signalen die in een enkele cel worden gemengd (zonder tussenliggende plasma membranen). Bovendien kunnen twee kernen zichtbaar zijn in gesmolten cellen door brightfield/differentiële interferentie contrast of fluorescentie Imaging. Merk op dat Triploïde of andere meer sterk polyploïde toestanden zijn mogelijk naast diploïde fusies echter, en dus kleurstof signaal van twee kleuren moet worden gebruikt om de identiteit van de gesmolten cellen te bevestigen.

Celstructuur en functie worden verder onderzocht door het samenvoegen van cellen met meGFP en mScarlet-I gelabelde eiwitten. Fusie resulteert in een verdubbeling van het zwaartepunt getal binnen heterokaryonen als gevolg van de fusie van twee cellen. Dus, als cellen met fluorescently gelabelde centromosomen worden gesmolten, worden ten minste vier pericentriollaire materiaal Foci waargenomen wanneer het centromeer pericentriollaire onderdeel NEDD1 fluorescently gelabeld is (NEDD1-mRuby3; Figuur 2C). Fusie van cellen met endogeen fluorescentend gelabelde rootletin (rootletin-megfp en rootletin-mscarlet-I) kan de cel van oorsprong van elk centrosoom worden geïdentificeerd in een heterokaryon. Rootletin in centrosomale wortels heeft beperkte diffusie omzet24, en is daarom aanwezig als uitgesproken gekleurde vezels in heterokaryonen afgebeeld met fluorescentiemicroscopie (Figuur 2D).

Figure 1
Figuur 1: de experimentele workflow van celcelfusie en fluorescentie Imaging. Schematische voorstelling van de Viertraps experimentele workflow. (1) twee celpopulaties zijn differentieel geëtiketteerd, met kleurstoffen en fluorescerende fusie eiwitten. Cyaan representeert vlekken met Violet celkleur stof en magenta representeert vlekken met Far Red Cell Dye. Groen staat voor meGFP-tagging en rood staat voor mScarlet-I-tagging. (2) cellen worden gefuseerd door incubatie met polyethyleenglycol. (3) gesmolten cellen worden verrijkt door Flowcytometrie, waarbij de dubbele fluorescentiele positieve cellen (far Red en violet) worden gesorteerd. (4) gesmolten cellen worden door fluorescentiemicroscopie afgebeeld om te begrijpen hoe de cellulaire structuur en functie worden gewijzigd (de groene en rode kanalen beeldvorming). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: representatieve stroom cytometrie verrijking en fluorescerende beeldvorming van gesmolten cellen. A) representatieve gating-strategie die wordt gebruikt bij het sorteren van gesmolten cellen in Flowcytometrie. Gesmolten cellen die dubbel fluorescerend zijn, worden aangegeven door het zwarte vierkant. B) representatieve confocale fluorescentiemicroscopie van gesmolten cellen, dubbel geëtiketteerd met Violet en veel rode kleurstoffen. Getoond zijn voorbeelden van succesvol gesmolten cellen, die tetraploïde of hexaploïde zijn (respectievelijk boven-en onderpanelen). Schaalbalk = 10 μm.C) representatieve levende cel airyscan confocale beeldvorming van nucleotiderende in een enkele gesmolten cel met endogeen gelabelde centrosomale wortels (rootletin-megfp) en centrosomaal pericentriollaire materiaal (NEDD1-mRuby3). Schaalbalk = 1 μm. (D) cellen die endogeen gelabelde Rootletin-megfp uitdrukken waren samengesmolten met cellen die endogeen gelabelde Rootletin-mscarlet-I uitdrukken. Cellen werden vast en gekleurd en afbeelding gemaakt door gestructureerde verlichting microscopie. Weergegeven is een z-projectie met maximale intensiteit van nucleotiderende in één gesmolten cel. Schaalbalk = 1 μm. panel D is gewijzigd van Mahen24 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We demonstreren een faciele en kosteneffectieve protocol voor het fusing cellen en visualiseren van de daaropvolgende architectuur van celhybriden met microscopie, het nemen van ongeveer twee dagen van start tot finish. Kritieke delen van dit protocol zijn de verrijking van gesmolten cellen door celsortering (protocol sectie 3), en zorgvuldige validatie van gesmolten cellen door microscopie (protocol sectie 4). Deze secties zorgen ervoor dat gesmolten cellen gemakkelijk worden verkregen en bonafide heterokaryonen zijn. Concentraties en incubatie tijden moeten worden nageleefd. Bij gebruik bij hogere concentraties of bij langere incubatie tijden kunnen celkleurstoffen bijvoorbeeld te fel zijn en de detectoren verzaden tijdens Flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie, of een kruis emissie veroorzaken, afhankelijk van de beeldvormings condities. Bij afwezigheid van een flow-cytometer zijn andere technologieën in staat om gesmolten cellen te verrijken, waaronder dubbele antibiotica selectie27 en microfluïdische vanginrichtingen28. Deze technologieën zijn echter langzamer of vereisen een meer op maat gemaakte experimentele Setup.

Andere methoden van celfusie hebben voor-en nadelen in vergelijking met het protocol dat hier wordt beschreven. Op elektro-fusie of virale gebaseerde fusie technieken kunnen in sommige gevallen worden afgebeeld met microscopie tijdens Fusion8,29, waardoor ze goede alternatieven zijn als het beter is om het fusieproces zelf te observeren. Deze verschillende methoden kunnen echter speciale apparatuur vereisen (zoals elektrofusie apparatuur of virale transgenen). Alle celcellige fusie methoden hebben het potentieel om de celgezondheid te laten afhangen. Virale gebaseerde fusie methoden vertrouwen in het algemeen op de aanhoudende expressie van virale transgenen, in tegenstelling tot de voorbijgaande perturbatie geboden door PEG of Electro fusie. Cellulair fusogeen potentieel en toxiciteit na blootstelling aan PEG is variabel in verschillende celtypen27, en daarom kan titratie van Peg incubatietijd nodig zijn (protocol stap 2,4), terwijl wordt erkend dat verhoogde Peg-blootstelling de celdood30verhoogt. Het maximaliseren van de celstatus is essentieel door de tijd tot een minimum te beperken van de cultuur condities. Cell Health kan worden gecontroleerd tijdens het protocol door het meten van voorwaartse Scatter versus side Scatter op de cytometer en door observatie van morfologie tijdens microscopie.

Zorgvuldige bestudering van het experimentele ontwerp om differentiële etikettering met fluorescerende labels mogelijk te maken is essentieel. Het eenvoudigste ontwerp is het gebruik van twee afzonderlijke fluorescerende labels. Echter, endogeen uitgedrukt fluorescerende fusie eiwitten zijn vaak van lage expressie niveau en daarom zijn moeilijk om ondubbelzinnig te detecteren doorstroming cytometrie of beeldvorming op het niveau van de enkele cel. We presenteren een ontwerp dat deze beperking overkomt door vier fluorescerende Tags met CRISPR Cas9-gemedieerde genoom bewerking en kleurstof gebaseerde kleurings methoden op te maken. Fluorescentie sondes moeten verschillende emissiespectra onderscheiden van elkaar en helder genoeg zijn om te onderscheiden van niet-gelabelde cellen op één celniveau. Sondes moeten gebonden blijven aan een cel in plaats van extern te verspreiden. Onomkeerbare binding intern op het subcellulair niveau is niet essentieel, maar kan wenselijk zijn. Zodra cellen samensmelten, kan steady state uitwisseling van cellulaire componenten vrij optreden. Omdat wortels diffusie stabiel zijn, kunnen ze tracering van de cellulaire geschiedenis, identificeren van de cel van oorsprong van een bepaalde centrosome. Een mogelijke wijziging van de methode is het labelen van andere cellulaire structuren van belang, maar steady-state assembly's hebben het potentieel om te mengen na fusie, afhankelijk van de snelheid van de intracellulaire dynamiek (Figuur 2C).

Cell-Cell Fusion induceert een unieke verandering in de cellulaire architectuur17,19,24, waarvan de implicaties nog steeds niet volledig worden begrepen. Dit is zowel een beperking van het protocol als een spannend gebied voor verder onderzoek. Hoewel het duidelijk is dat plasma membranen in een enkele structuur in heterokaryons31fuse, hoe andere cellulaire structuren reageren is slecht begrepen. Celfusie kan worden gebruikt om verder te begrijpen hoe organel fusie en splijting worden gereguleerd door de beeldvorming van differentiaal gelabelde organellen24,32. Toekomstig werk met celfusie zou kunnen adresseren hoe euploïdie, organel nummer en cellulaire grootte tegelijk op cel functie. Aangezien abnormale celfusie is waargenomen bij ziekteprocessen, in tumoren33 en na virale infectie10,17, dit protocol is ook van toepassing voor het aanpakken van een reeks vragen in de fundamentele en toegepaste biologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship naar R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant Number 100090/12/Z). De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript. We danken Ashok Venkitaraman en Paul French voor kritisch advies en begeleiding bij het project. We danken Chiara Cossetti en Gabriela Grondys-Kotarba in het Cambridge Institute for Medical Research flow Cytometry faciliteit voor uitstekende ondersteuning. We danken Liam Cassiday, Thomas Miller, en Gianmarco Contino voor het naleden van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62554502
37% formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope Carl Zeiss
8-well imaging dishes Ibidi 80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody Chromotek gba-488
BD Influx Cell Sorter BD Biosciences
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Cell Filters (70 μm) Biofil CSS010070
CellTrace Far Red ThermoFisher Scientific C34572
CellTrace Violet ThermoFisher Scientific C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate ThermoFisher Scientific 31966021
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody NanoTag Biotechnologies N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium Sigma-Aldrich 21083027
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich 15140122
Phenol red free DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 21063029
Phosphate buffered saline (1x PBS) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 Sigma-Aldrich P7181
Polypropylene tubes BD Falcon 352063
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 nonionic surfactant
Trypsin Sigma-Aldrich T4049
Tween 20 Fisher BioReagents BP337 nonionic detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
  2. Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
  5. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
  6. Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
  7. Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
  8. Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
  9. Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
  10. Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
  11. Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
  12. Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
  13. Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
  14. Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
  15. Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
  16. Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
  17. Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
  18. Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
  19. Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
  20. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
  21. Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
  22. Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
  23. Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
  24. Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
  25. Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
  28. Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
  29. Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
  30. Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
  31. Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
  32. Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
  33. Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).

Tags

Ontwikkelingsbiologie uitgave 154 celcelfusie centrosome euploidy heterokaryon flow cytometrie polyethyleenglycol (PEG) fluorescentiemicroscopie organelle fusogen
Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahen, R., Schulte, R. Cell-cellMore

Mahen, R., Schulte, R. Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function. J. Vis. Exp. (154), e60550, doi:10.3791/60550 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter