Summary
Formålet med denne protokollen er å fusjonere to forskjellige celletyper for å opprette hybride celler. Fluorescens mikroskopi analyse av smeltet celler brukes til å spore cellen av opprinnelsen til mobilnettet organeller. Denne analysen kan brukes til å utforske hvordan cellulære struktur og funksjon reagerer på forstyrrelsene av celle fusjon.
Abstract
Livet er romlig partisjonert innen lipid membraner for å tillate isolert dannelse av distinkte molekylære tilstander inne celler og organeller. Celle fusjon er sammenslåingen av to eller flere celler for å danne en enkelt celle. Her gir vi en protokoll for celle fusjon av to forskjellige celletyper. Smeltet hybrid celler er beriket av Flow flowcytometri-basert sortering, etterfulgt av fluorescens mikroskopi av hybrid cellestruktur og funksjon. Fluorescensmerkete Tagged proteiner generert av Genova redigering er avbildet inne smeltet celler, slik at cellulære strukturer for å bli identifisert basert på fluorescens utslipp og referert tilbake til cellen type opprinnelse. Denne robuste og generelle metoden kan brukes på ulike celletyper eller organeller av interesse, for å forstå cellulære struktur og funksjon på tvers av en rekke grunnleggende biologiske spørsmål.
Introduction
Homøostatisk vedlikehold av cellulær struktur er avgjørende for livet. Celler har karakteristiske morfologier, sub-cellulære organelle tall, og interne biokjemiske sammensetning. Forstå hvordan disse fundamentale egenskapene er generert og hvordan de går galt under sykdom krever laboratorie verktøy for å forurolige dem.
Celle fusjon er sammenslåing av to eller flere separate celler. Celle fusjon kan ha vært avgjørende for fremveksten av eukaryote liv1. I menneskekroppen, celle fusjon er relativt sjelden, forekommer under begrenset utviklings forhold og vevstyper, slik som under befruktning eller dannelsen av muskler, bein og morkaken2. Denne protokollen beskriver induksjon av celle-celle fusjon i vev kultur cellelinjer med differensielt fluorescensmerkete merket organeller, som et verktøy for å forstå mekanismene kontrollerende cellestruktur og funksjon.
I vitro indusert celle-celle fusjon er sentralt i produksjonen av monoklonale antistoffer3, et viktig verktøy for biologisk forskning og sykdomsbehandling. Cell Fusion har også blitt brukt til å spørre mange forskjellige grunnleggende celle biologiske spørsmål om celle syklus dominans4,avvik,omprogrammering, cellular,reparasjonav skadede neurons9, viral spredning10, apoptose11, tumorigenesis12, cytoskjelettkomponenter Dynamics13, og membran Fusion14,15. Laboratorie baserte metoder for å indusere celle-Cell Fusion16,17,18,19 indusere lipid membran Koalesens gjennom den fysiske sammenslåing av to bilayers i ett. Cell Fusion kan bli indusert av elektrisitet18, viral baserte metoder17, thermoplasmonic oppvarming20, transgene Expression19, og kjemikalier inkludert polyetylen glykol (PEG)16,21,22.
Centrosomes er mikrotubulinettverket organisering sentre kontrollerende cellulær form, motilitet, polarisering, og divisjon23. Centrosomal røtter er fiber strukturer som strekker seg fra centrosomes som inneholder proteinet rootletin24 (kodet av genet CROCC). Vi har nylig brukt celle-celle fusjon for å forstå hvordan centrosome posisjon og antall varierer inne heterokaryons forhold til foreldrenes celler24. Begrunnelsen bak bruken av denne metoden er å spore cellen opprinnelse røtter innenfor en heterokaryon etter fusjon av differensielt fluorescensmerkete merkede foreldrenes celler, og dermed til bilde organelle fusjon og fisjon. Den fluorescensmerkete merket proteiner rootletin-meGFP eller rootletin-mScarlet-jeg er skapt av Genova redigering i separate cellelinjer som deretter smeltet sammen med PEG-mediert celle fusjon. Vi beskriver bruken av cellefarge stoffer (tabell av materialer) for å identifisere smeltet celler ved flyt flowcytometri og påfølgende fluorescens mikroskopi identifisering av centrosome celle av opprinnelse og morfologi (figur 1). Denne tilnærmingen er en robust og unik metode for å studere hvordan store endringer i mobilnettet stat inkludert organelle nummer impinge på celle homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differensial fluorescerende cellemerking
- Gene merking med CRISPR Cas9
- Bruk CRISPR Cas9 Genova redigering å merke rootletin (eller andre gener av interesse) med fluorescerende proteiner meGFP eller mScarlet-i i menneskelig kreftcelle linjer.
Merk: Detaljerte protokoller for redigering av Genova dekkes andre steder24,25,26.
- Bruk CRISPR Cas9 Genova redigering å merke rootletin (eller andre gener av interesse) med fluorescerende proteiner meGFP eller mScarlet-i i menneskelig kreftcelle linjer.
- Fluorescerende fargestoff merking
- Grow Cal51 menneskelige kreftceller i Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), L-glutamin, og 100 μg/mL penicillin/Streptomycin ved 37 ° c og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
Merk: Det er viktig å sikre at cellene kontrolleres regelmessig for fravær av mycoplasma forurensning, og for identiteten til cellelinjen. Ikke bruk celler som har blitt omfattende passert i kultur (> 15 passasjer). Cellene må være sunne og voksende eksponentielt. Unngå confluency eller confluency. - Seed hver celle type (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I og foreldre umerkede Cal51 celler) slik at ~ 6 x 106 celler er til stede neste dag for hver prøve, på en confluency på 70 − 90%.
Merk: Dette er omtrent en T75 vev kultur kolbe eller 1 10 cm parabol per celle type. Foreldre koder celler kreves som en negativ kontroll senere i protokollen. Denne protokollen gir mulighet for produksjon av ~ 20 000 smeltet celler, men dette tallet kan økes gjennom skalering opp protokollen med et økt antall partier. - Neste dag, prewarm DMEM, Trypsin og 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) ved å plassere dem i et vannbad ved 37 ° c.
- Vask rootletin-meGFP og rootletin-mScarlet-I celler 2x i PBS ved å helle eller aspirating av medium og erstatte med 10 mL PBS.
- Label Cal51 rootletin-meGFP celler ved å legge 500 nM fiolett cellefarge stoff (tabell av materialer) i PBS for 1 min ved romtemperatur (RT).
- Label Cal51 rootletin-mScarlet-I celler ved å legge 200 nM langt rødt cellefarge stoff (tabell av materialer) i PBS for 1 min ved RT.
Merk: Hold prøvene skjermet fra lys der det er mulig etter fluorescerende flekker, for å unngå photobleaching av fluorescens. - Stopp fargestoff merkings reaksjonen ved å tilsette 10 mL DMEM i 5 min.
- Fjern umerkede foreldre Cal51 celler fra inkubator (fra trinn 1.2.2).
Merk: Disse cellene vil bli brukt senere som umerkede negative kontroller (trinn 3.3.2). - Vask alle cellene en gang ved å helle av vekstmedium og erstatte med 10 mL PBS.
- Hell av PBS og ruge i 5 minutter ved kultur forhold med 1 mL forvarmet 1x Trypsin.
- Overfør celler til et 15 mL plast konisk rør og sentrifuger ved 1000 x g i 5 min.
- Fjern forsiktig og kast Trypsin fra celle pellet med en pipette.
- Forsiktig resuspend fiolett og langt rødt merket celle pellets i 1 mL PBS.
- Resuspend forsiktig foreldre (ikke-fluorescerende) celle pellet i 1 mL DMEM og gå tilbake til inkubator.
Merk: Dette eksemplet vil ikke gjennomgå celle-celle fusjon, men vil bli brukt senere under Flow flowcytometri.
- Grow Cal51 menneskelige kreftceller i Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), L-glutamin, og 100 μg/mL penicillin/Streptomycin ved 37 ° c og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
2. celle-celle Fusion
- Bland 3 x 106 Violet merkede celler med 3 x 106 langt røde merkede celler i et 15 ml rør ved å forsiktig pipettering sammen 0,5 ml av hver celle type ved hjelp av en 1 ml pipette.
- Sentrifuger de resterende ublandet cellene fra trinn 2,1 til 1 000 x g i 5 min, og hell av PBS, resuspend pellet i 1 ml DMEM og gå tilbake til inkubator.
Merk: Disse resterende ublandet med én etikett vil senere bli brukt som negative og kompensasjons kontroller i del 3 av protokollen. - Sentrifuger de blandede cellene fra trinn 2,1 til 1 000 x g i 5 min og nøye aspirer PBS ved hjelp av en 1 ml pipette.
- Tilsett 0,7 mL på 50% 1450 PEG-løsning på en dråpevis måte til celle pellet (trinn 2,3) ved hjelp av en 1 mL pipette over en periode på 30 s.
- Permisjon for 3,5 min ved RT.
Merk: Inkubasjonstid med PEG kan optimaliseres avhengig av celle type, men Merk at lengre inkubasjonstid øker celle toksisitet. - Tilsett 10 mL serum fri DMEM dråpevis for 30 s og la i inkubator i 10 min.
- Snurr ned ved 1 000 x g i 5 min, kast supernatanten og resuspend forsiktig i 1 ml komplett medium (DMEM inneholdende FBS).
Merk: Gå direkte til del 3. Det er toksisitet forbundet med PEG eksponering etterfulgt av Flow flowcytometri og bildebehandling, så hold celler i kultur forhold så mye som mulig ved å fortsette raskt mellom trinnene.
3. fluorescens-aktivert Cell sortering (FACS) å berike smeltet celler
- Forbered alle celler for strømning flowcytometri ved forsiktig pipettering hver prøve separat gjennom et 70 μm filter inn i en FACS tube.
Merk: Fire prøver er nødvendig: smeltet celler, Single merket langt røde celler, enkelt merket fiolett celler, umerkede foreldrenes celler. Når fjernet fra sterilt vev kultur panseret, celler har kapasitet til å bli smittet, så minimere eksponeringstid av prøvene til et ikke-sterilt miljø herfra og utover. Celler sorteres i fullstendig DMEM-medium. - Bruk en flowcytometer som kan sortere én celle.
- Sette opp celle sorteringen for en aseptisk sortering. Utfør instrument kvalitetskontrollen i henhold til produsentens anbefaling.
- Tegn et plott av fremover scatter kontra side scatter og en doublet diskriminering tomten.
- Opprett porter for å identifisere smeltet celler.
- Opphisse fluorescerende fargestoffer på bølgelengder av 405 NM og 635 NM. Detect at 450 nm og 660 NM (fiolett og langt-røde bølgelengder, henholdsvis). Plot langt rødt versus fiolett bølgelengder.
- Kjør umerkede foreldre celler gjennom flowcytometer og registrere fluorescens intensitet.
Merk: Verdier over denne grunnlinjen definerer positivitet for farging av fargestoffer. - Kjør enkelt merkede fiol celler gjennom flowcytometer. Bekreft at det ikke er søl over fiolett i den langt røde kanalen.
- Kjør enkelt merket langt røde celler gjennom flowcytometer og Bekreft at det ikke er søl over langt rødt inn i fiolett kanal.
Merk: For representative data som vises, celler ble sortert på 20 PSI på en Sorter utstyrt med et 100 μm dyse. - Kjør kort Fusion prøven for å bekrefte at smeltet celler er synlige med portene opprettet i trinn 3,3.
- Juster sorterings strømmen sentralt i en 8-vel tenkelig rett.
- FACS sortere smeltet celler, presentere som dobbel positiv fiolett og langt rødt merkede celler direkte inn i en 8-brønn tenkelig parabolen inneholder 100 μL av vekstmedium.
Merk: Maksimalt anbefalt antall celler er ~ 50 000 per 8-brønn. Sørg for celle helse under sortering. Celle confluency kan påvirke celle helsen, så hold cellene mellom 20 − 90% confluency etter sortering ved å sortere et passende antall celler for bilde retten. Hver sortert dråpe inneholder ca 3 nL av skjede væske. Sørg for at skjede væsken ikke signifikant fortynne vekstmedium under sortering. - Rett etter sortering, ta celler tilbake til inkubator og la for > 2 t eller over natten.
Merk: Tilhenger celler vil gradvis re-forholde seg til dekkglass i denne perioden, fra sortering og utover, og dermed deres morfologi vil endres over tid hvis det tas direkte til mikroskopet.
4. Immunofluorescent farging og Imaging av Cell-celle fusjoner
Merk: Smeltet celler kan bli avbildet Live eller etter fiksering og ytterligere fluorescerende flekker (eller begge), avhengig av eksperimenter og målinger som kreves.
- Levende celle bilde
- Erstatt vekstmedium med Imaging medium uten fenol rød (tabell over materialer) og gå direkte til Imaging.
- Fiksering og farging
- Forbered frisk 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS.
- Fix celler ved incubating dem i 100 μL av 4% PFA i 15 minutter ved RT. Fjern PFA etter 15 min.
Forsiktig: PFA er giftig ved innånding, slik at dette trinnet bør utføres i en avtrekks hette med egnet personlig verneutstyr.
Merk: Etter fiksering kan eksperimentet stanses midlertidig og startes på nytt senere om nødvendig. Oppbevar prøven ved 4 ° c beskyttet mot lys om nødvendig. - Vask celler 3x i 200-μL av PBS på RT.
- Permeabilize celler i 10 min ved RT i 200 μL av 0,1% ioniske overflateaktivt middel (tabell av materialer) og 0,1% ioniske vaskemiddel (tabell av materialer) fortynnet i PBS.
- Blokk i 200 μL av 3% storfe serum albumin i PBS for 30 min ved RT.
- Ruge med antistoffer i 150 μL av PBS som inneholder 3% blod serum albumin og 0,1% ioniske overflateaktivt middel og 0,05% ioniske vaskemiddel for 1 time ved RT.
Merk: Den primære antistoffer som brukes til å generere representative resultatene er fluorescensmerkete bøyd anti-GFP nanobody (brukt ved 1:400 fortynning), og fluorescensmerkete bøyd anti-mScarlet-I nanobody (brukt ved 1:500 fortynning). Disse forsterker signalet av de allerede fluorescerende proteiner. - Vask 2x i 5 min i 300 og deretter la i 200 μL av PBS.
Merk: Prøvene er avbildet i PBS. Prøvene kan oppbevares ved 4 ° c beskyttet mot lys.
- Bildeoppkjøp
- Skaff bilder med et passende fluorescens mikroskop som kan ha firefargers bildebehandling (f.eks. konfokalmikroskopi, widefield, strukturert belysning).
- Opphisse meGFP og mScarlet-I kanaler med 488 NM og 561 NM bølgelengde lasere, henholdsvis. Sett detektorer for å oppdage på ~ 505 − 550 NM og ~ 590 − 650 NM. Opphisse fiolett og langt rødt fargestoff kanaler med 405 NM og 633 NM lasere, henholdsvis. Sett detektorer for å oppdage på ~ 430 − 500 NM og ~ 660 − 750 NM.
- Empirisk bestemme laser intensitet slik at betydelige photobleaching ikke forekommer, og at cellene forblir friske (hvis Live celle Imaging).
- Empirisk avgjøre fortjene slik det signal er oppnådd uten mette eller kunstig klipping pixel verdier.
- Samle Z-stack-data, slik at bildene er tredimensjonale, og dekker et område på 20 − 60 μm med en trinn størrelse på ~ 500 μm.
Merk: Bildene vist i representative data ble kjøpt av enten konfokalmikroskopi (figur 2B), Airyscan (figur 2C) eller strukturert belysning mikroskopi (figur 2D). Hver celle er en bona fide heterokaryon hvis den inneholder både fiolett og langt røde fargestoffer overlappende i cytoplasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Passende merkede celler er synlige underflyt flowcytometri av fluorescens signal høyere enn umerkede kontroll celler (figur 2A). Gates er satt for sortering av doble positive celler, berikende denne befolkningen direkte i Imaging retter for videre mikroskopiske analyser. Smeltet celler er synlig som distinkte doble fluorescensmerkete positive celler og utgjør ca ~ 1% av befolkningen.
Fusion induserer store omorganisering av cellulær arkitektur gjennom blanding av to celler til ett (figur 2B). Heterokaryons er identifisert på mikroskopet som celler som inneholder både fluorescerende fargestoff signaler blandet inne i en enkelt celle (uten å intervenere plasma membraner). I tillegg kan to kjerner være synlig i smeltet celler ved brightfield/differensial forstyrrelser kontrast eller fluorescens Imaging. Merk at triploid eller andre mer høyt polyploid stater er mulig i tillegg til diploid fusjoner imidlertid, og så fargestoff signal av to farger bør brukes til å bekrefte identiteten til smeltet celler.
Cellestruktur og funksjon er videre undersøkt gjennom sammenslåing av celler som inneholder meGFP og mScarlet-I Tagged proteiner. Fusion resulterer i en dobling av det centrosome tallet i heterokaryons som følge av fusjon av to celler. Således, hvis celler med fluorescensmerkete merket centrosomes er smeltet, minst fire pericentriolar materiale fokus er observert når centrosome pericentriolar komponent NEDD1 er fluorescensmerkete merket (NEDD1-mRuby3; Figur 2C). Fusjon av celler med endogenously fluorescensmerkete tagget rootletin (rootletin-meGFP og rootletin-mScarlet-I) gjør det mulig å identifisere celle opprinnelsen til hver centrosome i en heterokaryon. Rootletin i centrosomal røtter har begrenset diffusional omsetning24, og er derfor tilstede som utpreget fargede fibre i heterokaryons avbildet med fluorescens mikroskopi (figur 2D).
Figur 1: celle-celle fusjon og fluorescens Imaging eksperimentell arbeidsflyt. Skjematisk av de fire-trinns eksperimentelle arbeidsflyt. (1) to celle populasjoner er differensielt merket, med fargestoffer og fluorescerende fusjons proteiner. Cyan representerer farging med fiolett cellefarge og magenta representerer farging med langt rødt cellefarge stoff. Grønn representerer meGFP-merking og rød representerer mScarlet-I-merking. (2) celler er smeltet sammen gjennom inkubasjons med polyetylen-glykol. (3) smeltet celler er beriket av Flow flowcytometri, sortering av doble fluorescensmerkete positive celler (langt rødt og fiolett). (4) smeltet celler er avbildet av fluorescens mikroskopi å forstå hvordan cellulære struktur og funksjon er endret (Imaging den grønne og røde kanaler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant flyt flowcytometri berikelse og fluorescerende Imaging av smeltet celler. (A) representative gating strategi som brukes i Flow flowcytometri sortering av smeltet celler. Smeltet celler som er dobbelt fluorescerende er indikert av den svarte firkanten. (B) representative konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi av smeltet celler, dobbelt merket med fiolett og langt røde fargestoffer. Vist er eksempler på vellykket smeltet celler, som enten er tetraploid eller hexaploid (topp og bunn paneler henholdsvis). Scale bar = 10 μm. (C) representant Live Cell Airyscan konfokalmikroskopi Imaging av centrosomes i en enkelt smeltet celle som inneholder endogenously merket centrosomal røtter (Rootletin-meGFP) og centrosomal pericentriolar materiale (NEDD1-mRuby3). Scale bar = 1 μm. (D) celler som uttrykker endogenously Tagged Rootletin-meGFP ble smeltet sammen med celler uttrykker endogenously Tagged Rootletin-mScarlet-I. Celler ble fikset og farget og avbildet av strukturert belysning mikroskopi. Vist er en maksimal intensitet z-projeksjon av centrosomes i en smeltet celle. Scale bar = 1 μm. panel D har blitt modifisert fra Mahen24 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viser en facile og kostnadseffektiv protokoll for fiksering celler og visualisere den påfølgende arkitekturen av celle hybrider med mikroskopi, tar ca to dager fra Start til slutt. Kritiske deler av denne protokollen er berikelse av smeltet celler ved celle sortering (protokoll del 3), og forsiktig validering av smeltet celler ved mikroskopi (protokoll seksjon 4). Disse seksjonene sikre at smeltet celler er lett innhentet og er bona fide heterokaryons. Konsentrasjoner og inkubasjons tider bør overholdes. Når det for eksempel brukes ved høyere konsentrasjoner eller med lengre inkubasjons tider, kan cellefarge stoffer være for lyse og Mette detektoren under strømnings flowcytometri eller fluorescens mikroskopi, eller forårsake kryss utslipp avhengig av bildeforhold. I fravær av en flyt flowcytometer, andre teknologier er i stand til berikende smeltet-celler, inkludert dobbelt antibiotika utvalg27 og mikrovæskebasert overlapping enheter28. Disse teknologiene er enten tregere eller krever en mer skreddersydd eksperimentell oppsett, imidlertid.
Andre metoder for celle fusjon har fordeler og ulemper i forhold til protokollen som er beskrevet her. Elektro-Fusion eller viral-baserte Fusion teknikker kan i noen tilfeller bli avbildet med mikroskopi under fusjon8,29, noe som gjør dem gode alternativer hvis det er å foretrekke å observere Fusion prosessen selv. Imidlertid kan disse ulike metodene krever spesialisert utstyr (for eksempel electrofusion utstyr eller viral transgenes). Alle celle-celle Fusion metoder har potensial til å impinge på cellen helse. Viral basert fusjon metoder generelt stole på fortsatt uttrykk for viral transgenes, i motsetning til forbigående forstyrrelsene gitt av PEG eller electrofusion. Cellular fusogenic potensiale og toksisitet etter PEG eksponering er variabel i ulike celletyper27, og dermed TITRERING av Peg inkubasjonstid kan være nødvendig (protokoll trinn 2,4), mens erkjenner at økt Peg eksponering øker celle død30. Maksimering celle helse er kritisk ved å holde tiden ute av kultur forhold til et minimum. Cell helse kan kontrolleres under protokollen ved å måle fremover scatter versus side scatter på flowcytometer og gjennom observasjon av morfologi under mikroskopi.
Nøye vurdering av eksperimentell design for å tillate differensial merking med fluorescerende koder er viktig. Den enkleste designen er å bruke to separate fluorescerende etiketter. Men endogenously uttrykt fluorescerende Fusion proteiner er ofte av lav uttrykks nivå og dermed er vanskelig å entydig oppdage ved flyt flowcytometri eller Imaging på enkelt cellenivå. Vi presenterer et design som overvinner denne begrensningen ved å inkludere fire fluorescerende koder med CRISPR Cas9-mediert Genova redigering og Dye-baserte farging metoder. Fluorescerende sonder må ha distinkte utslipp Spectra merkbar fra hverandre og være lyse nok til å skille fra umerkede celler på en enkelt cellenivå. Sonder må være bundet til en celle i stedet for å dissipating eksternt. Irreversible bindende internt på subcellulære nivå er ikke avgjørende, men kan være ønskelig. Når cellene fusjonere, kan steady state utveksling av cellulære komponenter fritt forekomme. Siden røttene er diffusionally stabile, de tillater sporing av mobilnettet historie, identifisere cellen av opprinnelsen til en gitt centrosome. En mulig endring av metoden er å merke andre cellulære strukturer av interesse, men steady-state forsamlinger har potensial til å blande etter fusjon, avhengig av frekvensen av intracellulære dynamikk (figur 2C).
Cell-celle Fusion induserer en unik endring i cellulær arkitektur17,19,24, implikasjonene som fortsatt ikke fullt ut forstått. Dette er både en begrensning av protokollen og et spennende område for videre etterforskning. Selv om det er klart at plasma membraner sikring i en enkelt struktur i heterokaryons31, hvordan andre cellulære strukturer reagerer er dårlig forstått. Cell Fusion kan brukes til å ytterligere forstå hvordan organelle Fusion og fisjon er regulert gjennom Imaging av differensielt merket organeller24,32. Fremtidig arbeid med celle fusjon kan håndtere hvordan euploidy, organelle nummer og mobil størrelse gjøre inngrep på celle funksjon. Siden unormal celle fusjon har blitt observert i sykdoms prosesser, i svulster33 og etter viral infeksjon10,17, er denne protokollen også for bruk for adressering en rekke spørsmål i grunnleggende og anvendt biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en Wellcome tillit Henry Wellcome Fellowship til RM (https://wellcome.ac.uk/grant nummer 100090/12/Z). Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Ashok Venkitaraman og Paul fransk for kritiske råd og veiledning om prosjektet. Vi takker Chiara Cossetti og Gabriela Grondys-Kotarba i Cambridge Institute for Medical Research Flow flowcytometri anlegg for utmerket støtte. Vi takker Liam Cassiday, Thomas Miller, og Gianmarco Contino for korrekturlesing manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70 μm) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
