Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Published: December 7, 2019 doi: 10.3791/60550

Summary

Bu protokolün amacı, melez hücreler oluşturmak için iki farklı hücre türünü birleştirmektir. Erimiş hücrelerin floresan mikroskobu analizi hücresel organellerin menşe hücresini izlemek için kullanılır. Bu tetki, hücre yapısı nın ve fonksiyonun hücre füzyonu ile tedirginlik lere nasıl tepki verdiğinin araştırılması için kullanılabilir.

Abstract

Yaşam, hücre ve organeller içinde farklı moleküler durumların izole oluşumunu sağlamak için lipid membranları içinde mekansal olarak bölümlenir. Hücre füzyonu, tek bir hücreyi oluşturmak için iki veya daha fazla hücrenin birleşmesidir. Burada iki farklı hücre türünün hücre füzyonu için bir protokol salıyoruz. Erimiş hibrid hücreler akış sitometri tabanlı sıralama ile zenginleştirilmiş, hibrid hücre yapısı ve fonksiyonufloresan mikroskobu takip. Genom düzenleme tarafından üretilen floresan etiketli proteinler erimiş hücrelerin içinde görüntülenir, hücre yapıları floresan emisyona göre tespit ve kökeni hücre tipine geri başvurulmasını sağlar. Bu sağlam ve genel yöntem, hücresel yapıyı ve işlevi bir dizi temel biyolojik soru da anlamak için farklı hücre tiplerine veya ilgi organlarına uygulanabilir.

Introduction

Hücresel yapının homeostatik bakımı yaşam için çok önemlidir. Hücreler karakteristik morfolojilere, hücre altı organel sayılarına ve iç biyokimyasal bileşimlere sahiptir. Bu temel özelliklerin nasıl oluşturulduğunu ve hastalık sırasında nasıl ters gittiklerini anlamak, onları tedirgin etmek için laboratuvar araçları gerektirir.

Hücre füzyonu iki veya daha fazla ayrı hücrenin birleşmesidir. Hücre füzyonu ökaryotik yaşamın ortaya çıkması için kritik olabilir1. İnsan vücudunda, hücre füzyonu nispeten nadirdir, sınırlı gelişimsel durumlar ve doku tipleri sırasında meydana gelen, döllenme veya kas oluşumu sırasında gibi, kemik ve plasenta2. Bu protokol, hücre yapısını ve işlevini kontrol eden mekanizmaları anlamak için bir araç olarak, farklı floresan olarak etiketlenmiş organeller ile doku kültürü hücre hatlarında hücre-hücre füzyoninin indüksiyonunu tanımlar.

In vitro indüklenen hücre-hücre füzyonu monoklonalantikorlarınüretiminde merkezi 3 , biyolojik araştırma ve hastalık tedavisi için önemli bir araçtır. Hücre füzyonu da hücre döngüsü hakimiyeti hakkında birçok farklı temel hücre biyolojik sorular sormak için kullanılmıştır4, aneuploidy5,6, hücresel yeniden programlama7,8, hasarlı nöronlarınonarımı 9, viral proliferasyon10, apoptoz11, tümörigenesis12, sitoskeletal dinamik13, ve membran füzyon14,15. Hücre-hücre füzyonu ikna etmek için laboratuvar tabanlı yöntemler16,17,18,19 bir iki iki katmanlı fiziksel birleştirme yoluyla lipid membran birleşmesi neden. Hücre füzyonu elektrik tarafından indüklenen olabilir18, viral tabanlı yöntemler17, termoplazmaik ısıtma20, transgen ekspresyonu19, ve polietilen glikol dahil kimyasallar (PEG)16,21,22.

Centrozsomes hücresel şekil, hareketlilik, polarizasyon ve bölüm23kontrol mikrotübül organize merkezleri vardır. Centrozomal kökler,24 protein rootletini içeren centrozomlardan yayılan lifli yapılardır (CROCCgeni tarafından kodlanmıştır). Biz son zamanlarda nasıl centrosome pozisyon ve sayı ebeveyn hücreleri24göre heterokaryoniçinde değişir anlamak için hücre-hücre füzyon kullanılır. Bu yöntemin kullanımının arkasındaki mantığı farklıfloresan floresan etiketli ebeveyn hücrelerinin füzyon sonra bir heterokaryon içinde köklerin kökeni hücre izlemek için, ve böylece görüntü organel füzyon ve fizyon için. Floresan etiketli proteinler rootletin-meGFP veya rootletin-mScarlet-I, daha sonra PEG aracılı hücre füzyonu ile eritilen ayrı hücre hatlarında genom düzenleme tarafından oluşturulur. Akış sitometrisi ve daha sonraki floresan mikroskobu ile erimiş hücreleri tanımlamak için hücre boyalarının(Malzeme Tablosu)kullanımını ve daha sonra menşe ve morfolojisentrozom hücresinin tanımlanmasını tanımlarız (Şekil 1). Bu yaklaşım, hücre homeostazı üzerine organel sayısı da dahil olmak üzere hücresel devlet büyük değişiklikler nasıl incelenmesi için sağlam ve benzersiz bir yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Diferansiyel Floresan Hücre Etiketleme

  1. CRISPR Cas9 ile gen etiketleme
    1. CrispR Cas9 genom düzenlemesini kullanarak insan kanser hücresi hatlarındaki floresan proteinler meGFP veya mScarlet-I ile rootletin (veya diğer ilgi genlerini) etiketleyin.
      NOT: Genom düzenleme için ayrıntılı protokoller başka bir yerde24,25,26kapsamaktadır.
  2. Floresan boya etiketleme
    1. 37 °C'de %10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin ve 37 °C'de 100 μg/mL penisilin/streptomisin ve %5 CO 2 nemli bir inkuvtörde %5 CO2 ile desteklenen Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) Cal51 insan kanser hücrelerini yetiştirin.
      NOT: Hücrelerin mikoplazma kontaminasyonu yokluğunda ve hücre hattının kimliği için düzenli olarak kontrol edilmesini sağlamak önemlidir. Kültürde kapsamlı olarak geçiş yapmış hücreleri kullanmayın (>15 pasajlar). Hücreler sağlıklı ve katlanarak büyüyen olmalıdır. Az birleşimden veya aşırı birleşmeden kaçının.
    2. Her hücre tipini (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I ve ebeveyn etiketsiz Cal51 hücreleri) böylece ~6 x 106 hücre her örnek için ertesi gün 70−90%'lik bir birleşmeyle hazır bulunun.
      NOT: Bu yaklaşık bir T75 doku kültürü şişesi veya hücre tipi başına bir 10 cm çanak. Ebeveyn etiketlenmemiş hücreler daha sonra protokolde negatif denetim olarak gereklidir. Bu protokol ~ 20.000 erimiş hücrelerin üretimi için izin verir, ancak bu sayı toplu daha fazla sayıda protokol ölçekleme yoluyla artırılabilir.
    3. Ertesi gün, prewarm DMEM, tripsin ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirerek.
    4. Orta dökerek veya azarlayarak ve 10 mL PBS ile değiştirerek rootletin-meGFP ve rootletin-mScarlet-I hücrelerini PBS'de 2x yıkayın.
    5. Etiket Cal51 rootletin-meGFP hücreleri 500 nM menekşe hücre boyası ekleyerek(Tablo Malzemeler) PBS oda sıcaklığında 1 dakika (RT).
    6. Etiket Cal51 rootletin-mScarlet-I hücreleri RT 1 dakika için PBS 200 nM uzak kırmızı hücre boyası(Malzeme Tablosu)ekleyerek.
      NOT: Floresan lekelenmeden sonra numuneleri mümkün olan her yerde ışıktan koruyun, floresan fotobeyazrlamasını önleyin.
    7. 5 dakika boyunca 10 mL DMEM ekleyerek boya etiketleme reaksiyonlarını durdurun.
    8. Etiketlenmemiş ebeveyn Cal51 hücrelerini kuvözden çıkarın (adım 1.2.2'den).
      NOT: Bu hücreler daha sonra etiketlenmemiş negatif denetimler (adım 3.3.2) olarak kullanılacaktır.
    9. Büyüme ortamını dökerek ve 10 mL PBS ile değiştirerek tüm hücreleri bir kez yıkayın.
    10. 1 mL önceden ısıtılmış 1x tripsin ile kültür koşullarında PBS ve inkübasyon 5 dakika için dökün.
    11. Hücreleri 15 mL plastik konik tüpe ve santrifüje 1000 x g'da 5 dk aktarın.
    12. Dikkatle çıkarın ve bir pipet ile hücre pelet ten tripsin atın.
    13. PBS'nin 1 mL'inde menekşe ve uzak kırmızı etiketli hücre peletlerini yavaşça askıya alın.
    14. DMEM'in 1 mL'sinde ebeveyn (floresan olmayan) hücre peletini yavaşça askıya alın ve kuvöze geri dönün.
      NOT: Bu örnek hücre-hücre füzyonundan geçmeyecek, daha sonra akış sitometrisi sırasında kullanılacaktır.

2. Hücre-Hücre Füzyonu

  1. 1 mL pipet kullanarak her hücre tipinden 0,5 mL'lik bir boruyu hafifçe birbirine doğru borulandırarak 15 mL'lik bir tüpte 3 x 106 mor etiketli hücreleri karıştırın.
  2. Kalan karışık olmayan hücreleri adım 2.1'den 5 dk için 1.000 x g'da santrifüj edin, sonra PBS'yi dökün, peleti 1 mL DMEM'de yeniden askıya alın ve kuvöze geri dönün.
    NOT: Bu kalan tek etiketli örnekler daha sonra protokolün bölüm 3'te negatif ve telafi denetimleri olarak kullanılacaktır.
  3. 5 dk için 1.000 x g adım 2.1 karışık hücreleri santrifüj ve dikkatle 1 mL pipet kullanarak PBS aspire.
  4. 30 s'lik bir süre boyunca 1 mL pipet kullanarak hücre peletine (adım 2.3) damla gibi 0,7 mL 1450 PEG çözeltisi ekleyin.
  5. RT'de 3,5 dakika bekletin.
    NOT: PEG ile kuluçka süresi hücre tipine bağlı olarak optimize edilebilir, ancak daha uzun kuluçka süresi hücre toksisitesini artırır unutmayın.
  6. 30 s için 10 mL serumsuz DMEM damlama ekleyin ve 10 dakika kuvözde bırakın.
  7. 5 dakika boyunca 1.000 x g'de aşağı doğru dön, supernatant'ı atın ve 1 mL tam ortamda (FBS içeren DMEM) hafifçe askıya alın.
    NOT: Doğrudan bölüm 3'e gidin. Peg maruziyeti ile ilişkili toksisite ve ardından akış sitometrisi ve görüntüleme vardır, bu nedenle adımlar arasında hızla ilerleyen hücreleri mümkün olduğunca kültür koşullarında tutun.

3. Erimiş Hücreleri Zenginleştirmek için Floresan Aktive Hücre Sıralaması (FACS)

  1. Her numuneyi 70 μm'lik bir filtreden ayrı ayrı bir FACS tüpüne borulayarak tüm hücreleri akış sitometrisine hazırlayın.
    NOT: Dört örnek gereklidir: erimiş hücreler, tek etiketli uzak kırmızı hücreler, tek etiketli menekşe hücreleri, etiketlenmemiş ebeveyn hücreleri. Steril doku kültürü başlığından çıkarıldıktan sonra hücreler enfekte olma kapasitesine sahiptir, bu nedenle numunelerin buradan itibaren steril olmayan bir ortama maruz kalma süresini en aza indirir. Hücreler tam DMEM ortamda sıralanır.
  2. Tek hücre sıralama yeteneğine sahip bir sitometre kullanın.
    1. Hücre ayırıcısını aseptik sıralama için ayarlayın. Üreticinin tavsiyesi ne göre cihaz kalite kontrol gerçekleştirin.
    2. Yan dağılıma karşı ileri dağılım ve çift taraflı ayrımcılık komplosu çizin.
  3. Erimiş hücreleri tanımlamak için kapılar oluşturun.
    1. 405 nm ve 635 nm dalga boylarında floresan boyaları heyecanlandırın. 450 nm ve 660 nm (sırasıyla mor ve uzak kırmızı dalga boylarında) tespit edin. Çizim çok kırmızı karşı menekşe dalga boyları.
    2. Etiketlenmemiş ebeveyn hücrelerini sitometreden geçirin ve floresan yoğunluğunu kaydedin.
      NOT: Bu taban çizgisinin üzerindeki değerler boya boyama için pozitifliği tanımlar.
    3. Sitometre ile tek etiketli menekşe hücreleri çalıştırın. Menekşenin uzak kırmızı kanala dökülmediğini doğrulayın.
    4. Sitometre ile tek etiketli çok kırmızı hücreler çalıştırın ve menekşe kanal içine çok kırmızı dökülme olduğunu onaylayın.
      NOT: Gösterilen temsili veriler için hücreler 100 μm nozula sahip bir ayıklayıcıda 20 psi olarak sıralandı.
    5. Erimiş hücrelerin adım 3.3'te oluşturulan kapılarla görülebilen hücreleri doğrulamak için füzyon örneğini kısaca çalıştırın.
  4. Sıralama akışını merkezi olarak 8 kuyulu bir görüntüleme kabına hizalayın.
  5. FACS, çift pozitif mor ve uzak kırmızı etiketli hücreler olarak doğrudan 100 μL büyüme ortamı içeren 8-well görüntüleme çanak içine mevcut erimiş hücreleri sıralamak.
    NOT: Önerilen maksimum hücre sayısı 8 kuyulu çanak başına ~50.000'dir. Sıralama sırasında hücre sağlığından emin olun. Hücre birleşimi hücre sağlığını etkileyebilir, bu nedenle görüntüleme çanağı için uygun sayıda hücre yi sıralayarak hücreleri sıralama sonrası %20−90'lık birleştirme arasında tutun. Sıralanmış her damlacık yaklaşık 3 nL kılıf sıvısı içerir. Kılıf sıvısının sıralama sırasında büyüme ortamını önemli ölçüde sulandırmadığından emin olun.
  6. Sıralamadan hemen sonra hücreleri kuvöze geri götürün ve >2 saat veya gece boyunca bekleyin.
    NOT: Yapışık hücreler bu dönemde, sıralamadan itibaren, coverslip'e kademeli olarak yeniden yapışır ve bu nedenle doğrudan mikroskoba götürülürlerse morfolojileri zamanla değişir.

4. Hücre-Hücre Füzyonlarının İmmünofloresan Boyanışı ve Görüntüleme

NOT: Erimiş hücreler, gerekli deneylere ve ölçümlere bağlı olarak canlı olarak veya fiksasyon dan sonra ve daha fazla floresan boyama (veya her ikisi) görüntülenebilir.

  1. Canlı hücre görüntüleme
    1. Büyüme ortamını fenol kırmızısı olmadan görüntüleme ortamıyla değiştirin(Malzeme Tablosu)ve doğrudan görüntülemeye geçin.
  2. Fiksasyon ve boyama
    1. PBS'de taze %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
    2. Hücreleri 100 μL%4 PFA'da 15 dakika boyunca inkübederek düzeltin.
      DİkKAT: PfA bu adım uygun kişisel koruyucu ekipman ile bir duman başlık içinde yapılmalıdır bu yüzden solunduğunda toksiktir.
      NOT: Fiksasyondan sonra, deneme duraklatılmış ve gerekirse daha sonra yeniden başlatılabilir. Gerekirse numuneyi ışıktan korunan 4 °C'de saklayın.
    3. RT'de 200 μL PBS'de hücreleri 3x yıkayın.
    4. Hücreleri 200 μL'de RT'de 10 dakika boyunca permeabilize edin ve PBS'de seyreltilmiş %0,1 noniyonik yüzey aktif madde(Malzeme Tablosu)ve %0,1 niyonik deterjan (Malzeme Tablosu)ile seyreltilir.
    5. RT'de 30 dakika boyunca PBS'de %3 sığır serum albumininin 200 μL'sini bloke edin.
    6. 150 μL PBS'de %3 büyükbaş serum albumin, %0.1 nonionik yüzey aktif madde ve %0.05 niyonik deterjan içeren antikorlar ile inkübat.
      NOT: Temsili sonuçları oluşturmak için kullanılan birincil antikorlar floresan konjuge anti-GFP nanobody (1:400 seyreltme kullanılır) ve floresan konjuge anti-mScarlet-I nanobody (1:500 seyreltme kullanılır). Bu zaten floresan proteinlerin sinyalini artırmak.
    7. 300 μL PBS'de 5 dk boyunca 2x yıkayın ve 200 μL PBS'de bırakın.
      NOT: Örnekler PBS'de görüntülenir. Numuneler ışıktan korunan 4 °C'de saklanabilir.
  3. Görüntü edinimi
    1. Dört renkli görüntüleme (örneğin, konfokal, geniş alan, yapılandırılmış aydınlatma) yeteneğine sahip uygun bir floresan mikroskobu ile görüntüler elde edin.
    2. Sırasıyla 488 nm ve 561 nm dalga boyu lazerli meGFP ve mScarlet-I kanallarını heyecanlandırın. ~505−550 nm ve ~590−650 nm'de tespit etmek için dedektörleri ayarlayın. Sırasıyla 405 nm ve 633 nm lazerile mor ve uzak kırmızı boya kanallarını heyecanlandırın. ~430−500 nm ve ~660−750 nm'de dedektörleri ayarlayın.
    3. Ampirik olarak lazer yoğunluğunu önemli fotobeyazrlama nın oluşmadığını ve hücrelerin sağlıklı kaldığını (canlı hücre görüntülemesi durumunda) belirleyin.
    4. Piksel değerlerini doyruşmadan veya yapay olarak kırpmadan sinyalin elde edilen kazancı ampirik olarak belirleyin.
    5. Görüntülerin ~500 m adım boyutuyla 20−60 μm aralığını kapsayan üç boyutlu olması gibi Z destesi verilerini toplayın.
      NOT: Temsili verilerde gösterilen görüntüler konfokal (Şekil 2B), Havalandırıcı (Şekil 2C) veya yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (Şekil 2D) ile elde edilmiştir. Her hücre, sitoplazmada üst üste gelen hem menekşe hem de uzak kırmızı boyalar içeriyorsa iyi niyetli bir heterokaryondur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uygun şekilde etiketlenmiş hücreler akış sitometrisi sırasında floresan sinyali ile etiketlenmemiş kontrol hücrelerinden daha yüksek görünür(Şekil 2A). Kapılar çift pozitif hücrelerin ayıklanması için ayarlanmış, daha fazla mikroskobik analizler için görüntüleme yemekleri doğrudan bu popülasyon zenginleştirmek. Erimiş hücreler farklı çift floresan pozitif hücreler olarak saptanabilir ve nüfusun yaklaşık ~ 1% oluşturmaktadır.

Füzyon, iki hücrenin bir araya getirilmesi yoluyla hücresel mimarinin büyük bir şekilde yeniden düzenlenmesini sağlar (Şekil 2B). Heterokaryonlar mikroskop üzerinde, tek bir hücre içinde karıştırılan (plazma zarlarına müdahale etmeden) her iki floresan boya sinyali içeren hücreler olarak tanımlanır. Ayrıca, brightfield/diferansiyel girişim kontrastı veya floresan görüntüleme ile erimiş hücrelerde iki çekirdek görülebilir. Triploid veya diğer yüksek poliploid durumların diploid füzyonlara ek olarak mümkün olduğunu ve bu nedenle erimiş hücrelerin kimliğini doğrulamak için iki rengin boya sinyalinin kullanılması gerektiğini unutmayın.

Hücre yapısı ve fonksiyonu daha meGFP ve mScarlet-I etiketli proteinler içeren hücrelerin birleştirilmesi ile araştırılır. Füzyon iki hücrenin füzyon kaynaklanan heterokaryonlar içinde centrozom sayısının iki katına sonuçlanır. Böylece, floresan etiketli centrozomlu hücreler kaynaşmışsa, centrozsome perisentrioler bileşen NEDD1 floresan etiketli olduğunda en az dört perisentrioler malzeme foci gözlenir (NEDD1-mRuby3; Şekil 2C). Endojen floresan olarak etiketlenmiş rootletin (rootletin-meGFP ve rootletin-mScarlet-I) ile hücrelerin füzyon her sentrozom kökeni hücre heterokaryon tespit edilmesine olanak sağlar. Sanrozomal köklerde rootletin sınırlı difüzyonel cirosudur 24, ve bu nedenle floresan mikroskopi ile görüntülenmiş heterokaryonlarda belirgin renkli lifler olarak mevcuttur (Şekil 2D).

Figure 1
Şekil 1: Hücre-hücre füzyonu ve floresan görüntüleme deneysel iş akışı. Dört aşamalı deneysel iş akışının şeması. (1) İki hücre popülasyonu farklı olarak etiketlenir, boyalar ve floresan füzyon proteinleri ile. Camgöbeği mor hücre boyası ile boyama temsil eder ve macenta çok kırmızı hücre boyası ile boyama temsil eder. Yeşil meGFP etiketleme temsil eder ve kırmızı mScarlet-I etiketleme temsil eder. (2) Hücreler polietilen glikol ile kuluçka yoluyla eritilir. (3) Erimiş hücreler akış sitometrisi ile zenginleşerek çift floresan pozitif hücreleri (çok kırmızı ve menekşe) sıralarlar. (4) Erimiş hücreler, hücresel yapı ve fonksiyonun nasıl değiştiğini anlamak için floresan mikroskobu ile görüntülenir (yeşil ve kırmızı kanalların görüntülenmesi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Erimiş hücrelerin temsili akış sitometri zenginleştirme ve floresan görüntüleme. (A) Erimiş hücrelerin akış sitometrisinde kullanılan temsili gating stratejisi. Iki kat floresan erimiş hücreler siyah kare ile gösterilir. (B) Erimiş hücrelerin temsili konfokal floresan mikroskobu, çift menekşe ve uzak kırmızı boyalar ile etiketlenmiş. Tetraploid veya heksaploid (sırasıyla üst ve alt paneller) olan başarılı bir şekilde erimiş hücrelere örnekler gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) Endojen etiketli centozomal kökler (rootletin-meGFP) ve merkezomal perisentriolar malzeme (NEDD1-mRuby3) içeren tek bir erimiş hücrede centozomların temsili canlı hücre Airyscan konfokal görüntüleme. Ölçek çubuğu = 1 μm. (D) Endojen etiketli rootletin-meGFP'yi ifade eden hücreler, endojen etiketli rootletin-mScarlet-I'yi ifade eden hücrelerle kaynaştırıldı. Hücreler düzeltildi ve lekelendi ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi ile görüntülendi. Gösterilen bir erimiş hücrede centrozsomes maksimum yoğunluklu z-projeksiyon. Ölçek çubuğu = 1 μm. Panel D, Mahen24'ten izinle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücreleri eritmek ve hücre melezlerinin sonraki mimarisini mikroskopi ile görselleştirmek için kolay ve uygun maliyetli bir protokol gösteriyoruz, baştan sona yaklaşık iki gün sürüyor. Bu protokolün kritik bölümleri, erimiş hücrelerin hücre sıralaması (protokol bölüm 3) ile zenginleşmesi ve erimiş hücrelerin mikroskopi ile dikkatli bir şekilde doğrulanmasıdır (protokol bölümü 4). Bu bölümler, erimiş hücrelerin kolayca elde edilmesini ve iyi niyetli heterokaryonlar olmasını sağlar. Konsantrasyonlar ve kuluçka süreleri uyulmalıdır. Örneğin, daha yüksek konsantrasyonlarda veya daha uzun kuluçka sürelerinde kullanıldığında, hücre boyaları çok parlak olabilir ve akış sitometrisi veya floresan mikroskopisi sırasında dedektörleri doygunlaştırabilir veya görüntüleme koşullarına bağlı olarak çapraz emisyona neden olabilir. Bir akış sitometre yokluğunda, diğer teknolojiler çift antibiyotik seçimi27 ve mikroakışkan yakalama cihazları28dahil olmak üzere erimiş hücreleri zenginleştirme yeteneğine sahiptir. Ancak bu teknolojiler ya daha yavaştır ya da daha ısmarlama deneysel kurulum gerektirir.

Hücre füzyonunun diğer yöntemleri, burada açıklanan protokole göre avantajları ve dezavantajları vardır. Elektro-füzyon veya viral bazlı füzyon teknikleri bazı durumlarda füzyon sırasında mikroskopi ile görüntülenebilir8,29, füzyon sürecinin kendisi gözlemlemek için tercih edilirse onları iyi alternatifler yapma. Ancak, bu farklı yöntemler özel ekipman (elektrofüzyon ekipmanları veya viral transgenler gibi) gerektirebilir. Tüm hücre-hücre füzyon yöntemleri hücre sağlığını engelleme potansiyeline sahiptir. Viral bazlı füzyon yöntemleri genellikle PEG veya elektrofüzyon tarafından sağlanan geçici pertürbasyon aksine, viral transgenlerin sürekli ifade dayanır. PEG maruziyeti sonrası hücresel fusojenik potansiyel ve toksisite farklı hücre tiplerinde değişkendir27, ve dolayısıyla PEG kuluçka süresinin titrasyonu gerekebilir (protokol adım 2.4), artan PEG maruziyetinin hücre ölümünü artırdığını kabul ederken30. Hücre sağlığını en üst düzeye çıkarmak, kültür koşullarının dışında kalma süresini en aza indirir. Hücre sağlığı protokol sırasında sitometrede ileri dağılıma karşı yan dağılım ölçülmesi ve mikroskopi sırasında morfolojinin gözlemlenerek kontrol edilebilir.

Floresan etiketlerle diferansiyel etiketlemeye olanak sağlamak için deneysel tasarımın dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi esastır. En basit tasarım iki ayrı floresan etiket kullanmaktır. Ancak, endojen olarak ifade floresan füzyon proteinleri sık sık düşük ekspresyon düzeyi ve dolayısıyla açık bir şekilde akış sitometri veya tek hücre düzeyinde görüntüleme ile tespit etmek zordur. CRISPR Cas9 aracılı genom düzenleme ve boya bazlı boyama yöntemleri ile dört floresan etiket ekleyerek bu sınırlamayı aşan bir tasarım salıyoruz. Floresan problar birbirinden ayırt edilebilir farklı emisyon spektrumları olmalı ve tek bir hücre düzeyinde etiketlenmemiş hücrelerden ayırt etmek için yeterince parlak olmalıdır. Sondalar dışarıdan dağılmak yerine bir hücreye bağlı kalmalıdır. Hücre altı düzeyde dahili olarak geri döndürülemez bağlanma gerekli değildir, ancak istenebilir. Hücreler birleştikten sonra, hücresel bileşenlerin sürekli durum değişimi serbestçe oluşabilir. Kökler difüzyonel olarak stabil olduğundan, hücre tarihinin izlenmesine izin verirler, belirli bir centrozomun menşe hücresini tanımlarlar. Yöntemin olası bir değişiklik ilgi diğer hücresel yapıları etiketlemek için, ancak sabit durum meclisleri füzyon sonrası karıştırma potansiyeline sahip, hücre içi dinamiklerin oranına bağlı olarak(Şekil 2C).

Hücre-hücre füzyon hücresel mimaride benzersiz bir değişim neden olur17,19,24, etkileri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu hem protokolün bir sınırlaması hem de daha fazla araştırma için heyecan verici bir alandır. Plazma zarlarının heterokaryonlar31'detek bir yapıya kaynaşdığı açık olmakla birlikte, diğer hücresel yapıların nasıl tepki verdiği tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre füzyonu daha fazla nasıl organel füzyon ve fizyon farklı etiketli organeller in görüntüleme yoluyla düzenlenir anlamak için kullanılabilir24,32. Hücre füzyonu ile gelecekteki çalışma nasıl euploidy, organel sayısı ve hücresel boyut hücre fonksiyonu üzerinde impinges adresi olabilir. Anormal hücre füzyonu hastalık süreçlerinde, tümörlerde33 ve viral enfeksiyon10,17takip gözlenmiştir bu protokol aynı zamanda temel ve uygulamalı biyoloji de soruların bir dizi ele almak için kullanılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Wellcome Trust Henry Wellcome Bursu ile R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numarası 100090/12/Z) tarafından finanse edilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı. Ashok Venkitaraman ve Paul French'e proje hakkında eleştirel tavsiyeler ve rehberlik için teşekkür ederiz. Biz mükemmel destek için Cambridge Enstitüsü Tıbbi Araştırma Akış Cytometry tesisinde Chiara Cossetti ve Gabriela Grondys-Kotarba teşekkür ederiz. Taslağı doğruldukları için Liam Cassiday, Thomas Miller ve Gianmarco Contino'ya teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62554502
37% formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope Carl Zeiss
8-well imaging dishes Ibidi 80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody Chromotek gba-488
BD Influx Cell Sorter BD Biosciences
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Cell Filters (70 μm) Biofil CSS010070
CellTrace Far Red ThermoFisher Scientific C34572
CellTrace Violet ThermoFisher Scientific C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate ThermoFisher Scientific 31966021
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody NanoTag Biotechnologies N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium Sigma-Aldrich 21083027
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich 15140122
Phenol red free DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 21063029
Phosphate buffered saline (1x PBS) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 Sigma-Aldrich P7181
Polypropylene tubes BD Falcon 352063
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 nonionic surfactant
Trypsin Sigma-Aldrich T4049
Tween 20 Fisher BioReagents BP337 nonionic detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
  2. Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
  5. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
  6. Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
  7. Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
  8. Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
  9. Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
  10. Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
  11. Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
  12. Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
  13. Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
  14. Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
  15. Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
  16. Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
  17. Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
  18. Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
  19. Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
  20. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
  21. Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
  22. Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
  23. Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
  24. Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
  25. Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
  28. Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
  29. Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
  30. Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
  31. Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
  32. Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
  33. Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).

Tags

Gelişimbiyolojisi Sayı 154 hücre-hücre füzyonu sanrozom euploiy heterokaryon akış sitometrisi polietilen glikol (PEG) floresan mikroskobu organel fusojen
Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahen, R., Schulte, R. Cell-cellMore

Mahen, R., Schulte, R. Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function. J. Vis. Exp. (154), e60550, doi:10.3791/60550 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter