Summary
الغرض من هذا البروتوكول هو دمج نوعين مختلفين من الخلايا لإنشاء خلايا مختلطة. يستخدم تحليل المجهر الفلوري للخلايا المنصهرة لتتبع الخلية الاصليه للعضيات الخلوية. يمكن استخدام هذا الفحص لاستكشاف كيفيه استجابه البنية الخلوية والوظيفة للاضطراب بواسطة دمج الخلايا.
Abstract
الحياة مقسمه مكانيا داخل اغشيه الدهن للسماح بالتشكيل المعزول للدول الجزيئية المتميزة داخل الخلايا والأرغن. دمج الخلايا هو دمج خليتين أو أكثر لتشكيل خليه واحده. هنا نقدم بروتوكولا لدمج الخلايا من نوعين مختلفين من الخلايا. يتم إثراء الخلايا الهجينة تنصهر عن طريق الفرز القائم علي التدفق الخلوي ، تليها المجهر الفلوري من بنيه الخلية الهجينة وظيفة. فلوريسسينتلي الموسومة البروتينات المتولدة عن الجينوم التحرير هي الذين تتراوح أعمارهم داخل الخلايا تنصهر ، مما يسمح الهياكل الخلوية ليتم تحديدها علي أساس الانبعاثات فلوري والمشار اليها مره أخرى إلى نوع الخلية من أصل. ويمكن تطبيق هذه الطريقة القوية والعامة علي أنواع مختلفه من الخلايا أو العضيات من الفائدة ، لفهم بنيه الخلوية ووظيفتها عبر مجموعه من المسائل البيولوجية الاساسيه.
Introduction
الصيانة الساكنة للهيكل الخلوي أمر بالغ الاهميه للحياة. الخلايا لها مورفولوجيس المميزة ، والأرقام العضوية الفرعية الخلوية ، والتركيب البيوكيميائي الداخلي. فهم كيف يتم إنشاء هذه الخصائص الاساسيه وكيف انها تذهب منحرف اثناء المرض يتطلب أدوات مختبريه للاضطراب لهم.
انصهار الخلية هو دمج خليتين منفصلتين أو أكثر. قد يكون الانصهار الخلية الحاسمة لظهور حياه حقيقية النواة1. في جسم الإنسان ، والانصهار الخلية نادره نسبيا ، والتي تحدث خلال الظروف التنموية المقيدة وأنواع الانسجه ، مثل اثناء الإخصاب أو تشكيل العضلات والعظام والمشيمة2. يصف هذا البروتوكول الحث علي دمج خلايا الخلايا في خطوط خلايا ثقافة الانسجه مع الفلوريسسينتلي المسمية بشكل مختلف ، كاداه لفهم أليات التي تتحكم في بنيه الخلية ووظيفتها.
في المختبر المستحث خليه خليه الانصهار هو المركزي لإنتاج الأجسام المضادة الاحاديه3, أداه هامه للبحوث البيولوجية وعلاج الامراض. وقد استخدمت الخلية الانصهار أيضا لطرح العديد من الاسئله الحيوية المختلفة الخلية الاساسيه حول الهيمنة دوره الخلية4, انوبلويدي5,6, أعاده برمجه الخلوية7,8, إصلاح الخلايا العصبية التالفة9, انتشار الفيروسية10, موت الخلايا11, توتوريجينيسيس12 الأساليب المختبرية للحث علي خليه خليه الانصهار16،17،18،19 للحث علي التحام غشاء الدهن من خلال الدمج المادي لاثنين من البليرس في واحد. يمكن ان يسببها الانصهار الخلية بواسطة الكهرباء18، الفيروسية الطرق القائمة17، التدفئة الحرارية20، التعبير عبر الجينات19، والمواد الكيميائية بما في ذلك البولي إيثيلين غليكول (PEG)16،21،22.
سينتسوميس هي مراكز تنظيم المجهرية التي تتحكم في الشكل الخلوي ، والحركية ، والاستقطاب ، والقسمة23. جذور سينتسوال هي الهياكل الليفية التي تمتد من سينتسوميس التي تحتوي علي بروتين روتليتين24 (المشفرة من قبل الجينات crocc). وقد استخدمنا في الاونه الاخيره خلايا الخلية الانصهار لفهم كيف سينتريبعض الموقف وعدد يختلف داخل الاختلافات بالنسبة للخلايا الابويه24. الأساس المنطقي وراء استخدام هذه الطريقة هو لتتبع خليه المنشا من جذور داخل مغاير بعد الانصهار من فلوريسسينتلي بشكل مختلف الموسومة الخلايا الابويه ، التالي إلى صوره عضيه الانصهار والانشطار. فلوريسسينتلي الموسومة البروتينات روتليتين أو روتليتين يتم إنشاؤها بواسطة الجينوم التحرير في خطوط الخلايا منفصلة والتي تنصهر بعد ذلك عن طريق الربط بوساطة الخلية الانصهار. ونحن نقدم وصفا لاستخدام الاصباغ الخلوية (جدول المواد) لتحديد الخلايا المنصهرة من خلال القياس الخلوي للتدفق والتحديد المجهري اللاحق لخليه المنشا والتشكل (الشكل 1). هذا النهج هو وسيله قويه وفريدة من نوعها لدراسة كيفيه التغييرات الرئيسية في الدولة الخلوية بما في ذلك عدد عضيه يمس التوازن الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-وسم الخلايا الفلورية التفاضلية
- وضع العلامات الجينية مع CRISPR كاس 9
- استخدام CRISPR كاس 9 الجينوم التحرير إلى العلامة روتليتين (أو غيرها من الجينات الاهتمام) مع البروتينات الفلورية meGFP أو mScarlet في خطوط الخلايا السرطانية البشرية.
ملاحظه: وتغطي البروتوكولات المفصلة لتحرير المجين في مكان آخر24،25،26.
- استخدام CRISPR كاس 9 الجينوم التحرير إلى العلامة روتليتين (أو غيرها من الجينات الاهتمام) مع البروتينات الفلورية meGFP أو mScarlet في خطوط الخلايا السرطانية البشرية.
- وسم الصبغة الفلورية
- تنمو Cal51 الخلايا السرطانية البشرية في المتوسطة دولبيكو النسر المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل البقر الجنين (الدم) ، L-الجلوتامين ، و 100 ميكروغرام/مل البنسلين/ستربتوميسين في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 في حاضنه ترطيب.
ملاحظه: من المهم التاكد من ان يتم فحص الخلايا بانتظام لعدم وجود تلوث الميكوبلازما ، ولهويه خط الخلية. لا تستخدم الخلايا التي تم تمريرها علي نطاق واسع في الثقافة (> 15 المقاطع). يجب ان تكون الخلايا صحية وتنمو باطراد. تجنب الكونفلوينسي أو الإفراط في الكونفلوينسي. - البذور كل نوع الخلية (روتليتين ، روتليتين-mScarlet والابويه Cal51 الخلايا غير الموسومة) مثل ان ~ 6 × 106 خلايا موجودة في اليوم التالي لكل عينه ، في كونفلوينسي من 70 − 90 ٪.
ملاحظه: هذا هو ما يقرب من واحد T75 الانسجه الثقافة قارورة أو 1 10 سم طبق لكل نوع الخلية. الخلايا غير الموسومة الابويه مطلوبه كعنصر تحكم سالب لاحقا في البروتوكول. يسمح هذا البروتوكول لإنتاج الخلايا المنصهرة ~ 20,000 ، ولكن يمكن زيادة هذا العدد من خلال توسيع البروتوكول مع عدد متزايد من الدفعات. - في اليوم التالي ، الدافئة DMEM ، التريبسين و 1x الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) عن طريق وضعها في حمام مائي في 37 درجه مئوية.
- غسل روتليتين-meGFP و روتليتين-mScarlet-انا الخلايا 2x في الاذاعه التلفزيونية عن طريق صب أو الشفط قباله المتوسطة واستبدال مع 10 مل من تلفزيوني.
- تسميه Cal51 روتليتين-meGFP الخلايا عن طريق أضافه 500 nM البنفسجي صبغالخلية (جدول المواد) في تلفزيوني لمده 1 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
- تسميه Cal51 روتليتين الخلايا عن طريق أضافه 200 nM الحمراء البعيدة صبغالخلية (جدول المواد) في الاذاعه التلفزيونية لمده 1 دقيقه في RT.
ملاحظه: إبقاء عينات محمية من الضوء حيثما أمكن بعد تلطيخ الفلورسنت ، لتجنب التسرب الضوئي من فلوري. - وقف ردود الفعل وسم الصبغة عن طريق أضافه 10 مل من DMEM لمده 5 دقائق.
- أزاله الخلايا Cal51 الابويه غير المسمية من الحاضنة (من الخطوة 1-2-2).
ملاحظه: سيتم استخدام هذه الخلايا لاحقا كعناصر تحكم سالبه غير مسماه (الخطوة 3-3-2). - غسل جميع الخلايا مره واحده عن طريق سكب المتوسطة النمو واستبدال مع 10 مل من تلفزيوني.
- صب قباله تلفزيوني واحتضان لمده 5 دقيقه في الظروف الثقافية مع 1 مل من قبل الحرارة 1x التريبسين.
- نقل الخلايا إلى 15 مل من البلاستيك أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 1000 x g لمده 5 دقائق.
- أزاله التريبسين بعناية وتجاهلها من بيليه الخلية مع ماصه.
- أعاده التعليق برفق البنفسجي والأحمر البعيد الكريات الخلية الموسومة في 1 مل من تلفزيوني.
- بلطف أعاده تعليق الابويه (غير فلوري) الخلية بيليه في 1 مل من DMEM والعودة إلى الحاضنة.
ملاحظه: لن تخضع هذه العينة لدمج خلايا الخلايا ولكن سيتم استخدامها لاحقا اثناء قياس التدفق الخلوي.
- تنمو Cal51 الخلايا السرطانية البشرية في المتوسطة دولبيكو النسر المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل البقر الجنين (الدم) ، L-الجلوتامين ، و 100 ميكروغرام/مل البنسلين/ستربتوميسين في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 في حاضنه ترطيب.
2. خليه الخلية فيوجن
- مزيج 3 × 106 البنفسجي الخلايا الموسومة مع 3 × 106 الأحمر البعيد الخلايا الموسومة في أنبوب 15 مل عن طريق الأنابيب بلطف معا 0.5 مل من كل نوع خليه باستخدام ماصه 1 مل.
- الطرد المركزي الخلايا غير المختلطة المتبقية من الخطوة 2.1 في 1,000 x ز لمده 5 دقائق ، ثم تصب قباله تلفزيوني ، أعاده تعليق بيليه في 1 مل من dmem والعودة إلى الحاضنة.
ملاحظه: ستستخدم هذه العينات المتبقية غير المختلطة التي تحمل علامة واحده فيما بعد كضوابط سلبيه وللتعويض في القسم 3 من البروتوكول. - الطرد المركزي الخلايا المختلطة من الخطوة 2.1 في 1,000 x ز لمده 5 دقيقه ويستنشق بعناية التلفزيونية باستخدام ماصه 1 مل.
- أضافه 0.7 mL من 50 ٪ 1450 الحل PEG في الأزياء القطرة إلى بيليه الخلية (الخطوة 2.3) باستخدام 1 مل ماصه علي مدي فتره 30 ثانيه.
- ترك ل 3.5 دقيقه في RT.
ملاحظه: قد يكون الأمثل وقت الحضانة مع PEG اعتمادا علي نوع الخلية ، علي الرغم من ملاحظه ان وقت الحضانة أطول يزيد من سميه الخلية. - أضافه 10 مل من المصل خاليه من القطرات DMEM لمده 30 ثانيه وترك في الحاضنة لمده 10 دقيقه.
- تدور في 1,000 x g لمده 5 دقائق ، وتجاهل supernatant ، وأعاده التعليق برفق في 1 مل من المتوسطة الكاملة (dmem التي تحتوي علي المنفذة).
ملاحظه: انتقل مباشره إلى القسم 3. هناك سميه المرتبطة بالتعرض PEG تليها تدفق الخلوية والتصوير ، لذلك الحفاظ علي الخلايا في ظروف الثقافة قدر الإمكان عن طريق المضي قدما بسرعة بين الخطوات.
3-الفرز الخلوي المنشط الفلوري (FACS) لإثراء الخلايا المنصهرة
- اعداد جميع الخلايا لقياس التدفق الخلوي عن طريق الأنابيب بلطف كل عينه بشكل منفصل من خلال فلتر 70 μm في أنبوب FACS.
ملاحظه: مطلوب أربعه عينات: الخلايا تنصهر ، واحده الخلايا الحمراء البعيدة ، والخلايا البنفسجية الموسومة واحده ، والخلايا الابويه غير مسماه. وبمجرد ازالتها من غطاء النسيج النسيجي المعقم ، فان الخلايا لديها القدرة علي الاصابه بالعدوى ، التالي تقليل وقت التعرض للعينات إلى بيئة غير معقمه من هنا فصاعدا. يتم فرز الخلايا في متوسط DMEM كامله. - استخدام مقياس الخلايا قادره علي الفرز خليه واحده.
- قم باعداد فأرز الخلية لفرز عقيم. تنفيذ مراقبه جوده الجهاز وفقا لتوصيه الشركة المصنعة.
- رسم مؤامرة من مبعثر إلى الامام مبعثر مقابل الجانب ومؤامرة التمييز صدر.
- إنشاء بوابات للتعرف علي الخلايا المنصهرة.
- تثير الاصباغ الفلورية في أطوال موجية من 405 نانومتر و 635 nm. كشف في 450 نانومتر و 660 nm (البنفسجي وأطوال الموجات الحمراء البعيدة ، علي التوالي). مؤامرة الأحمر البعيد مقابل موجات البنفسج.
- تشغيل الخلايا الابويه غير المسمية من خلال المضخم الخلوي وتسجيل كثافة الفلورية.
ملاحظه: القيم فوق هذا الخط الأساسي تعريف الايجابيه لتلطيخ صبغ. - تشغيل الخلايا البنفسجية واحده الموسومة من خلال المضخم الخلوي. تاكد من عدم وجود تسرب من البنفسج إلى القناة الحمراء البعيدة.
- تشغيل واحد الموسومة الخلايا الحمراء البعيدة من خلال المضخم الخلوي وتاكيد انه لا يوجد اي انسكاب أكثر من الأحمر البعيد في القناة البنفسجية.
ملاحظه: للبيانات التمثيلية المبينة ، تم فرز الخلايا في 20 رطل علي فأرز مجهز بفوهة 100 μm. - باختصار تشغيل نموذج الانصهار للتاكد من ان الخلايا تنصهر مرئية مع البوابات التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.3.
- محاذاة تيار الفرز مركزيا في صحن التصوير 8-حسنا.
- FACS فرز الخلايا المنصهرة ، والحاضر كما البنفسج الايجابيه مزدوجة والحمراء بعيده الخلايا الموسومة مباشره في صحن التصوير 8-البئر التي تحتوي علي 100 μL من متوسط النمو.
ملاحظه: الحد الأقصى لعدد الخلايا الموصي بها هو ~ 50,000 لكل طبق 8-حسنا. تاكد من صحة الخلايا اثناء الفرز. يمكن لكونفلوينسي الخلوية ان تؤثر علي صحة الخلايا ، وبذلك تبقي الخلايا بين 20 − 90% كونفلوينسي بعد الفرز عن طريق فرز عدد مناسب من الخلايا لطبق التصوير. كل قطره مفروزه تحتوي علي حوالي 3 nL من السائل غمد. تاكد من ان السائل الغمد لا يخفف بشكل كبير من متوسط النمو اثناء الفرز. - مباشره بعد الفرز ، واتخاذ الخلايا مره أخرى إلى الحاضنة وترك ل > 2 ح أو بين عشيه وضحيها.
ملاحظه: ستقوم الخلايا الملتصقة باعاده التصاق بها تدريجيا خلال هذه الفترة ، من الفرز فصاعدا ، التالي ستتغير المورفولوجية مع مرور الوقت إذا أخذت مباشره إلى المجهر.
4. تلطيخ المناعة والتصوير من خليه الخلية اندماج
ملاحظه: يمكن ان تكون الخلايا المنصهرة حيه أو بعد التثبيت والمزيد من تلطيخ الفلورسنت (أو كليهما) ، اعتمادا علي التجارب والقياسات المطلوبة.
- تصوير الخلايا الحية
- استبدل متوسط النمو بالتصوير المتوسط بدون الفينولالأحمر (جدول المواد) وانتقل مباشره إلى التصوير.
- التثبيت وتلطيخ
- اعداد الطازجة 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الاذاعه التلفزيونية.
- إصلاح الخلايا عن طريق احتضان لهم في 100 μL من 4 ٪ PFA لمده 15 دقيقه في RT. أزاله PFA بعد 15 دقيقه.
تحذير: PFA هو سامه عند استنشاقه لذلك يجب ان يتم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
ملاحظه: بعد التثبيت ، يمكن إيقاف التجربة مؤقتا وأعاده تشغيلها لاحقا إذا لزم الأمر. تخزين العينة في 4 درجه مئوية محمية من الضوء إذا لزم الأمر. - غسل الخلايا 3x في 200 μL من تلفزيوني في RT.
- تتخلل الخلايا لمده 10 دقيقه في RT في 200 μL من 0.1 ٪ السطحي غير الايونيه (جدول المواد) و 0.1 ٪ المنظفات غير الايونيه (جدول المواد) المخفف في الاذاعه التلفزيونية.
- كتله في 200 μL من 3 ٪ الزلال المصل البقري في الاذاعه التلفزيونية لمده 30 دقيقه في RT.
- احتضان مع الأجسام المضادة في 150 μL من تلفزيوني يحتوي علي 3 ٪ الزلال المصل البقري و 0.1 ٪ السطحي غير الايونيه و 0.05 ٪ المنظفات غير الايونيه ل 1 ح في RT.
ملاحظه: الأجسام المضادة الرئيسية المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية هي فلوريسسينتلي المضادة لل GFP nanobody (المستخدمة في تخفيف 1:400) ، وفلوريسسينتلي مترافق المضادة-mScarlet-انا nanobody (المستخدمة في 1:500 التخفيف). هذه تعزز اشاره البروتينات الفلورية بالفعل. - غسل 2x لمده 5 دقائق في 300 μL من تلفزيوني ومن ثم ترك في 200 μL من تلفزيوني.
ملاحظه: عينات [ايمسن] في [ببس]. يمكن تخزين العينات في 4 درجه مئوية محمية من الضوء.
- اكتساب الصور
- الحصول علي الصور مع المجهر مضان المناسبة قادره علي التصوير أربعه ألوان (علي سبيل المثال ، confocal ، الاضاءه المنظمة).
- تثير القناات meGFP و mScarlet انا مع 488 nm و 561 nm الطول الموجي الليزر ، علي التوالي. ضبط للكشف عن في ~ 505 − 550 نانومتر و ~ 590 − 650 نانومتر. تثير البنفسج والأحمر البعيد صبغ القناات مع 405 nm و 633 nm الليزر ، علي التوالي. ضبط للكشف عن في ~ 430 − 500 نانومتر و ~ 660 − 750 نانومتر.
- يحدد بشكل تجريبي كثافة الليزر بحيث لا يحدث الرشح الضوئي كبيره وان الخلايا لا تزال صحية (إذا التصوير الخلوي الحي).
- تحديدا تجريبيا كسب مثل هذه الاشاره يتم الحصول عليها دون تشبع أو قطع بشكل مصطنع القيم بكسل.
- جمع البيانات Z-المكدس ، بحيث تكون الصور ثلاثية الابعاد ، وتغطي مجموعه من 20 − 60 μm مع ~ 500 μm حجم الخطوة.
ملاحظه: وقد تم الحصول علي الصور المعروضة في البيانات التمثيلية اما عن طريق التنسيق (الشكل 2ب) أو airyscan (الشكل 2ج) أو المجهر الضوئي المنظم (الشكل 2د). كل خليه غير متجانسة حسن النية إذا كان يحتوي علي كل من الاصباغ البنفسجية والحمراء البعيدة تتداخل في السيتوبلاسما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا الموسومة بشكل مناسب مرئية اثناء التدفق الخلوي عن طريق اشاره مضان اعلي من خلايا التحكم غير المسمية (الشكل 2ا). يتم تعيين غيتس لفرز الخلايا الايجابيه المزدوجة ، وإثراء هذا الشعب مباشره في اطباق التصوير لمزيد من التحاليل المجهرية. الخلايا المنصهرة قابله للكشف كخلايا فلوريسسينتليه مزدوجة متميزة وتشكل حوالي ~ 1% من السكان.
الانصهار يحفز أعاده ترتيب العمارة الخلوية الرئيسية من خلال خلط خليتين في واحد (الشكل 2ب). يتم التعرف علي المجاهر المغايرة علي المجهر كخلايا تحتوي علي كل من إشارات الصبغة الفلورية الممزوجة داخل خليه واحده (بدون اغشيه البلازما المتداخلة). بالاضافه إلى ذلك ، قد تكون النواتين مرئيتين في الخلايا المنصهرة بواسطة التباين العصبي/التداخل التفاضلي أو التصوير الفلوري. لاحظت ان [تريبلويد] أو أخرى أكثر جدا [بولبلويد] دول يمكن [أين ديايشن] إلى [ديبلويد] اندماج مهما, ولذلك صبغ اشاره من اثنان لون سوفت كنت استعملت ان يؤكد الهوية من تنصهر خلايا.
يتم التحقيق في هيكل الخلية ووظيفتها من خلال دمج الخلايا التي تحتوي علي meGFP و mScarlet-انا الموسومة البروتينات. ينتج انصهار في يضاعف من ال [سنتريبعض نومبر] داخل [هكلورينس] ينتج من الانصهار من اثنان خلايا. التالي ، إذا تم تنصهر الخلايا مع فلوريسسينتلي المسمية سينتسوميس ، فان أربعه بيريسينتريولار علي الأقل من البؤر المادية تلاحظ عندما فلوريسسينتلي العنصر البيريسينتريولار الوسطي NEDD1 معلمه (NEDD1-mRuby3 ؛ الشكل 2(ج). انصهار الخلايا مع اندوجينوسلي فلوريسسينتلي الموسومة روتليتين (روتليتين-megfp و روتليتين-mscarlet) يسمح للخلية الأصل من كل سينتبعض ليتم تحديدها في مغاير. روتليتين في جذور سينتسوميد محدوده دوران24، التالي موجودة كما ألياف الملونة واضح في غير المتجانسة مع المجهر مضان (الشكل 2د).
الشكل 1: دمج الخلايا الخلوية والتصوير الشعاعي لسير العمل التجريبي. تخطيطي لسير العمل التجريبي من أربع مراحل. (1) يتم تصنيف اثنين من الخلايا السكانية باختلافات ، مع الاصباغ والبروتينات الانصهار الفلورسنت. السماوي يمثل تلطيخ مع صبغ الخلية البنفسجية والأرجواني يمثل تلطيخ مع صبغه الخلية الحمراء البعيدة. يمثل الأخضر علامات meGFP ويمثل الأحمر علامات mScarlet. (2) تنصهر الخلايا من خلال الحضانة مع جلايكول البولي إيثيلين. (3) يتم إثراء الخلايا تنصهر من قبل تدفق الخلوية ، وفرز الخلايا الايجابيه فلوريسسينتلي مزدوجة (الأحمر والبنفسجي بكثير). (4) الخلايا تنصهر بواسطة المجهر مضان لفهم كيف يتم تغيير الهيكل الخلوي ووظيفة (التصوير القناات الخضراء والحمراء). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إثراء التدفق الخلوي التمثيلي والتصوير الفلوري للخلايا المنصهرة. (ا) الاستراتيجية التمثيلية المستخدمة في فرز الخلايا المنصهرة في التدفق الخلوي. يتم الاشاره إلى الخلايا المنصهرة الفلورية المضاعفة بالمربع الأسود. (ب) المجهر البؤري المحوري التمثيلي للخلايا المنصهرة ، والمزدوجة الموسومة بالبنفسج والاصباغ الحمراء البعيدة. تظهر أمثله للخلايا المنصهرة بنجاح ، والتي هي اما رباعيه اللون أو هيكابليد (لوحات علويه وسفليه علي التوالي). شريط مقياس = 10 μm. (ج) الخلية التمثيلية airyscan التصوير البؤري من سينتسوميس في خليه واحده تنصهر التي تحتوي علي الموسومة اندوجينوسلي الجذور الوسطي (روتليتين) والمواد بيريسينتريولار سينتسوكال (NEDD1-mRuby3). شريط مقياس = 1 μm. (د) تم صهر الخلايا التي تعبر عن الموسومة باللواصق روتليتين-megfp مع الخلايا التي تعبر عن الموسومة اندوجينوسلي روتليتين-mscarlet. وكانت الخلايا ثابته وملطخه بالمجهر المجهري للاضاءه المهيكلة. يظهر هو الحد الأقصى--الكثافة z--الإسقاط من سينتسوميس في خليه واحده تنصهر. شريط مقياس = 1 μm. تم تعديل اللوحة D من mahen24 باذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ونحن نظهر بروتوكولا سهل الاستخدام وفعالا من حيث التكلفة لدمج الخلايا وتصور البنية اللاحقة للخلايا الهجينة مع المجهر ، مع أخذ ما يقرب من يومين من البداية إلى النهاية. والأجزاء الهامه من هذا البروتوكول هي إثراء الخلايا المنصهرة حسب فرز الخلايا (القسم 3 من البروتوكول) ، والتحقق الدقيق من الخلايا المنصهرة بواسطة المجهر (القسم 4 من البروتوكول). تضمن هذه الأقسام ان الخلايا المنصهرة يتم الحصول عليها بسهوله وهي غير متجانسة النية. وينبغي التزام بالتركيزات وأوقات الحضانة. علي سبيل المثال ، عند استخدامها في تركيزات اعلي أو مع أوقات الحضانة أطول ، يمكن ان تكون الاصباغ الخلوية مشرقه جدا وتشبع الكاشفات اثناء التدفق الخلوي أو المجهر الفلوري ، أو تسبب الانبعاثات المتقاطعة اعتمادا علي ظروف التصوير. في غياب تدفق الخلوي ، والتكنولوجيات الأخرى قادره علي إثراء الخلايا المنصهرة ، بما في ذلك اختيار المضادات الحيوية المزدوجة27 والاجهزه الملائمة ميكروفلويديك28. ومع ذلك ، فان هذه التقنيات اما إبطا أو تتطلب اعدادا تجريبيا أكثر تفصيلا.
طرق أخرى من الانصهار الخلية لها مزايا وعيوب بالمقارنة مع البروتوكول الموصوف هنا. تقنيات الانصهار الكهربائية أو القائمة علي الفيروسية قد تكون في بعض الحالات بالمجهر المجهري خلال الانصهار8،29، مما يجعلها بدائل جيده إذا كان من الأفضل لمراقبه عمليه الانصهار نفسها. ومع ذلك ، قد تتطلب هذه الطرق المختلفة معدات متخصصة (مثل معدات الصهر الكهربائي أو الجينات الفيروسية). جميع الخلايا خليه الانصهار الأساليب لديها القدرة علي التعدي علي صحة الخلية. تعتمد أساليب الانصهار الفيروسية عموما علي التعبير المستمر عن الجينات الفيروسية ، علي النقيض من الاضطرابات العابرة التي يوفرها PEG أو الانصهار الكهربي. الطاقة الخلوية المحتملة وسميه بعد التعرض PEG متغير في أنواع الخلايا المختلفة27، التالي المعايرة من الوقت الحاضنة peg قد تكون مطلوبه (بروتوكول الخطوة 2.4) ، في حين الاعتراف بان زيادة التعرض peg يزيد من موت الخلية30. تعظيم صحة الخلايا أمر بالغ الاهميه من خلال الحفاظ علي الوقت خارج الظروف الثقافية إلى الحد الأدنى. يمكن فحص صحة الخلايا اثناء البروتوكول عن طريق قياس التشتت الامامي مقابل التشتت الجانبي عند المقياس المضخم للخلايا ومن خلال مراقبه المورفولوجية اثناء المجهر.
ومن الضروري النظر بعناية في التصميم التجريبي للسماح بالوسم التفاضلي بعلامات الفلورسنت. ابسط تصميم يستخدم اثنين من تسميات الفلورسنت منفصلة. ومع ذلك ، وأعرب اندوجينوسلي البروتينات الانصهار الفلورسنت في كثير من الأحيان من مستوي منخفض التعبير ، التالي من الصعب الكشف بشكل لا لبس فيه عن طريق تدفق الخلوي أو التصوير علي مستوي خليه واحده. نحن نقدم التصميم الذي يتغلب علي هذا القيد بما في ذلك أربعه العلامات الفلورسنت مع CRISPR كاس 9-بوساطة الجينوم التحرير والصبغ القائم علي أساليب تلطيخ. يجب ان يكون لتحقيقات الفلورسنت أطياف انبعاث متميزة يمكن تمييزها عن بعضها البعض وتكون مشرقه بما يكفي للتمييز بين الخلايا غير المسمية علي مستوي خليه واحده. ويجب ان تظل التحقيقات مرتبطة بخليه بدلا من تبديدها خارجيا. وإلزام الداخلي الذي لا رجعه فيه علي المستوي دون الخلوي ليس ضروريا ولكنه قد يكون مستصوبا. بمجرد دمج الخلايا ، يمكن ان يحدث تبادل الحالة الثابتة للمكونات الخلوية بحريه. وبما ان جذورها مستقره ، فانها تسمح بتتبع التاريخ الخلوي ، وتحديد الخلية الاصليه لأحد الخلايا الوسطي المعطية. ومن التعديلات المحتملة للأسلوب هو وضع علامات علي الهياكل الخلوية الأخرى ذات الاهميه ، ولكن تجمعات الحالة الثابتة لديها القدرة علي المزج بعد الانصهار ، اعتمادا علي معدل ديناميات الخلايا (الشكل 2ج).
الخلايا خليه الانصهار يؤدي إلى تغيير فريد في العمارة الخلوية17،19،24، والآثار التي لا تزال غير مفهومه تماما. وهذا يشكل حدا للبروتوكول ومجالا مثيرا لمزيد من التحقيق. علي الرغم من انه من الواضح ان اغشيه البلازما الصمامات في هيكل واحد في غير المتجانسة31, كيف الأخرى الهياكل الخلوية الاستجابة غير مفهومه بشكل سيئ. خليه انصهار استطاع كنت استعملت ان أيضا فهمت كيف [ارغريل] انصهار وانشطار يكون نظمت من خلال التصوير من [ديفرنتيلي] يوصف [ارغنيل]24,32. العمل في المستقبل مع الانصهار الخلية يمكن ان تعالج كيف يوبلويدي ، عدد عضيه وحجم الخلوية يمس علي وظيفة الخلية. منذ الانصهار الخلايا غير الطبيعية وقد لوحظ في عمليات المرض ، في الأورام33 وبعد العدوى الفيروسية10،17، هذا البروتوكول هو أيضا من استخدام لمعالجه مجموعه من الاسئله في البيولوجيا الاساسيه والتطبيقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة هنري ويلكوم الاستئمانية لR.M. (https://wellcome.ac.uk/grant number 100090/12/Z). ولم يكن لهذا الممول اي دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات وتحليلها ، واتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو اعدادها. نشكر أشوك فينكيارامان وبول الفرنسية علي المشورة النقدية والتوجيه بشان المشروع. نشكر كيارا كوستيستي وغابرييلا غروندريس-كواربه في معهد كامبردج للبحوث الطبية التدفق الخلوي المرفق للحصول علي دعم ممتاز. نشكر ليام كاسيداي ، توماس ميلر ، وججيانماركو كونتيو لتصحيح المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70 μm) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
