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Developmental Biology

सेलुलर संरचना और समारोह के क्षोभ के लिए जीनोम संपादित सेल लाइनों के सेल सेल फ्यूजन

Published: December 7, 2019 doi: 10.3791/60550
Automatic Translation
1,2, 3
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2The Medical Research Council Cancer Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge, 3Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य हाइब्रिड कोशिकाओं को बनाने के लिए दो अलग-अलग सेल प्रकारों को फ्यूज करना है। सेलुलर ऑर्गेनेल्स की उत्पत्ति की कोशिका को ट्रैक करने के लिए फ्यूज्ड कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण का उपयोग किया जाता है। इस परख का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि सेल फ्यूजन द्वारा क्षोभ का जवाब कैसे सेलुलर संरचना और कार्य करते हैं।

Abstract

जीवन को कोशिकाओं और ऑर्गेनेल्स के अंदर अलग-अलग आणविक राज्यों के अलग-अलग गठन की अनुमति देने के लिए लिपिड झिल्ली के भीतर स्थानिक रूप से विभाजित किया जाता है। सेल फ्यूजन एक ही सेल बनाने के लिए दो या दो से अधिक कोशिकाओं का विलय है। यहां हम दो अलग-अलग सेल प्रकारों के सेल फ्यूजन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। फ्यूज्ड हाइब्रिड कोशिकाएं फ्लो साइटोमेट्री-आधारित छंटाई से समृद्ध होती हैं, जिसके बाद हाइब्रिड सेल संरचना और कार्य की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी होती है। जीनोम संपादन द्वारा उत्पन्न फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन को फ्यूज्ड कोशिकाओं के अंदर चित्रित किया जाता है, जिससे सेलुलर संरचनाओं को फ्लोरेसेंस उत्सर्जन के आधार पर पहचाना जा सकता है और कोशिका प्रकार की उत्पत्ति के संदर्भ में वापस जाना जाता है। इस मजबूत और सामान्य विधि को विभिन्न सेल प्रकारों या ब्याज के ऑर्गेनेल्स पर लागू किया जा सकता है, ताकि सेलुलर संरचना को समझा जा सके और मौलिक जैविक प्रश्नों की एक श्रृंखला में कार्य किया जा सके।

Introduction

सेलुलर संरचना का होम्योस्टैटिक रखरखाव जीवन के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं में विशिष्ट मॉर्फोलोजी, उप-सेलुलर ऑर्गेनेल नंबर और आंतरिक जैव रासायनिक संरचना होती है। यह समझना कि ये मौलिक गुण कैसे उत्पन्न होते हैं और रोग के दौरान वे कैसे धराशायी हो जाते हैं, उन्हें बेफिक्र करने के लिए प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है।

सेल फ्यूजन दो या दो से अधिक अलग कोशिकाओं का विलय है। सेल फ्यूजन यूकेरियोटिक जीवन के उद्भव के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है1। मानव शरीर में, सेल संलयन अपेक्षाकृत दुर्लभ है, प्रतिबंधित विकासात्मक परिस्थितियों और ऊतक प्रकारों के दौरान होने वाली, जैसे निषेचन के दौरान या मांसपेशियों, हड्डी और प्लेसेंटा2का गठन। यह प्रोटोकॉल कोशिका संरचना और कार्य को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए एक उपकरण के रूप में, अलग-अलग फ्लोरोसेंटी लेबल ऑर्गेनेल्स के साथ ऊतक संस्कृति सेल लाइनों में सेल-सेल फ्यूजन को शामिल करने का वर्णन करता है।

इन विट्रो प्रेरित सेल-सेल फ्यूजन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी3के उत्पादन के लिए केंद्रीय है, जो जैविक अनुसंधान और रोग उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। सेल फ्यूजन का उपयोग सेल चक्र प्रभुत्व4, एन्यूप्लाइडी5,6, सेलुलर रीप्रोग्रामिंग7,8, क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स9, वायरल प्रसार10, एपोप्टोसिस11, ट्यूमरिजन12 , साइटोस्केलेटल डायनेमिक्स13और झिल्ली फ्यूजन14,15के बारे में कई अलग - अलग मौलिक कोशिका जैविक प्रश्न पूछने के लिए भी किया गया है । प्रयोगशाला आधारित तरीके सेल-सेल फ्यूजन16,17,18,19 को दो बाइलेयर के भौतिक विलय के माध्यम से लिपिड झिल्ली को संजाद करते हैं। सेल फ्यूजन को बिजली18,वायरल आधारित विधियों17,थर्मोप्लास्मोनिक हीटिंग20,ट्रांसजीन अभिव्यक्ति19और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)16,21,22सहित रसायनों से प्रेरित किया जा सकता है।

सेंट्रोसोम्स सेलुलर आकार, गतिशीलता, ध्रुवीकरण और डिवीजन23को नियंत्रित करने वाले माइक्रोट्यूबबुल आयोजन केंद्र हैं। सेंट्रोसोमल जड़ें प्रोटीन रूटलेटिन24 (जीन सीआरओसीसीद्वारा एन्कोड) युक्त सेंट्रोसोम्स से फैली रेशेदार संरचनाएं हैं। हमने हाल ही में सेल-सेल फ्यूजन का उपयोग यह समझने के लिए किया कि माता-पिता की कोशिकाओं24के सापेक्ष हेट्रोकेरियान के अंदर सेंट्रोसोम की स्थिति और संख्या कैसे भिन्न होती है। इस विधि के उपयोग के पीछे तर्क अलग फ्लोरोसेंटी टैग माता पिता की कोशिकाओं के संलयन के बाद एक विषमता के भीतर जड़ों की उत्पत्ति की कोशिका को ट्रैक करने के लिए है, और इस प्रकार छवि ऑर्गेनेल संलयन और विखंडन के लिए । फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन रूटलेटिन-मेजीएफपी या रूटलेटिन-एमस्लेट-आई अलग सेल लाइनों में जीनोम संपादन द्वारा बनाए जाते हैं जो तब खूंटी-मध्यस्थता सेल फ्यूजन द्वारा जुड़े होते हैं। हम कोशिका रंगों(सामग्री की तालिका)के उपयोग का वर्णन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री और बाद में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी पहचान मूल और आकृति विज्ञान(चित्रा 1)के सेंट्रोसोम सेल की पहचान द्वारा जुड़े कोशिकाओं की पहचान करने के लिए । यह दृष्टिकोण यह अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और अनूठी विधि है कि सेल होमोस्टोसिस पर ऑर्गेनेल नंबर सहित सेलुलर राज्य में बड़े बदलाव कैसे होते हैं।

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Protocol

1. अंतर फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग

  1. CRISPR Cas9 के साथ जीन टैगिंग
    1. मानव कैंसर सेल लाइनों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन meGFP या mScarlet-I के साथ रूटलेटिन (या ब्याज के अन्य जीन) टैग करने के लिए CRISPR Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करें।
      नोट: जीनोम संपादन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉलकहींऔर कवर किए गए हैं 24,25,26.
  2. फ्लोरोसेंट डाये लेबलिंग
    1. Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में Cal51 मानव कैंसर कोशिकाओं को विकसित करें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), एल-ग्लूटामाइन, और 100 μg/mL पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 में एक आर्द्र इनक्यूबेटर में पूरक हैं।
      नोट: यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को नियमित रूप से माइकोप्लाज्मा संदूषण की अनुपस्थिति के लिए और सेल लाइन की पहचान के लिए जांच की जाती है। उन कोशिकाओं का उपयोग न करें जिन्हें बड़े पैमाने पर संस्कृति (>15 मार्ग) में पारित किया गया है। कोशिकाओं को स्वस्थ और तेजी से बढ़ रहा होना चाहिए । अंडर-कन्फ्लनरी या ओवर-कन्फ्लनस से बचें।
    2. प्रत्येक सेल प्रकार (रूटलेटिन-मेजीएफपी, रूटलेटिन-एमस्रेड-1 और माता-पिता अनटैग्ड कैल51 कोशिकाएं) बीज करें कि ~ 6 x 106 कोशिकाएं प्रत्येक नमूने के लिए अगले दिन 70−90% की प्रवाह पर मौजूद हैं।
      नोट: यह लगभग एक T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क या सेल प्रकार प्रति 10 सेमी पकवान है। माता-पिता की अनटैग कोशिकाओं को प्रोटोकॉल में बाद में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में आवश्यक है। यह प्रोटोकॉल ~ 20,000 फ्यूज्ड कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, लेकिन बैचों की बढ़ी हुई संख्या के साथ प्रोटोकॉल को स्केलिंग के माध्यम से इस संख्या को बढ़ाया जा सकता है।
    3. अगले दिन प्रीवार्म डीएमईएम, ट्रिप्सिन और 1x फॉस्फेट-बफरेड लवइन (पीबीएस) को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के नहाने में रखकर।
    4. रूटलेटिन-meGFP और रूटलेटिन-mScarlet-I कोशिकाओं को पीबीएस में 2x डालना या माध्यम से aspirating और PBS के 10 mL के साथ की जगह ।
    5. लेबल Cal51 rootletin-meGFP कोशिकाओं को 500 एनएम वायलेट सेल रंग(सामग्री की तालिका)पीबीएस में कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिन के लिए जोड़कर।
    6. लेबल Cal51 rootletin-mScarlet-I आरटी में 1 मिन के लिए पीबीएस में 200 एनएम सुदूर लाल सेल रंग(सामग्री की तालिका) जोड़कर कोशिकाओं।
      नोट: फ्लोरोसेंस की फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए फ्लोरोसेंट धुंधला होने के बाद जहां भी संभव हो, नमूनों को प्रकाश से परिरक्षित रखें।
    7. 5 मिन के लिए DMEM के 10 mL जोड़कर रंग लेबलिंग प्रतिक्रियाओं को रोकें ।
    8. इनक्यूबेटर (चरण 1.2.2 से) से अवेलेबल माता-पिता Cal51 कोशिकाओं को हटा दें।
      नोट: इन कोशिकाओं को बाद में अवेलेबल नकारात्मक नियंत्रण (चरण 3.3.2) के रूप में उपयोग किया जाएगा।
    9. विकास माध्यम डालने और पीबीएस के 10 मीटर के साथ प्रतिस्थापित करके एक बार सभी कोशिकाओं को धोएं।
    10. पीबीएस बंद डालो और पूर्व गर्म 1x ट्रिप्सिन के 1 mL के साथ संस्कृति की स्थिति में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
    11. कोशिकाओं को 15 मीटर प्लास्टिक शंकुट्यूब पर स्थानांतरित करें और 5 मिन के लिए 1000 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें।
    12. ध्यान से हटा दें और एक पिपेट के साथ सेल पैलेट से ट्राइप्सिन को त्यागें।
    13. पीबीएस के 1 मिलील में बैंगनी और सुदूर लाल लेबल वाले सेल छर्रों को धीरे से फिर से निलंबित करें।
    14. डीएमईएम के 1 एमएल में माता-पिता (गैर-फ्लोरोसेंट) सेल पैलेट को धीरे से फिर से निलंबित करें और इनक्यूबेटर पर लौटें।
      नोट: इस नमूने को सेल-सेल फ्यूजन से नहीं गुजरना होगा लेकिन बाद में फ्लो साइटोमेट्री के दौरान इसका इस्तेमाल किया जाएगा।

2. सेल-सेल फ्यूजन

  1. 10 मीटर ट्यूब में 3 x 106 दूर लाल लेबल कोशिकाओं के साथ 3 x 106 वायलेट लेबल कोशिकाओं को मिलाएं, जो 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक सेल प्रकार के 0.5 मिलील को धीरे से पाइपिंग करके।
  2. 5 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर चरण 2.1 से शेष अमिश्रित कोशिकाओं को केंद्रीकृत करें, फिर पीबीएस बंद करें, डीएमईएम के 1 मिलील में गोली को फिर से निलंबित करें और इनक्यूबेटर पर लौटें।
    नोट: इन शेष अमिश्रित एकल लेबल वाले नमूनों का उपयोग बाद में प्रोटोकॉल की धारा 3 में नकारात्मक और क्षतिपूर्ति नियंत्रण के रूप में किया जाएगा ।
  3. 5 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर चरण 2.1 से मिश्रित कोशिकाओं को केंद्रीकृत करें और 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को ध्यान से एस्पिरेट करें।
  4. 30 एस की अवधि में 1 मिलील पिपेट का उपयोग करके सेल पैलेट (चरण 2.3) में ड्रॉपवाइज फैशन में 50% 1450 खूंटी समाधान के 0.7 मिलील जोड़ें।
  5. आरटी में ३.५ मिन के लिए छोड़ दें ।
    नोट: खूंटी के साथ ऊष्मायन समय सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि ध्यान दें कि लंबे समय तक ऊष्मायन समय सेल विषाक्तता को बढ़ाता है।
  6. सीरम मुक्त DMEM के 10 mL 30 एस के लिए ड्रॉपवाइज जोड़ें और 10 मिन के लिए इनक्यूबेटर में छोड़ दें ।
  7. 5 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर नीचे स्पिन, सुपरनेट को त्यागें, और पूर्ण माध्यम के 1 mL (FBS युक्त DMEM) में धीरे से फिर से निलंबित करें।
    नोट: सीधे धारा 3 पर जाएं। वहां खूंटी जोखिम प्रवाह साइटोमेट्री और इमेजिंग के बाद के साथ जुड़े विषाक्तता है, तो कदम के बीच तेजी से आगे बढ़ने से जितना संभव हो संस्कृति की स्थिति में कोशिकाओं को रखने के लिए ।

3. फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) फ्यूज्ड सेल को समृद्ध करने के लिए

  1. एक FACS ट्यूब में एक 70 μm फिल्टर के माध्यम से अलग से प्रत्येक नमूने pipetting द्वारा प्रवाह साइटोमेट्री के लिए सभी कोशिकाओं को तैयार करें।
    नोट: चार नमूनों की आवश्यकता है: जुड़े कोशिकाओं, एकल लेबल दूर लाल कोशिकाओं, एकल लेबल बैंगनी कोशिकाओं, अलेबल पैतृक कोशिकाओं । एक बार बाँझ ऊतक संस्कृति हुड से हटा दिया, कोशिकाओं को संक्रमित होने की क्षमता है, तो यहां से एक गैर बाँझ वातावरण के लिए नमूनों के जोखिम समय को कम करने के बाद । कोशिकाओं को पूर्ण डीएमईएम माध्यम में हल किया जाता है।
  2. सिंगल सेल सॉर्टिंग में सक्षम साइटोमीटर का उपयोग करें।
    1. एक सेप्टिक सॉर्ट के लिए सेल सॉर्टर स्थापित करें। निर्माता की सिफारिश के अनुसार उपकरण गुणवत्ता नियंत्रण करें।
    2. आगे तितर बितर बनाम पक्ष तितर बितर और एक डबल भेदभाव साजिश की एक साजिश ड्रा ।
  3. फ्यूज्ड कोशिकाओं की पहचान करने के लिए गेट बनाएं।
    1. 405 एनएम और 635 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर फ्लोरोसेंट रंगों को उत्तेजित करें। 450 एनएम और 660 एनएम (वायलेट और दूर-लाल तरंगदैर्ध्य, क्रमशः) पर पता लगाएं। कथानक दूर लाल बनाम बैंगनी तरंगदैर्ध्य की साजिश।
    2. साइटोमीटर के माध्यम से अवेलेबल माता-पिता की कोशिकाओं को चलाएं और फ्लोरेसेंस तीव्रता को रिकॉर्ड करें।
      नोट: इस बेसलाइन के ऊपर मूल्य रंग धुंधला के लिए सकारात्मकता को परिभाषित करते हैं ।
    3. साइटोमीटर के माध्यम से एकल लेबल वायलेट कोशिकाओं को चलाएं। पुष्टि करें कि अभी तक लाल चैनल में वायलेट का कोई बिखराव खत्म नहीं है ।
    4. साइटोमीटर के माध्यम से अभी तक लाल कोशिकाओं लेबल एकल भागो और पुष्टि करते है कि वहां कोई फैल-बैंगनी चैनल में अभी तक लाल के खत्म हो गया है ।
      नोट: दिखाए गए प्रतिनिधि डेटा के लिए, कोशिकाओं को 100 माइक्रोन नोजल से लैस सॉर्टर पर 20 साई पर हल किया गया था।
    5. संक्षेप में संलयन नमूना चलाने की पुष्टि करने के लिए कि जुड़े कोशिकाओं चरण ३.३ में बनाया फाटकों के साथ दिखाई दे रहे हैं ।
  4. छंटाई धारा को केंद्रीय रूप से 8-अच्छी तरह से इमेजिंग डिश में संरेखित करें।
  5. FACS सॉर्ट फ्यूज्ड कोशिकाएं, डबल पॉजिटिव वायलेट और सुदूर लाल लेबल वाली कोशिकाओं के रूप में सीधे 8-अच्छी तरह से इमेजिंग डिश में मौजूद हैं जिसमें विकास माध्यम का 100 माइक्रोन होता है।
    नोट: कोशिकाओं की अधिकतम अनुशंसित संख्या ~ 50,000 प्रति 8-अच्छी तरह से पकवान है। छंटाई के दौरान सेल स्वास्थ्य सुनिश्चित करें। सेल कन्फ्लंटेंसी कोशिका स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकती है इसलिए इमेजिंग डिश के लिए उचित संख्या में कोशिकाओं को छांटकर 20−90% के बाद की कोशिकाओं को छांटकर रखें। प्रत्येक हल की गई बूंद में म्यान तरल पदार्थ का लगभग 3 nL होता है। सुनिश्चित करें कि म्यान तरल पदार्थ छंटाई के दौरान विकास माध्यम को काफी कमजोर नहीं करता है।
  6. छंटाई के बाद सीधे, कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर पर ले जाएं और >2 h या रात भर के लिए रवाना हो जाएं।
    नोट: अनुयायी कोशिकाएं धीरे-धीरे इस अवधि के दौरान कवरस्लिप का फिर से पालन करेंगी, छंटाई से, और इसलिए यदि सीधे माइक्रोस्कोप पर ले जाया जाता है तो उनकी आकृति विज्ञान समय के साथ बदल जाएगी।

4. इम्यूनोफ्लोरोसेंसेंट धुंधला और सेल सेल फ्यूजन की इमेजिंग

नोट: फ्यूज्ड कोशिकाओं को आवश्यक प्रयोगों और मापके के आधार पर लाइव या निर्धारण के बाद और आगे फ्लोरोसेंट धुंधला (या दोनों) चित्रित किया जा सकता है।

  1. लाइव सेल इमेजिंग
    1. फिनॉल लाल(सामग्री की तालिका)के बिना इमेजिंग माध्यम के साथ विकास माध्यम को बदलें और इमेजिंग के लिए सीधे आगे बढ़ें।
  2. निर्धारण और धुंधला
    1. पीबीएस में नए सिरे से 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें।
    2. आरटी में 15 मिन के लिए 4% पीएफए के 100 माइक्रोन में इनक्यूबेटिंग करके कोशिकाओं को ठीक करें। 15 मिन के बाद पीएफए निकालें।
      सावधानी: पीएफए विषाक्त है जब साँस तो इस कदम को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक धूम हुड में किया जाना चाहिए ।
      नोट: निर्धारण के बाद, प्रयोग को रोका जा सकता है और आवश्यकता पड़ने पर बाद में पुनः आरंभ किया जा सकता है। जरूरत पड़ने पर सैंपल को 4 डिग्री सेल्सियस रोशनी से सुरक्षित रखें।
    3. आरटी में पीबीएस के 200 माइक्रोन में 3x धोएं।
    4. 200 में आरटी में 10 मिन के लिए कोशिकाओं को 0.1% nonionic surfactant(सामग्री की तालिका)और 0.1% nonionic डिटर्जेंट(सामग्री की तालिका)पीबीएस में पतला।
    5. आरटी में 30 मिन के लिए पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 200 माइक्रोन में ब्लॉक करें।
    6. पीबीएस के 150 माइक्रोन में एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन और 0.1% एनप्याजिक सरफेसेंट और आरटी में 1 घंटे के लिए 0.05% nonionic डिटर्जेंट शामिल हैं।
      नोट: प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी फ्लोरोसेंटी एंटी-जीएफपी नानोनो (1:400 कमजोर पड़ने पर उपयोग किए जाते हैं), और फ्लोरोसेंटी एंटी-एमस्लेट-आई नानोनो (1:500 कमजोर पड़ने पर उपयोग किया जाता है)। ये पहले से ही फ्लोरोसेंट प्रोटीन के सिग्नल को बढ़ाते हैं।
    7. पीबीएस के 300 माइक्रोन में 5 मिन के लिए 2x धोएं और फिर पीबीएस के 200 माइक्रोन में छोड़ दें।
      नोट: नमूने पीबीएस में चित्रित कर रहे हैं। नमूनों को प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. छवि अधिग्रहण
    1. चार रंग इमेजिंग (जैसे, कॉन्फोकल, वाइडफील्ड, संरचित रोशनी) में सक्षम एक उपयुक्त फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ छवियां प्राप्त करें।
    2. क्रमशः 488 एनएम और 561 एनएम तरंगदैर्ध्य लेजर के साथ meGFP और mScarlet-I चैनलों को उत्तेजित करें। ~ 505−550 एनएम और ~ 590−650 एनएम पर पता लगाने के लिए डिटेक्टर सेट करें। क्रमशः 405 एनएम और 633 एनएम लेजर के साथ बैंगनी और दूर लाल रंग चैनलों को उत्तेजित करें। ~ 430−500 एनएम और ~ 660−750 एनएम पर पता लगाने के लिए डिटेक्टर सेट करें।
    3. अनुभवजन्य रूप से लेजर तीव्रता का निर्धारण करें जैसे कि महत्वपूर्ण फोटोब्लीचिंग न हो और कोशिकाएं स्वस्थ रहें (यदि लाइव सेल इमेजिंग)।
    4. अनुभवजन्य रूप से इस तरह के लाभ का निर्धारण करते हैं कि पिक्सेल मूल्यों को संतृप्त या कृत्रिम रूप से क्लिपिंग के बिना संकेत प्राप्त किया जाता है।
    5. जेड-स्टैक डेटा एकत्र करें, जैसे कि छवियां त्रि-आयामी हैं, जो ~ 500 माइक्रोन चरण आकार के साथ 20−60 माइक्रोन की सीमा को कवर करती हैं।
      नोट: प्रतिनिधि डेटा में दिखाए गए चित्रों को कॉन्फोकल(चित्रा 2बी),एयरिकस्कैन(चित्रा 2सी)या संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी(चित्र ा 2डी)द्वारा अधिग्रहीत किया गया था। प्रत्येक कोशिका एक सदाशयी विषमता है यदि इसमें साइटोप्लाज्म में बैंगनी और दूर लाल रंग ओवरलैपिंग दोनों होते हैं।

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Representative Results

उचित लेबल कोशिकाओं को अवेलेबल नियंत्रण कोशिकाओं(चित्रा 2ए)से अधिक फ्लोरेसेंस सिग्नल द्वारा प्रवाह साइटोमेट्री के दौरान दिखाई देरहे हैं । गेट्स डबल सकारात्मक कोशिकाओं की छंटाई के लिए निर्धारित कर रहे हैं, आगे सूक्ष्म विश्लेषण के लिए इमेजिंग व्यंजन में सीधे इस आबादी को समृद्ध । फ्यूज्ड कोशिकाएं अलग डबल फ्लोरोसेंटी सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में पता लगाने योग्य हैं और जनसंख्या का लगभग ~ 1% हैं।

फ्यूजन दो कोशिकाओं को एक में मिलाने के माध्यम से सेलुलर वास्तुकला की प्रमुख पुनर्व्यवस्था को प्रेरित करता है(चित्रा 2बी)। हेट्रोकरियन की पहचान माइक्रोस्कोप पर एक ही कोशिका के अंदर मिश्रित फ्लोरोसेंट डाये संकेतों (प्लाज्मा झिल्ली के हस्तक्षेप के बिना) वाली कोशिकाओं के रूप में की जाती है। इसके अतिरिक्त, दो नाभिक चमकीले क्षेत्र/अंतर हस्तक्षेप विपरीत या फ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा जुड़े कोशिकाओं में दिखाई दे सकता है । ध्यान दें कि ट्रिपलॉयड या अन्य अधिक अत्यधिक पॉलीप्लाइड राज्य हालांकि अनुशासित संलयन के अलावा संभव हैं, और इसलिए फ्यूज्ड कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि करने के लिए दो रंगों के रंग संकेत का उपयोग किया जाना चाहिए।

मेजीएफपी और एमस्रेड-आई टैग प्रोटीन वाली कोशिकाओं के विलय के माध्यम से सेल संरचना और कार्य की जांच की जाती है। फ्यूजन के परिणामस्वरूप दो कोशिकाओं के संलयन के परिणामस्वरूप विषमताके अंदर सेंट्रोक संख्या दोगुनी हो जाती है। इस प्रकार, यदि फ्लोरोसेंटी लेबल सेंट्रोसोम्स वाली कोशिकाओं को संवर्जन किया जाता है, तो कम से कम चार पेरिसेंट्रिओलर सामग्री फोसी देखी जाती है जब सेंट्रोसोम पेरिसेंट्रिओलर घटक नेडडी 1 फ्लोरोसेंटली टैग किया जाता है (नेडडी1-mRuby3; चित्रा 2सी)। एंडोजेन्सी फ्लोरोसेंटी टैग रूटलेटिन (रूटलेटिन-मेजीएफपी और रूटलेटिन-एमस्रेड-आई) के साथ कोशिकाओं का संलयन प्रत्येक सेंट्रोसोम की उत्पत्ति की कोशिका को विषमता में पहचानने की अनुमति देता है। सेंट्रोसोमल जड़ों में रूटलेटिन का सीमित प्रसारण24है, और इसलिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2डी)के साथ छवि वाले हेट्रोकेरिन्स में स्पष्ट रूप से रंगीन फाइबर के रूप में मौजूद है।

Figure 1
चित्रा 1: सेल सेल फ्यूजन और फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रायोगिक कार्यप्रवाह। चार चरण के प्रायोगिक कार्यप्रवाह की योजनाबद्ध । (1) दो सेल आबादी अलग-अलग लेबल की जाती है, जिसमें रंग और फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन होते हैं। सियान वायलेट सेल रंगे और मजेंटा के साथ धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है दूर लाल सेल रंग के साथ धुंधला प्रतिनिधित्व करता है । ग्रीन meGFP टैगिंग का प्रतिनिधित्व करता है और लाल mScarlet-I टैगिंग का प्रतिनिधित्व करता है । (2) कोशिकाओं को पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ ऊष्मायन के माध्यम से जुड़े होते हैं। (3) फ्यूज्ड कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा समृद्ध किया जाता है, डबल फ्लोरोसेंटी सकारात्मक कोशिकाओं (सुदूर लाल और बैंगनी) को छांटते हैं। (4) फ्यूज्ड कोशिकाओं को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजकिया जाता है ताकि यह समझा जा सके कि सेलुलर संरचना और कार्य को कैसे बदल दिया जाता है (हरे और लाल चैनलों की इमेजिंग)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री संवर्धन और फ्यूज्ड कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट इमेजिंग। (क)फ्यूज्ड कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई में उपयोग की जाने वाली प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति। फ्यूज्ड कोशिकाएं जो दोगुना फ्लोरोसेंट हैं, काले वर्ग द्वारा इंगित की जाती हैं। (ख)प्रतिनिधि संफोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी फ्यूज्ड कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी, बैंगनी और दूर लाल रंगों के साथ डबल लेबल । दिखाए गए सफलतापूर्वक जुड़े कोशिकाओं के उदाहरण हैं, जो या तो टेट्रापलॉयड या हेक्साप्लाइड (क्रमशः ऊपर और नीचे पैनल) हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन(सी)प्रतिनिधि लाइव सेल एयरिकस्कैन कॉन्फोकल इमेजिंग एक ही फ्यूज्ड सेल में सेंट्रोसोम्स की इमेजिंग जिसमें एंडोजेन्सियस लेबल सेंट्रोसोमल रूट्स (रूटलेटिन-मेजीएफपी) और सेंट्रोसोमल परिसेंटियोलर सामग्री (NEDD1-mRuby3) शामिल हैं। स्केल बार = 1 μm.(डी)कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए एंडोजेनेस टैग रूटलेटिन-meGFP कोशिकाओं के साथ जुड़े हुए थे एंडोजेनेस टैग रूटलेटिन-mScarlet-I व्यक्त । कोशिकाओं को तय किया गया और दाग और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि । दिखाया गया है कि एक फ्यूज्ड सेल में सेंट्रोसोम्स की अधिकतम तीव्रता का जेड-प्रक्षेपण है। स्केल बार = 1 माइक्रोन पैनल डी को अनुमति के साथ माहेन24 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हम कोशिकाओं को फ्यूज करने और माइक्रोस्कोपी के साथ सेल हाइब्रिड के बाद के वास्तुकला की कल्पना करने के लिए एक फेसियल और लागत प्रभावी प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, जो शुरू से खत्म होने में लगभग दो दिन लगते हैं। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण हिस्से सेल छंटाई (प्रोटोकॉल अनुभाग 3) द्वारा जुड़े कोशिकाओं का संवर्धन और माइक्रोस्कोपी (प्रोटोकॉल अनुभाग 4) द्वारा फ्यूज्ड कोशिकाओं का सावधानीपूर्वक सत्यापन हैं। ये अनुभाग यह सुनिश्चित करते हैं कि फ्यूज्ड कोशिकाएं आसानी से प्राप्त की जाती हैं और सदाशयी हेटेरोकरियन हैं। सांद्रता और ऊष्मायन समय का पालन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, जब उच्च सांद्रता पर या लंबे समय तक ऊष्मायन समय के साथ उपयोग किया जाता है, तो सेल रंग बहुत उज्ज्वल हो सकते हैं और प्रवाह साइटोमेट्री या फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के दौरान डिटेक्टरों को संतृप्त कर सकते हैं, या इमेजिंग स्थितियों के आधार पर क्रॉस उत्सर्जन का कारण बनते हैं। फ्लो साइटोमीटर के अभाव में, अन्य प्रौद्योगिकियां फ्यूज्ड-कोशिकाओं को समृद्ध करने में सक्षम हैं, जिनमें डबल एंटीबायोटिक चयन27 और माइक्रोफ्लूइडिक ट्रैपिंग डिवाइस28शामिल हैं । इन प्रौद्योगिकियों या तो धीमी है या एक अधिक bespoke प्रयोगात्मक सेटअप की आवश्यकता है, लेकिन ।

सेल फ्यूजन के अन्य तरीकों में यहां वर्णित प्रोटोकॉल की तुलना में फायदे और नुकसान होते हैं। इलेक्ट्रो-फ्यूजन या वायरल-आधारित संलयन तकनीकों को फ्यूजन8,29के दौरान माइक्रोस्कोपी के साथ चित्रित किया जा सकता है, जिससे उन्हें अच्छे विकल्प मिल सकते हैं यदि फ्यूजन प्रक्रिया का पालन करना बेहतर है। हालांकि, इन विभिन्न तरीकों के लिए विशेष उपकरण (जैसे इलेक्ट्रोफ्यूजन उपकरण या वायरल ट्रांसजीन) की आवश्यकता हो सकती है। सभी सेल सेल संलयन विधियों में सेल स्वास्थ्य को अतिक्रमण करने की क्षमता है। वायरल आधारित संलयन विधियां आम तौर पर खूंटी या इलेक्ट्रोफ्यूजन द्वारा प्रदान किए गए क्षणिक क्षोभ के विपरीत वायरल ट्रांसजीन की निरंतर अभिव्यक्ति पर भरोसा करती हैं। खूंटी एक्सपोजर के बाद सेलुलर फ्यूसोजेनिक क्षमता और विषाक्तता विभिन्न सेलप्रकार27में चर है, और इसलिए खूंटी ऊष्मायन समय के titration की आवश्यकता हो सकती है (प्रोटोकॉल चरण 2.4), जबकि पहचानने कि खूंटी जोखिम में वृद्धि सेल मौत30बढ़ जाती है। समय को संस्कृति की स्थिति से बाहर रखकर कोशिका स्वास्थ्य को अधिकतम करना महत्वपूर्ण है। साइटोमीटर पर साइड स्कैटर बनाम माइक्रोस्कोपी के दौरान मॉर्फोलॉजी के अवलोकन के माध्यम से प्रोटोकॉल के दौरान सेल स्वास्थ्य की जांच की जा सकती है।

फ्लोरोसेंट टैग के साथ अंतर लेबलिंग की अनुमति देने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन पर सावधानीपूर्वक विचार करना आवश्यक है। सबसे सरल डिजाइन दो अलग फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग कर रहा है। हालांकि, अंतर्जात रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन अक्सर कम अभिव्यक्ति स्तर के होते हैं और इसलिए एकल कोशिका स्तर पर प्रवाह साइटोमेट्री या इमेजिंग द्वारा स्पष्ट रूप से पता लगाना मुश्किल होता है। हम एक डिजाइन पेश करते हैं जो CRISPR Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन और रंग आधारित धुंधला तरीकों के साथ चार फ्लोरोसेंट टैग को शामिल करके इस सीमा पर काबू पा लेते हैं। फ्लोरोसेंट जांच में एक दूसरे से अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रा प्रत्यक्ष होना चाहिए और एक ही कोशिका स्तर पर अवेलेबल कोशिकाओं से अलग होने के लिए पर्याप्त उज्ज्वल होना चाहिए। जांच बाहरी रूप से नष्ट करने के बजाय एक सेल के लिए बाध्य रहना चाहिए । उपकोशिकीय स्तर पर आंतरिक रूप से अपरिवर्तनीय बाध्यकारी आवश्यक नहीं है, लेकिन वांछनीय हो सकता है । एक बार कोशिकाओं के विलय के बाद, सेलुलर घटकों के स्थिर राज्य विनिमय स्वतंत्र रूप से हो सकता है । चूंकि जड़ें प्रसारित रूप से स्थिर हैं, इसलिए वे सेलुलर इतिहास का पता लगाने की अनुमति देते हैं, किसी दिए गए सेंट्रोसोम की उत्पत्ति की कोशिका की पहचान करते हैं। विधि का एक संभावित संशोधन ब्याज की अन्य सेलुलर संरचनाओं को टैग करना है, लेकिन स्थिर-राज्य विधानसभाओं में इंट्रासेलुलर गतिशीलता(चित्रा 2सी)की दर के आधार पर संलयन के बाद मिश्रण करने की क्षमता है।

सेल-सेल फ्यूजन सेलुलर आर्किटेक्चर17,19,24में एक अनूठा परिवर्तन लाती है, जिसके निहितार्थ अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं। यह प्रोटोकॉल की सीमा और आगे की जांच के लिए एक रोमांचक क्षेत्र दोनों है । हालांकि यह स्पष्ट है कि प्लाज्मा झिल्ली31हेटेरोकरियन में एक ही संरचना में फ्यूज होती है, कैसे अन्य सेलुलर संरचनाएं प्रतिक्रिया करती हैं, खराब समझा जाता है। सेल फ्यूजन का उपयोग इस बात को और समझने के लिए किया जा सकता है कि विभेदित लेबल ऑर्गेनेल्स24,32की इमेजिंग के माध्यम से ऑर्गेनेल फ्यूजन और विखंडन को कैसे विनियमित किया जाता है । सेल फ्यूजन के साथ भविष्य का काम कैसे यूप्लॉयडी, ऑर्गेनेल नंबर और सेलुलर आकार सेल समारोह पर अतिक्रमण को संबोधित कर सकता है । चूंकि असामान्य कोशिका संलयन रोग प्रक्रियाओं में देखा गया है, ट्यूमर33 में और वायरल संक्रमण10, 17के बाद, यह प्रोटोकॉल मौलिक और लागू जीव विज्ञान में प्रश्नों की एक श्रृंखला को संबोधित करने के लिए भी उपयोग का है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एक वेलकम ट्रस्ट हेनरी वेलकम फैलोशिप द्वारा आरएम (https://wellcome.ac.uk/grant नंबर 100090/12/Z) के लिए वित्त पोषित किया गया था । अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि की तैयारी में funder की कोई भूमिका नहीं थी। हम इस परियोजना पर महत्वपूर्ण सलाह और मार्गदर्शन के लिए अशोक वेंकितारमण और पॉल फ्रेंच को धन्यवाद देते हैं । हम उत्कृष्ट समर्थन के लिए कैंब्रिज इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च फ्लो साइटोमेट्री सुविधा में चियारा कोसेट्टी और गैब्रिएला ग्रोनडिस-कोटरबा का शुक्रिया अदा करते हैं । हम पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए लियाम कैसिडे, थॉमस मिलर और गिनामार्को कोंटिनो को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62554502
37% formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope Carl Zeiss
8-well imaging dishes Ibidi 80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody Chromotek gba-488
BD Influx Cell Sorter BD Biosciences
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Cell Filters (70 μm) Biofil CSS010070
CellTrace Far Red ThermoFisher Scientific C34572
CellTrace Violet ThermoFisher Scientific C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate ThermoFisher Scientific 31966021
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody NanoTag Biotechnologies N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium Sigma-Aldrich 21083027
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich 15140122
Phenol red free DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 21063029
Phosphate buffered saline (1x PBS) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 Sigma-Aldrich P7181
Polypropylene tubes BD Falcon 352063
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 nonionic surfactant
Trypsin Sigma-Aldrich T4049
Tween 20 Fisher BioReagents BP337 nonionic detergent

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 154 सेल सेल फ्यूजन सेंट्रोसोम यूप्लॉयी हेट्रोकरियन फ्लो साइटोमेट्री पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ऑर्गेनेल फ्यूसोजन
सेलुलर संरचना और समारोह के क्षोभ के लिए जीनोम संपादित सेल लाइनों के सेल सेल फ्यूजन
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Mahen, R., Schulte, R. Cell-cell… More

Mahen, R., Schulte, R. Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function. J. Vis. Exp. (154), e60550, doi:10.3791/60550 (2019).

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