Summary
Syftet med detta protokoll är att smälta samman två olika celltyper för att skapa hybridceller. Fluorescens mikroskopi analys av smält celler används för att spåra cellen ursprung cellulära organeller. Denna analys kan användas för att undersöka hur cellernas struktur och funktion reagerar på störning av Cellfusion.
Abstract
Livet är rumsligt partitionerad inom lipid membran för att möjliggöra isolerade bildandet av distinkta molekylära tillstånd inuti celler och organeller. Cellfusion är sammanslagningen av två eller flera celler för att bilda en enda cell. Här erbjuder vi ett protokoll för Cellfusion av två olika celltyper. Smält hybridceller berikas med flödescytometri-baserad sortering, följt av fluorescens mikroskopi av hybrid cellstruktur och funktion. Fluorescent taggade proteiner som genereras av genom redigering är avbildade inuti smält celler, så cellulära strukturer som skall identifieras baserat på fluorescensutsläpp och refereras tillbaka till celltypen av ursprung. Denna robusta och allmänna metod kan appliceras på olika celltyper eller organeller av intresse, att förstå cellulära struktur och funktion över en rad grundläggande biologiska frågor.
Introduction
Homeostatic underhåll av cellulära struktur är avgörande för livet. Celler har karakteristiska morfologier, sub-cellulära organell nummer, och interna biokemiska sammansättning. Förstå hur dessa grundläggande egenskaper genereras och hur de går snett under sjukdom kräver laboratorie verktyg för att stör dem.
Cell fusion är sammanslagningen av två eller flera separata celler. Cell fusion kan ha varit avgörande för uppkomsten av eukaryota liv1. I människokroppen, Cellfusion är relativt sällsynt, inträffar under begränsade utvecklingsförhållanden och vävnadstyper, såsom under befruktning eller bildandet av muskler, ben och moderkakan2. Detta protokoll beskriver induktion av cell-Cellfusion i vävnadsodling cellinjer med Differentiellt Fluorescent märkta organeller, som ett verktyg för att förstå de mekanismer som styr cellstruktur och funktion.
In vitro-inducerad cell-Cellfusion är central för produktionen av monoklonala antikroppar3, ett viktigt verktyg för biologisk forskning och sjukdomsbehandling. Cellfusion har också använts för att ställa många olika grundläggande cellbiologiska frågor om cell Cycle dominans4, aneuploidi5,6, cellulära omprogrammering7,8, reparation av skadade nervceller9, viral proliferation10, apoptos11, uppkomst12, cytoskeletala dynamik13, och membran fusion14,15. Laboratoriebaserade metoder för att inducera cell-Cellfusion16,17,18,19 inducera lipid membran återförening genom fysisk sammanslagning av två lipidmonolager till en. Cell fusion kan induceras av elektricitet18, viral baserade metoder17, termoplasmonic värme20, transgenens Expression19, och kemikalier inklusive polyetylenglykol (PEG)16,21,22.
Centrosomes är mikrotubuli organisera centra styra cellulära form, motilitet, polarisering, och Division23. Centrosomal rötter är fibrösa strukturer som sträcker sig från centrosomes innehåller proteinet rootletin24 (kodas av genen crocc). Vi använde nyligen cell-Cellfusion för att förstå hur centrosom position och antal varierar inuti heterokaryons i förhållande till föräldra celler24. Logiken bakom användningen av denna metod är att spåra cellen ursprung rötter inom en heterokaryon efter fusion av differentially Fluorescent taggade föräldra celler, och därmed bild organell fusion och fission. De Fluorescent taggade proteiner rootletin-meGFP eller rootletin-mScarlet-I skapas genom genom redigering i separata cellinjer som sedan smält genom PEG-medierad Cellfusion. Vi beskriver användningen av cell färgämnen (tabell över material) för att identifiera smält celler med flödescytometri och påföljande fluorescens-mikroskopi identifiering av centrosom cell ursprung och morfologi (figur 1). Detta tillvägagångssätt är en robust och unik metod för att studera hur stora förändringar i cellulära tillstånd inklusive organell antal inkräkta på cell homeostas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differentiell fluorescerande cell märkning
- Gen märkning med CRISPR Cas9
- Använd CRISPR Cas9 genom redigering för att tagga rootletin (eller andra gener av intresse) med fluorescerande proteiner meGFP eller mScarlet-i i mänskliga cancer cellinjer.
Anmärkning: Detaljerade protokoll för genomredigering täcks på annat håll24,25,26.
- Använd CRISPR Cas9 genom redigering för att tagga rootletin (eller andra gener av intresse) med fluorescerande proteiner meGFP eller mScarlet-i i mänskliga cancer cellinjer.
- Märkning av fluorescerande färgämnen
- Grow Cal51 mänskliga cancerceller i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovin serum (FBS), L-glutamin, och 100 μg/mL penicillin/streptomycin vid 37 ° c och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
Anmärkning: Det är viktigt att se till att cellerna kontrolleras regelbundet för frånvaro av Mycoplasma förorening, och för identiteten av cellinaden. Använd inte celler som har genomgått omfattande blint i kulturen (> 15 passager). Celler måste vara friska och växande exponentiellt. Undvik under-confluency eller över-confluency. - Utsäde varje celltyp (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I och föräldra otaggade Cal51 celler) så att ~ 6 x 106 celler är närvarande nästa dag för varje prov, vid en sammanlänkning av 70 − 90%.
Anmärkning: Detta är ungefär en T75 vävnad kultur kolv eller 1 10 cm skålen per celltyp. Den föräldraluntagged celler krävs som en negativ kontroll senare i protokollet. Detta protokoll möjliggör produktion av ~ 20 000 smält celler, men detta antal kan ökas genom att skala upp protokollet med ett ökat antal partier. - Nästa dag, förvärmt DMEM, trypsin och 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att placera dem i ett vattenbad vid 37 ° c.
- Tvätta rootletin-meGFP och rootletin-mScarlet-I-celler 2x i PBS genom att hälla eller aspirera av mediet och ersätta med 10 mL PBS.
- Etikett Cal51 rootletin-meGFP celler genom att tillsätta 500 nM violett cell färg (tabell över material) i PBS för 1 min vid rumstemperatur (RT).
- Label Cal51 rootletin-mScarlet-I celler genom att tillsätta 200 nM långt röd cell färg (tabell över material) i PBS för 1 min vid RT.
Anmärkning: Håll proverna avskärmade från ljus när så är möjligt efter fluorescerande färgning, för att undvika fotoblekning av fluorescens. - Stoppa färg märknings reaktionerna genom att tillsätta 10 mL DMEM i 5 minuter.
- Ta bort omärkta föräldra Cal51 celler från inkubatorn (från steg 1.2.2).
Anmärkning: Dessa celler kommer att användas senare som omärkta negativa kontroller (steg 3.3.2). - Tvätta alla celler en gång genom att hälla av odlingssubstrat och ersätta med 10 mL PBS.
- Häll av PBS och inkubera i 5 minuter vid odlingsförhållanden med 1 mL förvärmd 1x trypsin.
- Överför celler till ett 15 mL plast koniskt rör och centrifugera vid 1000 x g i 5 min.
- Ta försiktigt bort och kassera trypsin från cellpelleten med en pipett.
- Försiktigt Omsuspendera violett och långt rött märkta cell pellets i 1 mL PBS.
- Omsuspendera försiktigt den förälders (icke-fluorescerande) cellpelleten i 1 mL DMEM och återgå till inkubatorn.
Anmärkning: Detta prov kommer inte att genomgå cell-Cellfusion, men kommer att användas senare under flödescytometri.
- Grow Cal51 mänskliga cancerceller i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovin serum (FBS), L-glutamin, och 100 μg/mL penicillin/streptomycin vid 37 ° c och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
2. cell-cell fusion
- Blanda 3 x 106 violinmärkta celler med 3 x 106 far röda märkta celler i en 15 ml tub genom att försiktigt Pipettera ihop 0,5 ml av varje celltyp med en 1 ml pipett.
- Centrifugera de återstående oblandade cellerna från steg 2,1 vid 1 000 x g i 5 min, häll sedan av PBS, Omsuspendera pelleten i 1 ml DMEM och återvänd till inkubatorn.
Anmärkning: Dessa kvarvarande oblandade enkelmärkta prover kommer senare att användas som negativa och kompensationskontroller i avsnitt 3 i protokollet. - Centrifugera de blandade cellerna från steg 2,1 vid 1 000 x g i 5 minuter och sug upp PBS försiktigt med en 1 ml pipett.
- Tillsätt 0,7 ml 50% 1450 PEG lösning på ett droppvis sätt till cellpelleten (steg 2,3) med en 1 ml pipett under en period av 30 s.
- Låt verka i 3,5 min vid RT.
Anmärkning: Inkubationstiden med PEG kan optimeras beroende på celltyp, men Observera att längre inkubationstid ökar celltoxiciteten. - Tillsätt 10 ml serumfritt DMEM droppvis i 30 s och låt verka i inkubatorn i 10 minuter.
- Snurra på 1 000 x g i 5 min, Kassera supernatanten och Omsuspendera försiktigt i 1 ml komplett medium (DMEM innehållande FBS).
Anmärkning: Fortsätt direkt till avsnitt 3. Det finns toxicitet i samband med PEG exponering följt av flödescytometri och avbildning, så håll celler i kulturen förhållanden så mycket som möjligt genom att snabbt gå mellan stegen.
3. Fluorescence-aktiverad cell sortering (FACS) för att berika smält celler
- Förbered alla celler för flödescytometri genom att försiktigt Pipettera varje prov separat genom ett 70 μm-filter till ett FACS-rör.
Anmärkning: Fyra prover krävs: smält celler, enkelmärkta långt erytrocyter, enkelmärkta violett celler, omärkta föräldra celler. När avlägsnas från den sterila vävnad kultur huva, celler har förmågan att bli smittad, så minimera exponeringstiden för prover till en icke-steril miljö härifrån och framåt. Celler sorteras i fullständigt DMEM-medium. - Använd en flödescytometerns som kan användas för enkel cell sortering.
- Ställ in cell Sorteraren för en aseptisk sortering. Utför instrumentet kvalitetskontroll enligt tillverkarens rekommendation.
- Rita en Plot av framåt scatter kontra sida scatter och en Doublet diskriminering tomt.
- Skapa grindar för att identifiera smält celler.
- Excitera fluorescerande färgämnen vid våglängder på 405 nm och 635 nm. Detektera vid 450 nm och 660 nm (violett och far-röda våglängder, respektive). Tomt långt rött kontra violett våglängder.
- Kör omärkta föräldra celler genom flödescytometerns och registrera fluorescensintensiteten.
Anmärkning: Värden över denna baslinje definierar positivitet för färg färgning. - Kör enkelmärkta violett celler genom cytometer. Bekräfta att det inte finns någon spill-over av violett i den avlägsna röda kanalen.
- Kör enkelmärkt långt röda celler genom flödescytometerns och bekräfta att det inte finns någon spill-over av långt rött i den violetta kanalen.
Anmärkning: För de representativa data som visas, var celler sorteras vid 20 psi på en sorterare utrustad med ett 100 μm munstycke. - Kort köra fusions provet för att bekräfta att smält celler är synliga med portarna skapade i steg 3,3.
- Rikta in sorterings strömmen centralt i en 8-och bild antenn.
- FACS sortera smält celler, närvarande som dubbla positiva violett och långt röda märkta celler direkt i en 8-brunn bild ande skålen som innehåller 100 μL av odlingssubstrat.
Anmärkning: Det maximala rekommenderade antalet celler är ~ 50 000 per 8-väl skålen. Säkerställ cell hälsan vid sortering. Cell sammanlänkning kan påverka cell hälsan så håll cellerna mellan 20 − 90% sammanlänkning efter sortering genom att sortera ett lämpligt antal celler för avbildnings skålen. Varje sorterad dropp innehåller cirka 3 nl av slida vätska. Se till att slida vätskan inte avsevärt späder ut odlingsmediet under sortering. - Direkt efter sortering, ta tillbaka cellerna till inkubatorn och låt verka i > 2 h eller över natten.
Anmärkning: Anhängare celler kommer successivt åter följa täckglas under denna period, från sortering och framåt, och därmed deras morfologi kommer att förändras med tiden om det tas direkt till mikroskopet.
4. immunofluorescensfärgning och avbildning av cell fusioner
Anmärkning: Smält celler kan avbildas Live eller efter fixering och ytterligare fluorescerande färgning (eller båda), beroende på de experiment och mätningar som krävs.
- Live cell Imaging
- Ersätt odlingsmedium med Imaging medium utan fenolrött (tabell över material) och gå direkt till Imaging.
- Fixering och färgning
- Bered färsk 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS.
- Fix celler genom inkuberande dem i 100 μL av 4% PFA för 15 min vid RT. ta bort PFA efter 15 min.
Försiktighet: PFA är giftigt vid inandning så detta steg ska utföras i ett draghuv med lämplig personlig skyddsutrustning.
Anmärkning: Efter fixering kan experimentet pausas och startas om senare om det behövs. Förvara provet vid 4 ° c skyddat mot ljus vid behov. - Tvätta cellerna 3x i 200 μL PBS vid RT.
- Permeabilize celler för 10 min vid RT i 200 μl av 0,1% icke-jonaktivt tensid (tabell över material) och 0,1% icke-jonaktivt tvättmedel (tabell över material) utspädd i PBS.
- Block i 200 μL 3% bovint serumalbumin i PBS i 30 minuter vid RT.
- Inkubera med antikroppar i 150 μl PBS innehållande 3% bovint serumalbumin och 0,1% nonioniskt ytaktivt ämne och 0,05% icke-jonaktivt tvättmedel för 1 h vid RT.
Anmärkning: De primära antikropparna som används för att generera representativa resultat är fluorescerande konjugerad anti-GFP-nanokropp (används vid 1:400 spädning) och överföras konjugerad anti-mscarlet-I-nanokropp (används vid 1:500 spädning). Dessa förstärker signalera av de redan fluorescerande proteinerna. - Tvätta 2x i 5 min i 300 μL PBS och lämna sedan i 200 μL PBS.
Anmärkning: Proverna avbildas i PBS. Proverna kan förvaras vid 4 ° c skyddat mot ljus.
- Bild förvärv
- Hämta bilder med ett lämpligt fluorescensmikroskop med kapacitet för fyrfärgs avbildning (t. ex. konfokal, widefield, strukturerad belysning).
- Excite meGFP och mScarlet-I kanaler med 488 nm och 561 nm våglängd lasrar, respektive. Ställ in detektorer för att detektera vid ~ 505 − 550 nm och ~ 590 − 650 Nm. Excite violett och långt röda färgämnen kanaler med 405 nm och 633 nm lasrar, respektive. Ställ in detektorer för att detektera vid ~ 430 − 500 Nm och ~ 660 − 750 nm.
- Empiriskt bestämma laser intensitet så att betydande photoblekning inte förekommer och att cellerna förblir friska (om levande cell avbildning).
- Empiriskt bestämma Gain sådan att signalen erhålls utan mättar eller artificiellt klippning pixelvärden.
- Samla in Z-stack data, så att bilderna är tredimensionella, som täcker en räckvidd på 20 − 60 μm med ~ 500 μm steg storlek.
Anmärkning: Bilderna som visas i representativa data har förvärvats av antingen konfokalmikroskopi(figur 2B), airyscan (figur 2C) eller strukturerad belysningsmikroskopi (figur 2D). Varje cell är en bona fide heterokaryon om den innehåller både violett och långt röda färgämnen överlappande i cytoplasman.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På lämpligt sätt märkta celler syns under flödescytometri med fluorescenssignal högre än omärkta kontrollceller (figur 2a). Gates är inställda för sortering av dubbla positiva celler, berikande denna population direkt i Imaging rätter för ytterligare mikroskopiska analyser. Smält celler är detekterbara som distinkta dubbel Fluorescent positiva celler och utgör ca ~ 1% av befolkningen.
Fusion inducerar större rearrangering av cellulära arkitektur genom blandning av två celler i en (figur 2B). Heterokaryons identifieras på mikroskopet som celler som innehåller både fluorescerande färgsignaler blandas inuti en enda cell (utan mellanliggande plasmamembran). Dessutom kan två kärnor vara synliga i smält celler av brightfield/differential interferens kontrast eller fluorescens Imaging. Observera att triploid eller andra mer hög polyploida tillstånd är möjliga förutom diploida fusioner dock, och så Dye signal av två färger bör användas för att bekräfta identiteten på smält celler.
Cell struktur och funktion utreds ytterligare genom sammanslagning av celler som innehåller meGFP och mScarlet-jag taggade proteiner. Fusion resulterar i en fördubbling av centrosom numrerar insida heterokaryons resultera från fusionen av två celler. Om celler med fluorescerande märkta centrosomer är fixerade, observeras därför minst fyra pericentriolära material Foci när centrosom pericentriolar-komponenten NEDD1 är Fluorescent taggade (NEDD1-mRuby3; Figur 2C). Fusion av celler med endogent Fluorescent taggade rootletin (rootletin-megfp och rootletin-mscarlet-i) tillåter cellen av ursprunget för varje centrosom att identifieras i en heterokaryon. Rootletin i centrosomal rötter har begränsad diffusionell omsättning24, och är därför närvarande som tydligt färgade fibrer i heterokaryons avbildas med fluorescens mikroskopi (figur 2D).
Figur 1: experimentellt arbetsflöde för cell-cellfusion och fluorescens Imaging. Schematiskt av det experimentella arbetsflödet i fyra steg. (1) två cellpopulationer är differentially märkta, med färgämnen och fluorescerande fusions proteiner. Cyan representerar färgning med violett cell färg och magenta representerar färgning med långt rött cell färgämne. Grönt representerar meGFP taggning och rött representerar mScarlet-I taggning. (2) celler smälts genom inkubering med polyetylenglykol. (3) smält celler berikas med flödescytometri, sortering av de dubbla fluorescerande positiva cellerna (långt rött och violett). (4) smält celler avbildas med fluorescensmikroskopi för att förstå hur cellernas struktur och funktion ändras (Imaging de gröna och röda kanalerna). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ flödescytometriberikning och fluorescerande avbildning av smält celler. Arepresentativ gating strategi som används i flödescytometri sortering av smält celler. Smält celler som är dubbelt fluorescerande indikeras av den svarta kvadraten. Brepresentativ konfokalfluorescens-mikroskopi av smält celler, dubbelmärkt med violett och avlägsna röda färgämnen. Visas är exempel på framgångsrikt smält celler, som är antingen gräsart eller hexaploid (övre och nedre paneler respektive). Skalstapel = 10 μm. (C) representativ levande cell Airyscan konfokal avbildning av centrosomes i en enda smält cell som innehåller endogent märkta centrosomal rötter (rootletin-megfp) och centrosomal pericentriolar material (NEDD1-mRuby3). Skalstapel = 1 μm. (D) celler som uttrycker endogent taggade rootletin-megfp var smält med celler som uttrycker endogent taggade Rootletin-mscarlet-I. Celler fastställdes och färgas och avbildades med strukturerad belysningsmikroskopi. Visas är en maximal-intensitet z-projektion av centrosomes i en smält cell. Scale bar = 1 μm. panel D har modifierats från Mahen24 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visar ett facile och kostnadseffektivt protokoll för att fixera celler och visualisera den efterföljande arkitekturen av cell hybrider med mikroskopi, tar cirka två dagar från början till. Kritiska delar av detta protokoll är berikning av smält celler genom cell sortering (protokoll avsnitt 3), och noggrann validering av smält celler genom mikroskopi (protokoll avsnitt 4). Dessa avsnitt se till att smält celler är lätt erhållas och är bona fide heterokaryons. Koncentrationer och inkubationstider bör följas. Till exempel, när de används vid högre koncentrationer eller med längre inkubationstider, kan cell färgämnen vara för ljusa och mätta detektorerna under flödescytometri eller fluorescensmikroskopi, eller orsaka Cross emission beroende på bildförhållanden. I avsaknad av en flödescytometer, andra tekniker kan berika smält celler, inklusive dubbel antibiotikum urval27 och mikroflödessystem fångstanordningar28. Dessa tekniker är antingen långsammare eller kräver en mer skräddarsydd experimentell installation, dock.
Andra metoder för Cellfusion har fördelar och nackdelar jämfört med det protokoll som beskrivs här. Elektro-fusion eller viral-baserade fusions tekniker kan i vissa fall avbildas med mikroskopi under fusion8,29, vilket gör dem bra alternativ om det är bättre att iaktta själva fusionsprocessen. Men dessa olika metoder kan kräva specialiserad utrustning (t. ex. elektrofusion utrustning eller viral transgener). Alla cell-Cellfusion metoder har potential att inkräkta på cell hälsan. Viral baserade fusions metoder förlitar sig i allmänhet på det fortsatta uttrycket av virala transgener, i motsats till den övergående störning som tillhandahålls av PEG eller elektrofusion. Cellulära fusogenic potential och toxicitet efter PEG exponering är varierande i olika celltyper27, och därmed titrering av PEG inkubationstid kan krävas (protokoll steg 2,4), samtidigt som man erkänner att ökad PEG exponering ökar celldöd30. Maximera cellens hälsa är kritisk genom att hålla tiden ur kulturen villkor till ett minimum. Cell hälsan kan kontrolleras under protokollet genom att mäta framåt scatter kontra sida scatter på flödescytometerns och genom observation av morfologi under mikroskopi.
Noggrann bedömning av experimentell design för att medge differential märkning med fluorescerande taggar är viktigt. Den enklaste designen är att använda två separata fluorescerande etiketter. Endogent uttryckt fluorescerande fusions proteiner är dock ofta av låg uttrycksnivå och är därför svåra att entydigt upptäcka genom flödescytometri eller avbildning på singelcellsnivå. Vi presenterar en design som övervinner denna begränsning genom att inkludera fyra fluorescerande Taggar med CRISPR Cas9-medierad genom redigering och Dye-baserade färgning metoder. Fluorescerande sonder måste ha distinkta emissions spektra urskiljbara från varandra och vara tillräckligt ljusa för att skilja från omärkta celler på en enda cellnivå. Sonderna måste förbli bundna till en cell i stället för att skingren externt. Irreversibel bindning internt på subcellulär nivå är inte nödvändigt men kan vara önskvärt. När celler slås samman, kan steady state utbyte av cellulära komponenter fritt inträffa. Eftersom rötterna är diffusialt stabila, de tillåter spårning av cellulära historia, identifiera cellen ursprung av en given centrosome. En möjlig modifiering av metoden är att tagga andra cellulära strukturer av intresse, men steady-state församlingar har potential att blanda efter fusion, beroende på graden av intracellulär dynamik (figur 2C).
Cell-Cellfusion inducerar en unik förändring i cellulära arkitektur17,19,24, vars konsekvenser är fortfarande inte helt klarlagda. Detta är både en begränsning av protokollet och ett spännande område för vidare utredning. Även om det är klart att plasmamembran säkring till en enda struktur i heterokaryons31, hur andra cellulära strukturer reagera är dåligt förstådd. Cell fusion kan användas för att ytterligare förstå hur organell fusion och fission regleras genom avbildning av Differentiellt märkta organeller24,32. Framtida arbete med Cellfusion kan ta itu med hur euploidi, organell nummer och cellulära storlek inkräkter på cell funktion. Eftersom onormal Cellfusion har observerats i sjukdomsprocesser, i tumörer33 och efter virusinfektion10,17, detta protokoll är också att använda för att ta itu med en rad frågor i grundläggande och tillämpad biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av en Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship till R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant nummer 100090/12/Z). Finansiär hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet. Vi tackar Ashok Venkitaraman och Paul French för kritisk rådgivning och vägledning om projektet. Vi tackar Chiara Cossetti och Gabriela Grondys-Kotarba i Cambridge Institutet för medicinsk forskning Flow Cytometry Facility för utmärkt stöd. Vi tackar Liam Cassiday, Thomas Miller och Gianmarco Contino för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70 μm) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
