Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie van epitheelcellen uit verschillende anatomische gebieden van het humaan amniotische membraan om hun heterogeniteit en functionele eigenschappen te bepalen voor mogelijke toepassing in klinische en physiopathologische modellen.
Abstract
Verschillende protocollen zijn gerapporteerd in de literatuur voor de isolatie en de cultuur van menselijke amniotische epitheelcellen (HAEC). Echter, deze veronderstellen dat het amniotische epitheel is een homogene laag. De menselijke amnion kan worden onderverdeeld in drie anatomische gebieden: reflecterend, Placental en navelstreng. Elke regio heeft verschillende fysiologische rollen, zoals in pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we een protocol om humaan amnion weefsel in drie secties te ontleden en in vitro te onderhouden. In de cultuur, cellen afgeleid van de gereflecteerde amnion weergegeven een kubus morfologie, terwijl cellen uit zowel placenta en navelstreng gebieden waren plaveiselcel. Niettemin, alle verkregen cellen hebben een epitheliale fenotype, aangetoond door de immunodetectie van E-cadherin. Omdat de placenta-en weerkaatste gebieden in situ verschillen in cellulaire componenten en moleculaire functies, kan het voor in vitro studies noodzakelijk zijn om deze verschillen te overwegen, omdat ze fysiologische implicaties kunnen hebben voor het gebruik van HAEC in biomedisch onderzoek en de veelbelovende toepassing van deze cellen in regeneratieve geneeskunde.
Introduction
Humaan amniotische epitheelcellen (HAEC) ontstaan tijdens de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling, op ongeveer acht dagen na de bevruchting. Zij komen voort uit een populatie van plaveiselcel epitheelcellen van de epiblast die afkomstig zijn van de binnenste laag van het amniotische membraan1. Zo worden HAEC beschouwd als overblijfselen van pluripotente cellen uit de epiblast die het potentieel hebben om zich te differentiëren in de drie kiem lagen van het embryo2. In de afgelopen tien jaar hebben diverse onderzoeksgroepen methoden ontwikkeld om deze cellen te isoleren van het amniotische membraan tijdens de dracht, om hun veronderstelde pluripotentie-gerelateerde eigenschappen in een cultuur model in vitro3,4te karakteriseren.
Dienovereenkomstig is gebleken dat HAEC eigenschappen kenmerken die kenmerkend zijn voor menselijke pluripotente stamcellen (HPSC), zoals de oppervlakte antigenen SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; de kern van pluripotentie transcriptiefactoren OCT4, SOX2 en NANOG; en de proliferatie marker KI67, wat suggereert dat ze zichzelf vernieuwen5,6,7. Bovendien zijn deze cellen aangevochten met behulp van differentiatie protocollen om cellen positief te verkrijgen voor Lineage-specifieke markers van de drie kiem lagen (Ectoderm, mesoderm en endoderm)4,5,8, evenals in diermodellen van menselijke ziekten. Tot slot, Haec Express E-cadherin, die aantonen dat ze een epitheel karakter behouden, net als de hpsc5,5.
Afgezien van hun embryonale oorsprong, hebben Haec andere intrinsieke eigenschappen die ze geschikt maken voor verschillende klinische toepassingen, zoals de afscheiding van ontstekingsremmende en antibacteriële moleculen10,11, groeifactoren en cytokine release12, geen vorming van teratomen wanneer ze worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen in tegenstelling tot hpsc2, en immunologische tolerantie omdat ze HLA-G uitdrukken, wat het risico op afstoting na transplantatie13.
Uit eerdere rapporten is echter uitgegaan dat de humane amnion een homogeen membraan is, zonder te overwegen dat het anatomisch en fysiologisch kan worden onderverdeeld in drie regio's: placenta (de amnion die de Europese lork basalisbedekt), navelstreng (het deel dat de navelstreng omhult), en gereflecteerd (de rest van het membraan dat niet aan de placenta is bevestigd)14. Het is aangetoond dat de placenta en gereflecteerde gebieden van de amnion vertonen verschillen in morfologie, mitochondriale activiteit, detectie van reactieve zuurstof soorten15, Mirna expressie16, en activering van signalering trajecten17. Deze resultaten suggereren dat de menselijke amnion wordt geïntegreerd door een heterogene populatie met verschillende functionaliteit die moet worden overwogen voor verdere studies die worden uitgevoerd in zowel in situ-als in vitro-modellen. Terwijl andere laboratoria protocollen hebben ontworpen voor de isolatie van HAEC uit het hele membraan, heeft ons laboratorium een protocol opgesteld om cellen uit verschillende anatomische gebieden te isoleren, te kweken en te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituto Nacional de Perinatología in Mexico-stad (Registernummer 212250-21041). Alle procedures die in deze studies werden uitgevoerd, waren in overeenstemming met de ethische normen van het Instituto Nacional de Perinatología, de verklaring van Helsinki en de richtlijnen die zijn uiteengezet in de officiële Mexicaanse standaard van het ministerie van volksgezondheid.
1. voorbereiding
- Bereid een oplossing van 1x PBS met EDTA. Voeg hiervoor 500 μL 0,5 M EDTA-kolf toe aan 500 mL 1x PBS voor een eindconcentratie van 0,5 mM EDTA.
- Maak het kweekmedium voor HAEC. Neem 450 mL hoge glucose-DMEM, vul het aan met 5 mL natrium pyruvaat (100 mM), 50 mL warmteinactief foetaal runderserum dat is gekwalificeerd voor stamcellen, 5 mL niet-essentiële aminozuren (100x), 5 mL antibioticum-antimycotic (100x), 5 mL L-glutamine (200 mM), en 500 μL mercapto ethanol (1, 000x).
- Steriliseer de containers voor het transporteren en verwerken van het weefsel: een roestvrijstalen container met deksel om de hele placenta van het operatie theater naar het laboratorium te transporteren, een dienblad (20 cm x 30 cm x 8 cm) om het bloed van de hele placenta te wassen en te verwijderen voordat de dissectie van het amniotische membraan, en een plastic snijplank om het amniotische membraan in de drie regio's te scheiden.
- Steriliseren de chirurgische instrumenten (scalpels, schaar, pincet, en klemmen), 500 mL bekers, katoen gauzes, en zoutoplossing.
2. verkrijgen van placentaire weefsels
Opmerking: de amniotische membranen werden verkregen van vrouwen bij volledige dracht (37 − 40 weken), onder vermelding van de afgifte van Cesarean, zonder enig bewijs van actieve arbeid, en geen microbiologische kenmerken van infectie. De volledige isolatie-en cultuur procedures werden onder steriele omstandigheden binnen een bioveiligheidkabinet uitgevoerd.
- In de operatiekamer, klem de navelstreng om te voorkomen dat de bloedtoevoer naar de rest van het weefsel. Verzamel de volledige placenta met het navelstreng geklemd in de steriele container.
- Voeg 500 mL zoutoplossing toe aan de container om de placenta te hydrateren.
- Sluit de container en transport van het weefsel naar het laboratorium bij kamertemperatuur.
- Plaats de container met de placenta in de bioveiligheid Cabinet.
Opmerking: in het geval dat de dissectie niet binnen 15 minuten na het verzamelen van de placenta wordt uitgevoerd, bewaar de container met de placenta op ijs tot de verwerking. Vermijd meer dan 1 uur verstreken tijd tussen het verkrijgen van de placenta en het begin van de dissectie.
3. mechanische scheiding per gebied van het amniotische membraan
Opmerking: de procedure moet worden uitgevoerd in een bioveiligheids kast onder steriele omstandigheden en op kamertemperatuur.
- Verwijder de hele placenta uit de container en plaats deze op het bakje met het navelstreng naar boven gericht.
- Reinig met een steriel katoenen gaas de bloedstolsels van het oppervlak van de chorion-amnion die de placenta bedekt.
- Identificeer de drie gebieden van het membraan: de navelstreng amnion omhullend de navelstreng, de placenta amnion bedekt met de Europese lork basalis, en het gereflecteerde gebied, dat is de rest van amnion die niet is gehecht aan de placenta (Figuur 1).
- Ontleden de navelstreng amnion (Figuur 2a).
- Met behulp van het ontleden van de Tang, houd het gedeelte van amnion membraan dat de kruising van de placenta en navelstreng bedekt.
- Met een scalpel, ontleden de regio die het snoer omringt terwijl het zich uitstrekt om het te scheiden van de chorion.
- Stort het afgescheiden weefsel in een gelabeld bekerglas met 100 mL zoutoplossing.
- Dissect de placenta amnion Region (Figuur 2b).
- Verwijder met een steriel katoenen gaas de bloedstolsels van het oppervlak van de chorion-amnion die de placenta bedekt.
- Houd het membraan op de grens tussen de placenta en het gereflecteerde gebied met de ontsnij Tang.
- Snijd langs de omtrek van de placenta met de scalpel.
- Scheid de placenta amnion van het chorion, wees voorzichtig om geen vaten van de placenta te snijden.
- Plaats het afgescheiden weefsel in een ander gelabeld bekerglas met 300 mL zoutoplossing.
- Scheid de rest van het amniotische membraan dat niet aan de placenta is bevestigd (d.w.z. het gereflecteerde deel) uit het chorion (figuur 2c).
- Verzamel het gereflecteerde gebied in een ander gelabeld bekerglas met 300 mL zoutoplossing.
Opmerking: Voeg voortdurend zoutoplossing toe tijdens de dissectie om te voorkomen dat weefsel uitdroogt.
- Verzamel het gereflecteerde gebied in een ander gelabeld bekerglas met 300 mL zoutoplossing.
4. de membranen wassen
Opmerking: de procedure moet worden uitgevoerd binnen een bioveiligheids kast onder steriele omstandigheden bij kamertemperatuur.
- Gooi de zoutoplossing van elk membraan gebied afzonderlijk weg.
- Voeg 100 mL verse zoutoplossing toe aan de navelstreek.
- Voeg 300 mL verse zoutoplossing toe aan respectievelijk de placenta-en weerkaatste gebieden.
- Roer de membranen met behulp van dissectie tang om bloed resten te verwijderen.
- Gooi de zoutoplossing weg.
- Herhaal de wasses en agitatie ten minste 3x totdat de membranen doorschijnend zijn.
- Plaats en verleng de membranen op het bord om te reinigen met steriel gaas de bloedstolsels die niet werden verwijderd met de wasses.
Opmerking: het is zeer belangrijk om zoveel mogelijk erytrocyten te verwijderen, omdat hun aanwezigheid de trypsine-functie en de levensvatbaarheid van volgende celculturen beïnvloedt.
5. enzymatische vertering van de membranen uit verschillende regio's
Opmerking: de procedure moet worden uitgevoerd in een bioveiligheids kast onder steriele omstandigheden.
- Snijd de gereflecteerde en placentaire gebieden in twee of drie fragmenten.
- Snijd de navelstreng niet.
- Plaats de fragmenten van elke regio in centrifugebuizen. Voeg 20 mL 0,5% trypsine/EDTA toe aan de gereflecteerde en placentale gebieden en 5 mL 0,5% trypsine/EDTA aan de navelstreek, respectievelijk.
Opmerking: het is belangrijk om de gereflecteerde en placentale gebieden in kleinere stukken te snijden, omdat ze volledig ondergedompeld moeten worden in de trypsine-oplossing. - Schud de centrifugebuizen lichtjes gedurende 30 s. Gooi de trypsine weg.
- Voeg 30 mL nieuwe 0,5% trypsine/EDTA toe aan de gereflecteerde en placenta gebieden en 15 mL nieuwe 0,5% trypsine/EDTA aan de navelstreek, respectievelijk.
- Plaats de buisjes in een Rotator in de incubator.
- Inincuberen met rotatie (20 rpm) voor 40 min bij 37 °C.
Opmerking: als er geen buis Rotator beschikbaar is, schud de buisjes dan elke 10 min lichtjes handmatig. - Breng de trypsine/Cell-oplossingen van elke regio over naar nieuwe centrifugebuizen.
- Voeg 2x het volume van de HAEC-media voorverwarmd bij 37 °C per buis om het enzym te deactiveren.
- Bewaar de eerste spijsvertering op ijs.
- Herhaal stap 5.6 − 5.8 voor een tweede digestie periode.
- Houd voor elke regio een uiteinde van het amnion gedeelte met behulp van het ontleden van de Tang, en met een ander paar knijp langs het weefsel om rijen epitheliale cellen te verwijderen die tijdens eerdere incubatie perioden niet volledig afpellen.
- Verzamel de tweede spijsvertering in een andere set van centrifugebuizen en inactiveren met 2x het volume van de HAEC media.
- Gooi de verteerde membranen weg in een Biohazard container.
6. isolatie van de HAEC
Opmerking: de procedure moet worden uitgevoerd in een bioveiligheids kast onder steriele omstandigheden.
- Centrifugeer alle buisjes bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
- Gooi het supernatant weg en voeg 10 mL voorverwarmde HAEC-media (tot 37 °C) toe per buis en pipet voorzichtig om elke pellet te scheiden.
- Combineer de cellulaire suspensies van de twee digestonen in een individuele buis voor elk membraan gebied.
- Filtreer de cellulaire suspensies met behulp van 100 μm celstrainers om het extracellulaire matrix puin te verwijderen en enkelvoudige cellen te verkrijgen.
- Bereid drie aliquots met 90 μL trypaan blauw in een micro centrifugebuis.
- Voeg 10 μL van elke celsuspensie per membraan regio toe aan de microcentrifuge buizen en meng.
- Tel de cellen met een hemocytometer onder een lichtveld Microscoop.
7. cultuur van HAEC
- Zaai de HAEC uit de drie regio's afzonderlijk met een dichtheid van 3 × 104 cellen/cm2 met voorverwarmde Haec-media, aangevuld met 10 ng/ml humane epidermale groeifactor (EFG).
- Zaai de cellen in 100 mm platen om ze in vitro of in 24 goed platen voor immunochemische analyse te behouden.
- Incuberen de gerechten bij 37 °C onder normoxische condities (5% CO2) in een bevoficeerde incubator.
- Voeg EFG dagelijks toe en verander het medium elke derde dag.
Opmerking: de cellen worden na 4 − 6 dagen Confluent Health. - Gebruik de cellen voor conventionele immunohistochemie, celsorterings analyse, cryopreserverende, RNA-en EiwitExtractie of om de passage voort te zetten.
8. passage van HAEC
- Verwijder het HAEC medium en was 2x met PBS/EDTA 0,01 M oplossing.
- Inincuberen met een PBS/EDTA 0,01 M oplossing gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Verwijder de PBS/EDTA en voeg 1,5 mL 0,5% trypsine/EDTA toe.
- Inincuberen gedurende 5 − 8 min bij 37 °C.
- Inactiveren van het enzym met twee volumes van HAEC media.
- Verzamel de gemengde oplossing en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g.
- Tel de cellen en ga door met de volgende passages of gebruik de cellen voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HAEC werden geïsoleerd van elk van de drie anatomische gebieden van het vrucht vlies en individueel gekweekt in vitro. Na 48 h van de cultuur, cellen met een epitheel fenotype gehecht aan het oppervlak van de plaat, hoewel de media bevatte ook celpuin en zwevende cellen, die werden verwijderd zodra het medium werd veranderd (Figuur 3).
Tijdens de verwerking van de primaire cultuur (passage Zero, P0), kunnen sommige complicaties ontstaan die de experimentele gegevensanalyse kunnen verstoren (Figuur 4): het is raadzaam om de culturen weg te gooien en een ander membraan te verwerken bij het identificeren van de aanwezigheid van bacteriën als gevolg van besmetting van de reagentia of tijdens het isolatie proces (figuur 4a); overmatige erytrocyten als gevolg van onvoldoende wassen van de membranen (figuur 4b); gebrekkige of geen adhesie van de cellen aan de platen (figuur 4c); of cellen met fibroblast-morfologie (figuur 4D), wat suggereert dat humane amniotische mesenchymale cellen (hamc) werden geïsoleerd in plaats van Haec.
De morfologie van HAEC hangt af van de oorsprong van deze cellen: cellen uit de gereflecteerde zone hebben een cuboïdale morfologie en groeien in een geplaveide monolayer, in tegenstelling tot cellen uit de placenta-en navel gebieden, die vlakker en plaveeus zijn (Figuur 5). Deze gegevens ondersteunen dat de epitheel laag van de amnion niet uniform is gedurende het membraan. Tijdens de passages neemt de grootte van de cellen uit alle gebieden toe, maar ze behouden hun epitheliale aard en verwerven geen fibroblast-morfologie. Inderdaad, immunofluorescentie tegen E-cadherin toonde aan dat de primaire culturen (P0) en subculturen (P1-P2) behouden hun epitheliale fenotype (Figuur 6), wat suggereert dat er geen besmetting van een ander celtype, zoals mesenchymale stromale cellen, of epitheliale mesenchymale overgang. Bovendien vertonen deze cellen geen bewijs van celdood volgens de TUNEL test (aanvullend figuur 1), maar zijn ze positief voor de KI-67 proliferatie marker (Figuur 6), hoewel onze eerdere resultaten geen significante verschillen voor deze marker vonden tussen elke passage5.
Het aantal verkregen cellen varieert naargelang van de regio: 61,6 x 106 en 71,8 x 106 cellen uit de gereflecteerde en placentale gebieden, respectievelijk, en minder dan 1 x 106 per monster uit de navelstreek (tabel 1). Met dit protocol is gemeld dat placentale en navelstreek zeer vergelijkbaar zijn in hun uitdrukkings profielen, in tegenstelling tot de gereflecteerde en placentale gebieden, vooral in genen die deelnemen aan de ECM-receptor interactie, focale hechting en het PI3K-Akt-signalerings traject via RNA-SEQ6. In overeenstemming, een eerdere studie meldde de differentiële uitdrukking van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase en transformeren groeifactor Beta trajecten, evenals proinflammatoire cytokines tussen beide regio's17.
Hoewel uit het bewijsmateriaal bleek dat de subpopulaties van de amnion verschillen in hun morfologie en fysiologische eigenschappen, hebben we eerder aangetoond dat de uitdrukking en de aanwezigheid van de kern van de pluripotentie factoren niet veranderen in Haec, afgeleid van placenta en weerkaatste gebieden6. In deze context, naast het relatief beperkte aantal cellen uit de navelstreek, vervolgstudies moeten zich concentreren op geïsoleerde HAEC van de placenta en reflecterend amnion onafhankelijk, gezien de fysiologische implicaties, omdat de verschillende subpopulaties niet gelijk zouden reageren op specifieke gebeurtenissen, zoals langdurige zwangerschap of ontstekingsprocessen tijdens de bevalling, hoewel er geen specifieke positieve cellen zijn voor de belangrijkste pluripotentie markers (Figuur 7).
Figuur 1: anatomische gebieden van het amniotische membraan op termijn. Umbilical amniotische membraan (geel), placentaire amniotische membraan (wit), en gereflecteerd amniotische membraan (zwart). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: mechanisch dissectie van het amniotische membraan. (A) navelstreek, (B) placentaire regio, en (C) gereflecteerde regio. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve primaire cultuur van HAEC, afgeleid van het amniotische membraan. Cultuur 48 h na afzondering zonder (a) en met (B) een verandering van media. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve micro grafieken van negatieve resultaten van de primaire kweek van HAEC. (A) overmaat aan erytrocyten. B) bacteriële besmetting. C) Haec is niet nageleefd na 48 h van isolatie. D) primaire kweek die bestaat uit cellen met fibroblast-morfologie. Schaal staven = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: morfologie van HAEC uit verschillende anatomische gebieden in vitro. Representatieve micro grafieken van de confluente Haec van gereflecteerd (bovenste paneel), placenta (middelste paneel), en navelstreng (onderste paneel) regio's gekweekt hoewel P0 − P2. Schaal staven 200 = μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: uitdrukking van E-cadherin en ki-67 in HAEC. Representatieve epifluorescentie microscopie beelden van E-cadherin+ en ki-67+ Haec van gereflecteerd (linker paneel) en placenta (rechter paneel) amnion gekweekt door P0 − P2. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: HAEC uit verschillende anatomische gebieden toont een pluripotentie marker panel. Representatieve confocale microscopie beelden van dubbele immunofluorescentie amnion voor NANOG met TRA-1-60, OCT4 met E-cadherin, en SOX2 met SSEA-4 in HAEC (P1) uit gereflecteerde (bovenste paneel) en placentale (onderste paneel) regio's. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| # MEMBRAAN | Weerspiegeld | PLACENTA | Navelstreng | COMPLEET MEMBRAAN |
| 1 | 75 X 106 | 130 X 106 | 0,2 X 106 | 205,2 X 106 |
| 2 | 38,5 X 106 | 52 X 106 | 0,53 X 106 | 91,03 X 106 |
| 3 | 59 X 106 | 53 X 106 | 0,2 X 106 | 112,2 X 106 |
| 4 | 42 X 106 | 27 X 106 | 0,36 X 106 | 69,36 X 106 |
| 5 | 44,8 X 106 | 22,3 X 106 | Np | 76,1 X 106 |
| 6 | 100 X 106 | 140 X 106 | 1 X 106 | 241 X 106 |
| 7 | 72 X 106 | 78 X 106 | Np | 150 X 106 |
| Gemiddelde | 61,6 X 106 | 71,8 X 106 | 0,45 X 106 | 133,8 X 106 |
Tabel 1: aantal HAEC geïsoleerd per regio van vruchtbare membranen. (NP = niet verwerkt).
Aanvullend figuur 1: TUNEL kleuring in HAEC (passage 2) uit het gereflecteerde gebied en in positieve controle cellen (HL-60 cellen behandeld met camptothecin). Schaal staven = 50 μm. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We implementeerden een nieuw protocol om HAEC te isoleren van term membranen. Het verschilt van eerdere rapporten in dat elk membraan werd verdeeld in de drie anatomische gebieden vóór isolatie om cellen te analyseren van elk.
Een van de meest kritische stappen in het protocol is het wassen van het membraan om alle bloedstolsels te verwijderen, omdat ze de activiteit van trypsine kunnen verstoren bij het scheiden van de epitheelcellen. Het niet goed uitvoeren van deze stap kan leiden tot het verkrijgen van een primaire cultuur met overmatige erytrocyten en weinig aanhandige epitheelcellen. Als er geen bevestiging wordt waargenomen in de eerste 24 − 48 h na het zaaien van de cellen, raden we aan om de cultuur te verwijderen. Een ander kritisch punt is de incubatietijd voor de enzymatische vertering. Als de incubatietijd te lang is, kan de levensvatbaarheid van de cellen afnemen en/of celculturen met mesenchymale in plaats van epitheel morfologie worden verkregen (Figuur 4). Ook, als membraan spijsvertering niet wordt gedaan met de juiste agitatie, de kans op het verkrijgen van een laag aantal cellen per membraan toeneemt.
In dit protocol kunnen we de populaties van HAEC in vitro behouden zonder hun epitheliale fenotype te verliezen, zoals blijkt uit de aanwezigheid van specifieke epitheliale celmarker E-cadherin voor de meeste cellen langs de passages (Figuur 6). In onze ervaring kan de HAEC echter alleen worden uitgebreid voor drie passages (P1 − P3). Het beperkte aantal passages moet in aanmerking worden genomen voor experimenten die lange perioden van cultuur of meerdere passages vereisen. Bovendien is gemeld dat na P3 de cellen beginnen hun morfologie te veranderen en de uitdrukking van E-cadherin te verminderen, zodat de langdurige cultuur epitheliale-mesenchymale overgang (EMT)18kan induceren. Onlangs, werd aangetoond dat progesteron voorkomt EMT bij schapen amniotische epitheelcellen19,20, dus het zou interessant zijn om het effect van verschillende concentraties van progesteron in het Haec-kweekmedium te analyseren om het mesenchymale fenotype na de derde passage te vermijden.
In alle eerdere verslagen waarin HAEC werd geïsoleerd, werd de amnion verondersteld een uniform weefsel te zijn, ondanks de mogelijke heterogeniteit van epitheliale populaties die het hele membraan omvatten. Dit protocol verdeelt het membraan daarentegen in zijn drie anatomische gebieden om de HAEC afzonderlijk te isoleren en te kweken, gezien de eerdere morfologische en genexpressie rapporten die functionele verschillen suggereren. Het is ook onnodig om door de celsortering te zuiveren om alleen epitheliale populaties te verkrijgen, zoals aangetoond door detectie van de E-cadherin marker tijdens passages tot P2.
Het is aangetoond dat geïsoleerde HAEC uit elk van de membraan gebieden een vergelijkbare uitdrukking van pluripotentie core hebben, zijnde een latent reservoir van cellen met stemdheid. In deze context kunnen deze cellen in vitro worden gebruikt om moleculaire mechanismen te bestuderen, zoals de dynamische lokalisatie van pluripotentie-gerelateerde transcriptiefactoren of hun vermogen om te blijven trillen ondanks het uiten van met kanker geassocieerde genen, ongeacht hun anatomische regio van herkomst. Echter, toekomstig onderzoek moet rekening houden met moleculaire verschillen gerapporteerd (globale expressie genen, metabole activiteit, signalering trajecten) tussen elke regio, die gevolgen zou hebben voor hun toepassing in regeneratieve geneeskunde. Eerder rapporteerden we een andere expressie van genen die betrokken waren bij PI3K/AKT en focale adhesie signalerings trajecten tussen de verschillende amniotische gebieden door RNA-SEQ6. PI3K/Akt regelt zelf vernieuwing en onderhoudt pluripotentie in hpsc, terwijl activering van focale adhesie kinase hun differentiatie bevordert21,22. Daarom stellen we voor om de rol van beide trajecten in HAEC geïsoleerd van verschillende anatomische gebieden te karakteriseren tijdens Lineage-specifieke differentiatie protocollen. Bovendien, verschillende studies tonen de verschillen tussen beide regio's met betrekking tot cellulaire componenten, moleculaire functie, en biologische processen. De regiospecifieke genexpressie en eiwit verdeling van aquaporinen, die betrokken zijn bij het transportproces van intramembraneuze absorptie, zijn bijvoorbeeld gemeld23. Een andere studie vergeleek het miRNome met micro arrays, met een regiospecifieke uitdrukking van miR-145 en miR-143, waarbij de laatstgenoemde in staat is om de prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 onder specifieke omstandigheden te reguleren, zoals arbeid bij term16. Bovendien presenteert het placenta gebied een hogere mitochondriale ademhaling, maar lagere reactieve zuurstof soorten detectie in vergelijking met gereflecteerd weefsel15. Het ontleden van de amnion in gereflecteerde en placentale regio's wordt aangemoedigd om HAEC te isoleren en hun eigenaardige eigenschappen afzonderlijk te analyseren, zoals het vrijkomen van groeifactoren en cytokinen, hun lage immunogeniciteit, de productie van extracellulaire matrix, het effect van hun geconditioneerde medium in de cocultuur met andere celtypen, en nieuwe functies zoals hun vermogen om HPSC-lijnen te onderhouden als feeder Layer24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ons onderzoek werd gesteund door subsidies van het Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 en 21081) en CONACYT (a1-S-8450 en 252756). Wij danken Jessica González Norris en Lidia Yuriria Paredes Vivas voor de technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , Springer. 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
