Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום השפיר האנושי כדי לקבוע את התכונות הטרוגניות והפונקציונליות שלהם עבור יישום אפשרי במודלים קליניים וphysiopathological.
Abstract
מספר פרוטוקולים דווחו בספרות על הבידוד והתרבות של תאים האפיתל השפיר האדם (HAEC). עם זאת, אלה להניח כי האפיתל השפיר היא שכבה הומוגנית. ניתן לחלק את השפיר האנושית לשלושה אזורים אנטומיים: השתקפות, הפלפה והטבור. לכל אזור יש תפקידים פיזיולוגיים שונים, כמו בתנאים פתולוגיים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את. הרקמה האנושית בשלוש מחלקות ולתחזק אותה בתרבות, תאים שמקורם בשפיר משתקף על הציגו מורפולוגיה בוטאידית, בעוד תאים משני האזורים ואזורי הטבור היו קשקשיים. עם זאת, כל התאים המתקבלים יש פנוטיפ אפיתל, הפגינו על ידי זיהוי חיסוני של E-קדהרין. לפיכך, מכיוון שהאזורים השונים והמשתקפים באתרו שונים ברכיבים סלולריים ובתפקודים מולקולריים, ייתכן שיהיה צורך בלימודי מבחנה כדי לשקול הבדלים אלה, משום שיכולים להיות להם השלכות פיזיולוגיות לשימוש ב-haec ב מחקר ביו ויישום מבטיח של תאים אלה ברפואה רגנרטיבית.
Introduction
תאים האפיתל השפיר האדם (HAEC) מקורם בשלבים המוקדמים של התפתחות עובריים, בסביבות שמונה ימים הפריה. הם נובעים מאוכלוסייה של תאים אפיתל הקשקש של אפיפיצוץ שנובעים השכבה הפנימית ביותר של קרום השפיר1. כך, HAEC נחשבים שאריות של תאים בעלי עוצמה מאפיפיצוץ כי יש פוטנציאל להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט של העובר2. בעשור האחרון פיתחו קבוצות מחקר מגוונות שיטות לבידוד תאים אלה מקרום השפיר בתקופת ההיריון על מנת לאפיין את המאפיינים הקשורים לשוערת פלאוריאון שלהם במודל תרבות מחוץ לתחום3,4.
בהתאם, הוא נמצא כי התכונות התכונות HAEC מאפיין של תאי גזע האדם pluriפוטנטי (HPSC), כגון אנטיגנים פני השטח SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; הליבה של מרכיבי תמלול שעתוק OCT4, SOX2, ו-NANOG; ומסמן ההתפשטות KI67, הרומז שהם מחדשים את עצמם5,6,7. יתר על כן, תאים אלה כבר מאותגרים באמצעות פרוטוקולי בידול להשיג תאים חיוביים עבור סמנים ספציפיים שושלת היוחסין של שלוש שכבות הנבט (העור, מזועור, ואנדועור)4,5,8, כמו גם במודלים של בעלי חיים של מחלות אנושיות. לבסוף, haec אקספרס E-קדהרין, אשר מדגימים כי הם שומרים על טבע אפיתל בדיוק כמו hsc5,9.
מלבד המוצא העובריים, haec יש תכונות פנימיות אחרות העושות אותם מתאים ליישומים קליניים שונים, כגון הפרשה של מולקולות אנטי דלקתיות ו-אנטיבקטריאלי10,11, גורמי גדילה ושחרור ציטוקינים12, אין היווצרות של teratomas כאשר הם מושתלים לתוך עכברים לקויה בניגוד עם hpsc2, ואת הסובלנות החיסונית כי הם לבטא hla-G, אשר מקטין את הסיכון של דחייה לאחר השתלת13.
עם זאת, הדיווחים הקודמים הניחו כי המין האנושי הוא קרום הומוגנית, מבלי להתחשב בכך שהוא יכול להיות מחולק מבחינה אנטומית ופיזיולוגית לשלושה אזורים: משטחי השפיר המכסים את הדציבלים, הטבור (החלק שעוטף את חבל הטבור), ומשתקף (שאר הקרום אינו מוצמד לשליה)14. הוכח כי האזורים המשחיים ומשתקפים של השפיר על הבדלים בתצוגה מורפולוגיה, פעילות מיטוכונדריאלי, זיהוי של מינים חמצן תגובתי15, mirna ביטוי16, והפעלה של מסלולים איתות17. תוצאות אלה מרמזות על כך שהשפיר האנושי משולב על ידי אוכלוסיה הטרוגנית עם פונקציונליות שונה שיש להתייחס אליה למחקרים נוספים שבוצעו בתוך מודלים מחוץ לבית או במודלים של מבחנה. בעוד מעבדות אחרות עיצבו פרוטוקולים לבידוד של HAEC מהקרום כולו, המעבדה שלנו הקימה פרוטוקול לבידוד, תרבות, ואפיון תאים מאזורים אנטומיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה האתית של המכון הלאומי דה פראטולוגיניה במקסיקו סיטי (רישום מספר 212250-21041). כל ההליכים שבוצעו במחקרים אלה היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של המכון הלאומי לפראינואטולוגיה, הצהרת הלסינקי, וההנחיות שנקבעו בתקן המקסיקני הרשמי של משרד הבריאות.
1. הכנה
- הכינו פתרון של ה-PBS 1x עם EDTA. כדי לעשות זאת, להוסיף 500 μL של 0.5 M EDTA המניה לתוך 500 mL של 1x PBS עבור ריכוז סופי של 0.5 mM EDTA.
- הכינו את מדיום התרבות לחברת HAEC. לקחת 450 mL של גלוקוז גבוה-DMEM, מוסף אותו עם 5 מ ל של נתרן פירובט (100 mM), 50 mL של סרום בלתי פעיל של העוברי העובר בתאי גזע, 5 מ ל של חומצות אמינו לא חיוניות (100x), 5 מ ל אנטיביוטי-(100x), 5 מ"ל של L-גלוטמין (200 mM), ו 500 μL של מרקוטואתנול (1, 000x).
- לחטא את המכולות להובלת ועיבוד הרקמה: מיכל נירוסטה עם מכסה כדי להעביר את השליה כולה מבית הניתוח למעבדה, מגש (20 ס"מ x 30 ס"מ x 8 ס"מ) כדי לשטוף ולהסיר דם מן השליה כולה לפני הניתוח של קרום השפיר וקרש חיתוך פלסטי כדי להפריד את קרום השפיר לשלושת האזורים.
- לחטא את כלי הניתוח (אזמל, מספריים, מלקחיים, ומלחציים), 500 mL, כותנה, ותמיסת מלח.
2. קבלת רקמת שנטל
הערה: ממברנות השפיר הושגו מנשים בהריון לטווח מלא (37-40 שבועות), תחת אינדיקציה למסירה בניתוח קיסרי, ללא כל עדות לעבודה פעילה, וללא מאפיינים מיקרוביולוגית של זיהום. הליכי הבידוד והתרבות המשלימים בוצעו בתוך ארון ביולוגי בתנאים סטריליים.
- בחדר הניתוח, הצמד את חבל הטבור כדי למנוע את זרימת הדם לשאר הרקמה. לאסוף את השליה כולה עם חבל הטבור מהודק במיכל סטרילי.
- הוסף 500 mL של תמיסת מלח למיכל כדי מימה את השליה.
- סגרו את המכולה והרכב את הרקמה למעבדה בטמפרטורת החדר.
- שים את המיכל עם השליה בתוך ארון הביטחון הביואלי.
הערה: במקרה שהקרע לא יבוצע בתוך 15 דקות של איסוף השליה, אחסן את המיכל עם השליה על הקרח עד עיבוד. הימנע יותר 1 h של זמן שחלף בין קבלת השליה ותחילת הקרע.
3. הפרדה מכנית לכל אזור בקרום השפיר
הערה: יש לבצע את ההליך בתוך ארון אבטחה ביולוגי בתנאים סטריליים ובטמפרטורת החדר.
- הסר את השליה כולה ממיכל ומניחים אותו על מגש עם חבל הטבור פונה כלפי מעלה.
- לנקות את קרישי הדם מהמשטח של. הצ-שפיר שמכסה את השליה
- לזהות את שלושת האזורים של הקרום: שפיר הטבור על עוטף את חבל הטבור, שפיר השפיר על המכסה של הדציבלים, ואת האזור משתקף, שהוא שאר השפיר כי הוא לא מחובר השליה (איור 1).
- לנתח את שפיר הטבור על האזור (איור 2 א).
- באמצעות מלקחיים מבתר, להחזיק את החלק של ממברנה בשפיר המכסה את הצומת של השליה ואת חבל הטבור.
- עם אזמל, לנתח את האזור המקיף את החוט תוך מתיחה כדי להפריד אותו מן chorion.
- להפקיד את הרקמה המופרדת בגביע עם תווית 100 mL של תמיסת מלח.
- מנתח את השפיר באזור (איור 2B).
- עם גזה סטרילית כותנה, להסיר את קרישי הדם מהמשטח של הצ-שפיר על זה מכסה את השליה.
- להחזיק את הקרום על הגבול בין השליה לבין האזור משתקף עם מלקחיים לבתר.
- חותכים לאורך ההיקף של השליה עם האזמל.
- להיזהר לא לחתוך שום כלי מן השליה.
- מניחים את הרקמה המופרדת בגביע אחר עם תווית 300 mL של תמיסת מלח.
- הפרידו את שאר קרום השפיר שאינו מוצמד לשליה (כלומר, החלק המשתקף) מהצ (איור 2C).
- לאסוף את האזור משתקף בגביע אחר עם תווית 300 mL של תמיסת מלח.
הערה: הוסף פתרון מלוחים ללא הרף במהלך הניתוח כדי למנוע הרקמה מייבוש.
- לאסוף את האזור משתקף בגביע אחר עם תווית 300 mL של תמיסת מלח.
4. שטיפת הקרומים
הערה: יש לבצע את ההליך בתוך ארון אבטחה ביולוגי תחת תנאים סטריליים בטמפרטורת החדר.
- להיפטר תמיסת מלוחים של כל אזור קרום בנפרד.
- הוסף 100 mL של תמיסת מלח טרי לאזור הטבור.
- להוסיף 300 mL של תמיסת מלוחים טריים לאזורים האזור משתקף בהתאמה.
- מערבבים את הקרומים בעזרת מלקחיים להסרת שאריות דם.
- . התעלם מתמיסת המלח
- חזרו על השטף והעצבנות לפחות 3 x עד שהקרום שקוף.
- המקום ולהרחיב את הקרומים על הלוח כדי לנקות עם גזה סטרילי קרישי דם שלא הוסרו עם שוטף.
הערה: חשוב מאוד להסיר כמות של אריתרופוציטים רבים ככל האפשר, כאשר נוכחותם משפיעה על התפקוד הטריפסין ועל הכדאיות של תרבויות התאים העוקבות.
5. העיכול האנזימטי של הקרומים מאזורים שונים
הערה: יש לבצע את ההליך בתוך ארון אבטחה ביולוגי תחת תנאים סטריליים.
- חותכים את האזורים המשתקפים והמפוצלים לשניים או שלושה קטעים.
- . אל תחתוך את אזור הטבור
- מניחים את השברים של כל אזור בצינורות צנטריפוגה. הוסיפו 20 מ ל של 0.5% טריפסין/EDTA לאזורים המשתקפים והשפלרים ו-5 מ ל של 0.5% טריפסין/EDTA לאזור הטבור, בהתאמה.
הערה: חשוב לחתוך את האזורים המשתקפים והמשרים לחתיכות קטנות יותר מכיוון שהם צריכים להיות שקועים לחלוטין בתמיסה של טריפסין. - לנער את צינורות הצנטריפוגה בקלות עבור 30 s.. להיפטר מטריפסין
- הוסף 30 מ ל של חדש 0.5% טריפסין/EDTA לאזורים המשתקפים והמשרים ו 15 מ ל של חדש 0.5% טריפסין/EDTA לאזור הטבור, בהתאמה.
- מניחים את הצינורות. בתוך מסובבי שבתוך החממה
- דגירה עם סיבוב (20 סל ד) עבור 40 דקות ב 37 ° c.
הערה: אם מסובב צינור אינו זמין, טלטל את הצינורות באופן ידני כל 10 דקות. - העבר את הטריפסין/פתרונות התא מכל אזור לצינורות צנטריפוגה חדשים.
- הוסיפו את הנפח של המדיה HAEC שחומם מראש ב-37 ° צ' לצינור כדי להשבית את האנזים.
- . לאחסן את העיכול הראשון על הקרח
- חזור על שלבים 5.6-5.8 לתקופת עיכול שנייה.
- עבור כל אזור, להחזיק קצה אחד של החלק השפיר על באמצעות מלקחיים מבתר, ועם זוג אחר לסחוט לאורך הרקמה כדי להסיר שורות של תאים אפיתל שלא לגמרי לקלף במהלך תקופות דגירה הקודם.
- לאסוף את העיכול השני לתוך קבוצה אחרת של צינורות צנטריפוגה ו להשבית עם 2x את נפח המדיה HAEC.
- השמט את הקרומים העועכלים למיכל בידוד.
6. בידוד החטק
הערה: יש לבצע את ההליך בתוך ארון אבטחה ביולוגי תחת תנאים סטריליים.
- צנטריפוגה את כל הצינורות ב 200 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
- להיפטר supernatant ולהוסיף 10 מ ל של מדיה HAEC prewarmed (עד 37 ° c) לצינור ו pipet בעדינות כדי לבטל את הצבירה של כל גלולה.
- שלבו את השעיות הסלולר של שתי העיכול בצינור בודד לכל אזור ממברנה.
- לסנן את השעיות הסלולר באמצעות 100 יקרומטר תא משתמשים כדי להסיר את הפסולת מטריקס לחלץ ולקבל תאים בודדים.
- הכינו שלושה אליטים עם 90 μL של טרי, כחול בצינור מיקרוצנטריפוגה.
- הוסף 10 μL של כל תא השעיה לכל אזור ממברנה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה ולערבב.
- ספור את התאים בעזרת. מיקרוסקופ תחת שדה אור
7. התרבות של HAEC
- זרע HAEC משלושת האזורים בנפרד בצפיפות של 3 × 104 תאים/cm2 עם מדיה prewarmed haec, שיושלם עם 10 ng/mL של גורם הגידול באפידרמיס האנושית (egf).
- הזרע את התאים בלוחות 100 מ"מ כדי לשמור אותם בתוך מבחנה או 24 לוחות טוב לניתוח חיסוני.
- הnormoxic את המנות ב-37 ° c בתנאים מוקדמים (5% CO2) באינקובטור מחולל לחות.
- הוסף את EGF מדי יום ושנה את המדיום כל יום שלישי.
הערה: התאים יהפכו להיות שוטפת לאחר 4 עד 6 ימים. - השתמש בתאים עבור אימונוהיסטוכימיה המקובלת, ניתוח מיון התא, הקפאה, הוצאת RNA והפקת חלבון, או כדי להמשיך במעבר.
8. המעבר המאוחד
- הסר את המדיום HAEC ושטוף 2x עם פתרון של PBS/EDTA 0.01 M.
- מודקון עם פתרון של PBS/EDTA 0.01 M עבור 15 דקות ב 37 ° c.
- הסר את ה-PBS/EDTA והוסף 1.5 mL של 0.5% טריפסין/EDTA.
- מודקון עבור 5-8 דקות ב 37 ° c.
- הפוך את האנזים עם שני כרכים של המדיה HAEC.
- לאסוף את הפתרון המעורב צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g.
- ספור את התאים והמשך במעברים הבאים או השתמש בתאים לצורך ניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HAEC היו מבודדים מכל אחד משלושת האזורים האנטומיים של קרום השפיר ומתורבת באופן אינדיבידואלי בתוך מבחנה. לאחר 48 h של התרבות, תאים עם פנוטיפים אפיתל על פני השטח של הצלחת, למרות התקשורת גם הכיל פסולת תא תאים צפים, אשר הוסרו לאחר המדיום השתנה (איור 3).
במהלך העיבוד של התרבות העיקרית (מעבר אפס, P0), כמה סיבוכים עלולים להתרחש כי יכול להפריע לניתוח נתונים ניסיוני (איור 4): מומלץ להיפטר התרבויות ולעבד קרום אחר על זיהוי נוכחות של חיידקים בשל זיהום של ריאגנטים או במהלך תהליך הבידוד (איור 4a); אריתרופוציטים מוגזמת עקב כביסה מספקת של הקרומים (איור 4B); לקויה או לא הדבקה של התאים ללוחות (איור 4C); או תאים עם מורפולוגיה פיברוהפיצוץ (איור 4D), הטוענת כי התאים האנושיים mesenchymal השפיר (hamc) היו מבודדים במקום haec.
המבנה של HAEC תלוי במקור של תאים אלה: תאים מהאזור המשתקף יש מורפולוגיה בצורת מקור וגדלים במונאולייר מרוצף, בניגוד לתאים מאזורי האזור והטבור, אשר להחמיא ו קשקש (איור 5). אלה הנתונים תמיכה כי שכבת האפיתל מן השפיר הוא לא אחיד ברחבי הקרום. במהלך המעברים, גודל התאים מכל האזורים גדל, אך הם שומרים על הטבע האפיתל שלהם ואינם רוכשים מורפולוגיה בפיברומיסט. ואכן, אימונולובורנציה נגד E-קדהרין הראה כי התרבויות העיקריות (P0) ו תת תרבויות (P1-P2) שמרו על פנוטיפ האפיתל שלהם (איור 6), הרומז כי אין זיהום של סוג תא אחר, כגון תאים סטרומה mesenchymal, או אפיתל-mesenchymal המעבר. בנוסף, תאים אלה מראים לא ראיות של מוות התאים על פי שיטת TUNEL (איור משלים 1) אבל הם חיוביים עבור קי-67 מסמן התפשטות (איור 6), למרות התוצאות הקודמות שלנו לא מצאו הבדלים משמעותיים עבור סמן זה בין כל מעבר5.
מספר התאים שהושגו משתנה בהתאם לאזור: 61.6 x 106 ו-71.8 x 106 תאים מהאזורים המשתקפים והמשרים, בהתאמה ופחות מ-1 x 106 לכל מדגם מאזור הטבור (טבלה 1). זה דווח עם פרוטוקול זה כי האזור הטבורי והטבור דומים מאוד בפרופילי הביטוי שלהם, בניגוד לאזורים משתקפים ושלנטל, במיוחד בגנים המשתתפים באינטראקציה של קולטן ECM, הדבקה מוקד, ואת PI3K-Akt איתות מסלול דרך RNA-seq6. בהסכם, מחקר קודם דיווח על הביטוי הדיפרנציאלי של קינאז מיעוגן המופעל חלבון ושינוי גורם הצמיחה מסלולים ביתא, כמו גם ציטוקינים proinflammatory בין שני האזורים17.
למרות שהראיות מצביעות על כך שאוכלוסיות המשנה מהשפיר שונות מאלה של המבנה והתכונות הפיזיולוגיות שלהם, הצגנו בעבר כי הביטוי והנוכחות של הגרעין של גורמי העוצמה אינם משתנים ב-HAEC שנגזר מאזורים שונים ומשתקפים באזור6. בהקשר זה, בנוסף למספר מצומצם יחסית של תאים מאזור הטבור, המחקרים הבאים צריכים להתמקד HAEC מבודדים מתוך האזור ומשתקף שפיר באופן עצמאי, בהתחשב ההשלכות הפיזיולוגיות, כי אוכלוסיות שונות לא יגיב במידה שווה לאירועים ספציפיים, כגון הריון ממושך או תהליכים דלקתיים במהלך העבודה, למרות שאין תאים חיוביים ספציפיים סמנים הראשי pluripotency (איור 7).
איור 1: אזורים אנטומיים מקרום השפיר בקדנציה. קרום הטבור (צהוב), קרום השפיר השלמי (לבן), ומשתקף קרום השפיר (שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח מכני של קרום השפיר. (א) אזור הטבור, (ב) אזור הפלנטל, ו (ג) משתקף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התרבות הראשית הנציגה של HAEC הנגזרת מקרום השפיר. תרבות 48 h לאחר בידוד ללא (א) ו עם (ב) שינוי של מדיה. קנה מידה ברים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיקרוגרפים מייצגים של תוצאות שליליות של התרבות הראשית של HAEC. (א) עודף אריתרופוציטים. (ב) זיהום חיידקי. (ג) haec לא דבקה אחרי 48 h של בידוד. (ד) התרבות הראשית המורכבת מתאים עם מורפולוגיה פיברוהפיצוץ. קנה מידה ברים = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מורפולוגיה של HAEC מאזורים אנטומיים שונים בתוך מבחנה. מיקרוגרפים מייצגים של הנציבות הבין-משתקפת (הפאנל העליון), הפלנטל (הפאנל האמצעי) ואזורים הטבור (פאנל תחתון) תרבותי למרות P0-P2. קנה מידה של פסים 200 = μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ביטוי של E-קדהרין וקי-67 ב-HAEC. תמונות מיקרוסקופ של הנציגה האפינטית של E-קדהרין+ וקי-67+ haec משתקף (פאנל שמאלי) ופלנטל (פאנל ימני) שפיר על התרבות באמצעות P0-P2. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: HAEC מאזורים אנטומיים שונים להציג פאנל סמן של הצבע. הנציגה המייצגת מיקרוסקופית תמונות של החיסונית כפולה של השפיר עבור NANOG עם TRA-1-60, OCT4 עם E-קדהרין, ו SOX2 עם SSEA-4 ב HAEC (P1) משתקף (הפאנל העליון) ו הפלנטל (הפאנל התחתון) אזורים. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ממברנה | יטוי | שיליה | טבור | ממברנה מלאה |
| 1 | 75 X 106 | 130 X 106 | 0.2 X 106 | 205.2 X 106 |
| 2 | 38.5 X 106 | 52 X 106 | 0.53 X 106 | 91.03 X 106 |
| 3 | 59 X 106 | 53 X 106 | 0.2 X 106 | 112.2 X 106 |
| 4 | 42 X 106 | 27 X 106 | 0.36 X 106 | 69.36 X 106 |
| מיכל 5 | 44.8 X 106 | 22.3 X 106 | NP | 76.1 X 106 |
| 6 | 100 X 106 | 140 X 106 | 1 X 106 | 241 X 106 |
| 7 | 72 X 106 | 78 X 106 | NP | 150 X 106 |
| ממוצע | 61.6 X 106 | 71.8 X 106 | 0.45 X 106 | 133.8 X 106 |
שולחן 1: מספר HAEC מבודד לכל אזור מ ממברנות השפיר. (NP = לא מעובד).
איור משלים 1: מכתים את טונאל בהאלק (מעבר 2) מאזור משתקף ובתאי בקרה חיוביים (HL-60 תאים שטופלו באמצעות קמטוטאין). סרגל ברים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מיושמים פרוטוקול חדש כדי לבודד HAEC מקרום המונח. הוא שונה מדיווחים קודמים בכך שכל ממברנה חולקה לשלושת האזורים האנטומיים שלה לפני בידוד כדי לנתח תאים מכל אחד מהם.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא רחיצת הקרום כדי להסיר את כל קרישי הדם, כי הם יכולים להפריע לפעילות של טריפסין בעת הפרדת תאי האפיתל. אי לבצע צעד זה כראוי יכול להוביל להשגת התרבות העיקרית עם אריתרופוציטים מוגזמת ומספר תאים האפיתל חסיד. אם לא נצפתה כל החזקה ב -24 שעות הראשונות לאחר זריעת התאים, אנו ממליצים להשליך את התרבות. נקודה קריטית נוספת היא זמן הדגירה של העיכול האנזימטי. אם תקופת הדגירה ארוכה מדי, יכולת הכדאיות של התא עלולה להקטין ו/או תרביות תאים עם mesenchymal במקום מורפולוגיה אפיתל ניתן להשיג (איור 4). כמו כן, אם העיכול לא נעשה עם עצבנות נכונה, ההסתברות להשגת מספר נמוך של תאים לכל ממברנה מגדילה.
בפרוטוקול זה, אנו יכולים לשמור על אוכלוסיות של HAEC בחוץ מבלי לאבד את הפנוטיפים שלהם אפיתל, כפי שניתן להדגים על ידי נוכחות של סמן תא אפיתל ספציפי E-קדהרין עבור רוב התאים לאורך המעברים (איור 6). עם זאת, בניסיון שלנו ניתן להרחיב את HAEC רק עבור שלושה קטעים (P1-P3). יש לקחת בחשבון את מספר המעברים המוגבל לניסויים הדורשים פרקי זמן ארוכים של תרבות או מעברים מרובים. בנוסף, דווח כי לאחר P3 התאים מתחילים לשנות את המבנה שלהם ולהקטין את הביטוי של E-קדהרין, כך התרבות הממושכת יכול לגרום האפיתל-mesenchymal מעבר (האמבולנס)18. לאחרונה, זה היה הוכיח כי פרוגסטרון מונע בתוך התאים האפיתל השפיר כבש19,20, כך זה יהיה מעניין לנתח את ההשפעה של ריכוזים שונים של פרוגסטרון במדיום התרבות haec כדי למנוע את הפנוטיפ mesenchymal לאחר המעבר השלישי.
בכל הדיווחים הקודמים כאשר HAEC היו מבודדים, בדיקת השפיר הניחו כי היא רקמה אחידה למרות הטרוגניות אפשרי של אוכלוסיות אפיתל המרכיבים את הקרום כולו. לעומת זאת, פרוטוקול זה מחלק את הקרום לתוך שלושת האזורים האנטומיים שלה לבידוד בנפרד התרבות HAEC בהתחשב מורפולוגית הקודם ביטוי גנטי דוחות המציעים הבדלים פונקציונליים. זה גם מיותר לטהר דרך מיון התא כדי להשיג רק אוכלוסיות אפיתל, כפי שניתן להדגים על ידי זיהוי של הסמן E-cadherin במהלך מעברים עד P2.
זה הוכח כי מבודד HAEC מכל אחד מאזורי הקרום יש ביטוי דומה של ליבת הפלדה, להיות מאגר חבוי של תאים עם שורשים. בהקשר זה, תאים אלה יכולים לשמש בתחום החוץ כדי ללמוד מנגנונים מולקולריים, כגון לוקליזציה דינמית של גורמי שעתוק הקשורים pluripotency או יכולתם להישאר שקט למרות המבטא גנים הקשורים לסרטן, ללא קשר לאזור האנטומי שלהם של המקור. עם זאת, מחקר עתידי חייב לשקול הבדלים מולקולריים שדווחו (גנים ביטוי גלובלי, פעילות מטבולית, איתות מסלולים) בין כל אזור, אשר היו השלכות על היישום שלהם ברפואה רגנרטיבית. בעבר דיווחו על ביטוי שונה של גנים מעורבים PI3K/AKT והדבקה מיקוד מסלולים איתות בין אזורי השפיר השונים על ידי RNA-seq6. PI3K/akt ויסות התחדשות עצמית ושמירה על פלוריאון ב-hpsc, תוך הפעלת מוקד הדבקה קינאז מקדמת בידול שלהם21,22. כך, אנו מציעים לאפיין את התפקיד של שני מסלולים ב HAEC מבודדים מאזורים אנטומיים שונים במהלך שושלת היוחסין ספציפי פרוטוקולים. בנוסף, מספר מחקרים מדגימים את ההבדלים בין שני האזורים בנוגע לרכיבים סלולאריים, לתפקוד מולקולרי ולתהליכים ביולוגיים. לדוגמה, הביטוי הגנטי הספציפי לאזור והפצת החלבונים של אקופורטל, המעורבים בתהליך התעבורה של קליטת intramembranous, דווחו על23. מחקר נוסף בהשוואה miRNome על ידי microarrays ערכים, הצגת ביטוי ספציפי לאזור של מיר-145 ו מיר-143, האחרון להיות מסוגל פוסט להסדיר את prostaglandin-endoperoxidase סטנדרטים 2 בתנאים ספציפיים כגון עבודה בטווח16. יתר על כן, אזור הסביבה מציג נשימה מיטוכונדריאלי גבוה יותר, אך זיהוי מיני חמצן תגובתי נמוכה יותר לעומת רקמות משתקף15. מבתר את השפיר באזורים משתקפים ושלבית מומלץ לבודד HAEC ולנתח את המאפיינים השונים שלהם בנפרד, כגון שחרורו של גורמי הצמיחה ציטוקינים, החיסוני הנמוך שלהם, ייצור של מטריקס מסחטות, את ההשפעה של המדיום הממוזג שלהם עם סוגי תאים אחרים, פונקציות הרומן כגוןהיכולת שלהם
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחקר שלנו נתמך על ידי מענקים ממכון הלאומי לחקר הנאסיונאל דה מקסיקו (21041 ו-21081) ו-CONACYT (A1-S-8450 ו-252756). אנו מודים לג גונזלס נוריס ו לידיה יוריה Paredes Vivas לתמיכה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , Springer. 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
