Summary
Denne protokollen beskriver isolering av epitelceller fra ulike anatomiske områder av den menneskelige fostervann membranen for å bestemme deres heterogenitet og funksjonelle egenskaper for mulig anvendelse i kliniske og physiopathological modeller.
Abstract
Flere protokoller har blitt rapportert i litteraturen for isolering og kultur av humant fostervann epitelceller (HAEC). Men disse forutsetter at fostervann epitel er et homogen lag. Den menneskelige amnion kan deles inn i tre anatomiske områder: reflektert, placenta og navle. Hver region har ulike fysiologiske roller, for eksempel i patologiske tilstander. Her over, vi beskrive en protokollen å analysere Human amnion tissue inne tre avdelinger og vedlikeholde den inne vitro. I kultur, celler avledet fra reflektert amnion vist en kubisk morfologi, mens celler fra både placenta og navle områder ble plateepitel. Likevel, alle cellene innhentet har en epitel fenotype, demonstrert av immunodetection av E-cadherin. Derfor, fordi placenta og reflekterte regionene i situ varierer i cellulære komponenter og molekylære funksjoner, kan det være nødvendig for in vitro studier å vurdere disse forskjellene, fordi de kan ha fysiologiske implikasjoner for bruk av HAEC i biomedisinsk forskning og lovende anvendelse av disse cellene i regenererende medisin.
Introduction
Human fostervann epitelceller (HAEC) stamme under de tidlige stadiene av embryonale utvikling, på rundt åtte dager postfertilization. De oppstår fra en befolkning av plateepitel epitelceller i epiblast som stammer fra det innerste laget av fostervann membran1. Dermed HAEC anses rester av pluripotent celler fra epiblast som har potensial til å differensiere i tre bakterie lag av embryo2. I det siste tiåret har ulike forskningsgrupper utviklet metoder for å isolere disse cellene fra fostervann membran på begrepet av svangerskapet for å karakterisere deres presumptive pluripotency-relaterte egenskaper i en kultur modell in vitro3,4.
Følgelig har det blitt funnet at HAEC funksjon trekk karakteristisk for menneskelige Pluripotent stamceller (HPSC), slik som overflaten antigener SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; kjernen i pluripotency transkripsjon faktorer OCT4, SOX2, og NANOG; og spredning markør KI67, noe som tyder på at de er selv fornye5,6,7. Videre har disse cellene blitt utfordret ved hjelp av differensiering protokoller for å få celler positive for avstamning-spesifikke markører av de tre bakterie lag (ektoderm, mesoderm, og endoderm)4,5,8, så vel som i dyremodeller av menneskelige sykdommer. Til slutt, HAEC Express E-cadherin, som viser at de beholder en epitel natur mye som HPSC5,9.
Bortsett fra deres embryonale opprinnelse, HAEC har andre iboende egenskaper som gjør dem egnet for ulike kliniske anvendelser, slik som utskillelsen av anti-inflammatorisk og antibakterielle molekyler10,11, vekstfaktorer og cytokin Release12, ingen dannelse av teratomer når de er transplantert inn immunodeficient mus i kontrast med HPSC2, og immunologiske toleranse fordi de uttrykker HLA-G, noe som reduserer risikoen for avvisning etter transplantasjon13.
Men tidligere rapporter har antatt at den menneskelige amnion er en homogen membran, uten å vurdere at det kan være anatomisk og fysiologisk delt inn i tre regioner: placenta (den amnion som dekker Vertsplanter basalis), navle (den delen som omslutter den navlestreng), og reflektert (resten av membranen ikke festet til morkaken)14. Det har vist seg at de placenta og reflekterte regionene i amnion vise forskjeller i morfologi, mitokondrie aktivitet, påvisning av reaktive oksygen arter15, miRNA Expression16, og aktivering av signalering trasé17. Disse resultatene tyder på at den menneskelige amnion er integrert av en heterogen befolkning med ulik funksjonalitet som bør vurderes for videre studier utført i enten in situ eller in vitro-modeller. Mens andre laboratorier har utformet protokoller for isolering av HAEC fra hele membranen, har vårt laboratorium etablert en protokoll for å isolere, kultur og karakterisere celler fra ulike anatomiske områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av den etiske komiteen Instituto Nacional de Perinatología i Mexico City (registernummer 212250-21041). Alle prosedyrene som ble utført i disse studiene var i samsvar med de etiske standardene til Instituto Nacional de Perinatología, Helsingfors-erklæringen og de retningslinjer som er fastsatt i Helsedepartementet ' s Official Mexican standard.
1. forberedelse
- Forbered en løsning av 1x PBS med EDTA. For å gjøre dette legger du til 500 μL av 0,5 M EDTA-lager i 500 mL 1x PBS for en endelig konsentrasjon på 0,5 mM EDTA.
- Forbered kultur mediet for HAEC. Ta 450 mL høy glukose-DMEM, supplere den med 5 mL natrium pyruvat (100 mM), 50 mL av varme-inaktiv fosterets blod serum kvalifisert for stamceller, 5 mL av unødvendige aminosyrer (100 mM), 5 mL antibiotika-antimykotisk (100 m), 5 mL L-glutamin (200), og 500 μL av mercaptoethanol (1, 000x).
- Sterilisere beholderne for transport og behandling av vevet: en rustfritt stål beholder med et lokk for å transportere hele placenta fra operasjonssalen til laboratoriet, et brett (20 cm x 30 cm x 8 cm) for å vaske og fjerne blod fra hele morkaken før Disseksjon av fostervann membranen, og en plast skjærebrett å skille fostervann membranen inn i de tre regionene.
- Sterilisere de kirurgiske instrumentene (skalpeller, sakser, pinsett og klemmer), 500 mL kanner, bomulls gauzes og saltoppløsning.
2. innhenting av placenta
Merk: fostervann membraner ble innhentet fra kvinner ved heltids svangerskap (37 − 40 uker), under indikasjon av keisersnitt levering, uten noen bevis på aktiv arbeidskraft, og ingen mikrobiologisk karakteristikk av smitte. Den komplette isolasjon og kultur prosedyrer ble utført i et biosikkerhet kabinett under sterile forhold.
- I operasjonsstuen, klemme navlestrengen for å hindre at blodstrømmen til resten av vevet. Samle hele morkaken med navlestrengen klemt i den sterile beholderen.
- Tilsett 500 mL saltoppløsning til beholderen for å hydrere morkaken.
- Lukk beholderen og transporter vevet til laboratoriet ved romtemperatur.
- Sett beholderen med morkaken inne i biosikkerhet skapet.
Merk: i tilfelle disseksjon ikke er utført innen 15 min for å samle morkaken, lagre beholderen med morkaken på isen til behandling. Unngå mer enn 1 time av medgått tid mellom å få morkaken og starten av disseksjon.
3. mekanisk separasjon per region av fostervann membranen
Merk: prosedyren må utføres i et biosikkerhet kabinett under sterile forhold og ved romtemperatur.
- Fjern hele placenta fra beholderen og legg den på brettet med navlestrengen vendt oppover.
- Ved hjelp av en steril bomulls gasbind, rengjør blodpropp fra overflaten av chorionic-amnion som dekker morkaken.
- Identifiser de tre regionene i membranen: navle amnion omslutter navlestrengen, den placenta amnion dekker Vertsplanter basalis, og den reflekterte regionen, som er resten av amnion som ikke er festet til morkaken (figur 1).
- Analysere navle amnion regionen (figur 2a).
- Ved hjelp av dissekere tang, hold den delen av amnion membran som dekker krysset av morkaken og navlestrengen.
- Med en skalpell, analysere regionen som omgir ledningen mens stretching å skille den fra chorionic.
- Sett det separerte vevet inn i et merket beger med 100 mL saltoppløsning.
- Analysere placenta amnion regionen (figur 2b).
- Med en steril bomull gasbind, fjerne blodpropp fra overflaten av chorionic-amnion som dekker morkaken.
- Hold membranen på grensen mellom morkaken og den reflekterte regionen med dissekere tang.
- Skjær langs omkretsen av morkaken med skalpell.
- Skill placenta amnion fra chorionic, være forsiktig med å kutte noen fartøy fra morkaken.
- Plasser det separerte vevet i et annet merket beger med 300 mL saltoppløsning.
- Skill resten av fostervann membranen som ikke er festet til morkaken (dvs. den reflekterte delen) fra chorionic (figur 2C).
- Samle det reflekterte området i et annet merket beger med 300 mL saltoppløsning.
Merk: tilsett saltvannsoppløsning kontinuerlig under disseksjon for å hindre at vevet tørker ut.
- Samle det reflekterte området i et annet merket beger med 300 mL saltoppløsning.
4. vasking av membraner
Merk: prosedyren må utføres i et biosikkerhet kabinett under sterile forhold ved romtemperatur.
- Kast saltvann oppløsningen til hver membran region separat.
- Tilsett 100 mL frisk saltvann oppløsning til navle regionen.
- Tilsett 300 mL frisk saltvann oppløsning til henholdsvis morkaken og de reflekterte regionene.
- Rør membraner ved hjelp av dissekere tang for å fjerne blod rester.
- Kast saltvann oppløsningen.
- Gjenta vasker og agitasjon minst 3x til membraner er gjennomsiktige.
- Plasser og utvide membraner på brettet for å rengjøre med sterilt gasbind blodpropp som ikke ble fjernet med vasker.
Merk: det er svært viktig å fjerne så mange erytrocytter som mulig, som deres tilstedeværelse påvirker Trypsin funksjon og levedyktigheten til påfølgende cellekulturer.
5. enzymatisk fordøyelse av membraner fra ulike regioner
Merk: prosedyren må utføres i et biosikkerhet kabinett under sterile forhold.
- Skjær de reflekterte og placenta regionene i to eller tre fragmenter.
- Ikke skjær navle regionen.
- Plasser fragmenter av hver region i sentrifugerør. Tilsett 20 mL 0,5% Trypsin/EDTA til de reflekterte og placenta regionene og 5 mL 0,5% Trypsin/EDTA til navle regionen, henholdsvis.
Merk: det er viktig å klippe de reflekterte regionene og placenta i mindre biter fordi de må være helt nedsenket i den Trypsin løsningen. - Rist sentrifuge rørene lett i 30 s. kast Trypsin.
- Tilsett 30 mL nye 0,5% Trypsin/EDTA til de reflekterte og placenta regionene og 15 mL nye 0,5% Trypsin/EDTA til navle regionen, henholdsvis.
- Plasser rørene i en Rotator inne i inkubator.
- Ruge med rotasjon (20 RPM) for 40 min ved 37 ° c.
Merk: Hvis en tube Rotator ikke er tilgjengelig, rist rørene lett manuelt hver 10 min. - Overfør Trypsin/celle løsninger fra hver region til nye sentrifugerør.
- Legg til 2x volumet av HAEC Media prewarmed ved 37 ° c per rør for å deaktivere enzymet.
- Lagre den første fordøyelsen på isen.
- Gjenta trinn 5.6 − 5.8 for en ny fordøyelse periode.
- For hver region, hold den ene enden av amnion delen ved hjelp av dissekere tang, og med et annet par klem langs vevet for å fjerne rader av epitelceller som ikke helt skrelle av under forrige inkubasjons perioder.
- Samle den andre fordøyelsen til et annet sett med sentrifugerør og Deaktiver med 2x volumet av HAEC Media.
- Kast de fordøyd membraner i en Biohazard container.
6. isolering av HAEC
Merk: prosedyren må utføres i et biosikkerhet kabinett under sterile forhold.
- Sentrifuger alle rør ved 200 x g i 10 min ved 4 ° c.
- Kast supernatanten og tilsett 10 mL prewarmed HAEC medium (til 37 ° c) per rør og Pipet forsiktig for å disaggregate hver pellet.
- Kombiner de cellulære suspensjoner av de to digestions i et individuelt rør for hver membran regionen.
- Filtrer mobilnettet suspensjoner bruker 100 μm celle siler å fjerne ekstracellulære matrise rusk og få enkeltceller.
- Forbered tre alikvoter med 90 μL av trypan blå i et mikrosentrifugen rør.
- Tilsett 10 μL av hver celle suspensjon per membran region i mikrosentrifugen tuber og bland.
- Tell cellene med en hemocytometer under et lett felt mikroskop.
7. HAEC kultur
- Seed den HAEC fra de tre regionene separat med en tetthet på 3 × 104 celler/cm2 med prewarmed HAEC Media, supplert med 10 ng/ml av menneskelig EPIDERMAL vekstfaktor (EGF).
- Seed cellene i 100 mm plater for å opprettholde dem in vitro eller i 24 brønn plater for talipes analyse.
- Ruge rettene ved 37 ° c under normoxic forhold (5% CO2) i en fuktet inkubator.
- Legg EGF daglig og endre medium hver tredje dag.
Merk: cellene vil bli confluent etter 4 − 6 dager. - Bruk cellene for konvensjonell immunhistokjemi, celle sortering analyse, cryopreserving, RNA og protein utvinning, eller for å fortsette passasjen.
8. passering av HAEC
- Fjern HAEC medium og vask 2x med PBS/EDTA 0.01 M-oppløsning.
- Ruge med en PBS/EDTA 0.01 M løsning for 15 min ved 37 ° c.
- Fjern PBS/EDTA og tilsett 1,5 mL 0,5% Trypsin/EDTA.
- Ruge for 5 − 8 min ved 37 ° c.
- Deaktiver enzymet med to volumer med HAEC-medium.
- Samle blandet løsning og sentrifuge i 5 min ved 200 x g.
- Telle cellene og fortsette med følgende passasjer eller bruke cellene for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HAEC ble isolert fra hver av de tre anatomiske regionene i fostervann membranen og individuelt kultivert in vitro. Etter 48 h av kultur, celler med et epitel fenotype levd opp til overflaten av platen, selv om mediene også inneholdt celle rusk og flytende celler, som ble fjernet når mediet ble endret (Figur 3).
Under behandlingen av primær kultur (passasje null, p0), kan noen komplikasjoner oppstå som kan forstyrre den eksperimentelle dataanalyse (Figur 4): det er tilrådelig å forkaste kulturer og behandle en annen membran ved identifisering av tilstedeværelsen av bakterier på grunn av forurensning av reagensene eller under isolasjons prosessen (figur 4a); overdreven erytrocytter på grunn av utilstrekkelig vasking av membraner (figur 4b); mangelfull eller ingen vedheft av cellene til platene (figur 4c); eller celler med Fibroblast morfologi (figur 4d), noe som tyder på at menneskelige fostervann mesenchymal celler (HAMC) ble isolert i stedet for HAEC.
HAEC morfologi avhenger av opprinnelsen til disse cellene: celler fra den reflekterte sonen har en kubisk morfologi og vokser i en brosteinsbelagte monolag, i motsetning til celler fra placenta og navle områder, som er flatere og plateepitel (figur 5). Disse dataene støtter at epitel laget fra amnion ikke er ensartet i hele membranen. Under passasjer, størrelsen på cellene fra alle regioner øker, men de opprettholder sine epitel natur og ikke erverve en Fibroblast morfologi. Faktisk, immunofluorescence mot E-cadherin viste at den primære kulturer (p0) og subkulturer (P1-P2) opprettholdt sine epitel fenotype (figur 6), noe som tyder på at det ikke er forurensning av en annen celle type, for eksempel mesenchymal stromal celler, eller epitel-mesenchymal overgang. I tillegg, disse cellene viser ingen tegn til celle død i henhold til TUNEL analysen (supplerende figur 1), men er positive for KI-67 spredning markør (figur 6), selv om våre tidligere resultater fant ingen vesentlige forskjeller for denne markøren mellom hver passasje5.
Antall celler oppnådd varierer i henhold til regionen: 61,6 x 106 og 71,8 x 106 celler fra de reflekterte og placenta regioner, henholdsvis, og mindre enn 1 x 106 per prøve fra navle regionen (tabell 1). Det har blitt rapportert med denne protokollen at placenta og navle regionen er svært like i sine uttrykks profiler, i motsetning til de reflekterte og placenta regioner, spesielt i gener som deltar i ECM reseptor interaksjon, fokus vedheft, og PI3K-akt signalering veien gjennom RNA-SEQ6. I avtalen, en tidligere studie rapporterte differensial uttrykk for mitogen-aktivert protein kinase og transformere vekstfaktor beta trasé, samt proinflammatoriske cytokiner mellom begge regionene17.
Selv om bevisene viste at subpopulasjoner fra amnion varierer i deres morfologi og fysiologiske egenskaper, har vi tidligere vist at uttrykket og tilstedeværelsen av kjernen av de pluripotency faktorene ikke endres i HAEC avledet fra placenta og reflekterte regioner6. I denne sammenhengen, i tillegg til relativt begrenset antall celler fra navle-regionen, bør påfølgende studier fokusere på isolerte HAEC fra placenta og reflektert amnion uavhengig, med tanke på fysiologiske implikasjoner, fordi de ulike subpopulasjoner ikke ville reagere likt på konkrete hendelser, for eksempel langvarig graviditet eller inflammatoriske prosesser under arbeid, selv om det ikke er noen spesifikke positive celler til de viktigste pluripotency markører (figur 7).
Figur 1: anatomiske områder fra fostervann membranen på sikt. Navle fostervann membran (gul), placenta fostervann membran (hvit), og reflektert fostervann membran (svart). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: mekanisk Disseksjon av fostervann membranen. (A) navle-region, (B) placenta og (C) reflektert område. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representativ primær kultur for HAEC avledet fra fostervann membranen. Kultur 48 etter isolasjon uten (A) og med (B) en endring av Media. Skala bars = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative micrographs av negative resultater fra primær kulturen i HAEC. (A) overskudd av erytrocytter. (B) bakteriell forurensning. (C) HAEC ikke overholdt etter 48 h av isolasjon. (D) primær kultur bestående av celler med Fibroblast morfologi. Skala bars = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: morfologi av HAEC fra ulike anatomiske områder in vitro. Representative micrographs av confluent HAEC fra reflektert (øvre panel), placenta (midtre panel) og navle (nedre panel) regioner kultivert om p0 − P2. Skala bars 200 = μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: uttrykk for E-cadherin og KI-67 i HAEC. Representative epifluorescence mikroskopi bilder av E-cadherin+ og KI-67+ HAEC fra reflektert (venstre panel) og placenta (høyre panel) amnion kultivert gjennom p0 − P2. Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: HAEC fra ulike anatomiske områder viser et pluripotency markør panel. Representative konfokalmikroskopi mikroskopi bilder av doble immunofluorescence amnion for NANOG med TRA-1-60, OCT4 med E-cadherin og SOX2 med SSEA-4 i HAEC (P1) fra reflektert (øvre panel) og områder med placenta (nedre panel). Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| # MEMBRAN | Reflektert | Placental | Umbilical | KOMPLETT MEMBRAN |
| 1 | 75 X 106 | 130 X 106 | 0,2 X 106 | 205,2 X 106 |
| 2 | 38,5 X 106 | 52 X 106 | 0,53 X 106 | 91,03 X 106 |
| 3 | 59 X 106 | 53 X 106 | 0,2 X 106 | 112,2 X 106 |
| 4 | 42 X 106 | 27 X 106 | 0,36 X 106 | 69,36 X 106 |
| 5 | 44,8 X 106 | 22,3 X 106 | Np | 76,1 X 106 |
| 6 | 100 X 106 | 140 X 106 | 1 X 106 | 241 X 106 |
| 7 | 72 X 106 | 78 X 106 | Np | 150 X 106 |
| Gjennomsnittlig | 61,6 X 106 | 71,8 X 106 | 0,45 X 106 | 133,8 X 106 |
Tabell 1: antall HAEC isolert per region fra fostervann membraner. (NP = ikke behandlet).
Supplerende figur 1: TUNEL farging i HAEC (passasje 2) fra reflektert region og i positive kontroll celler (HL-60 celler behandlet med camptothecin). Skala bars = 50 μm. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi implementerte en ny protokoll for å isolere HAEC fra term membraner. Det skiller seg fra tidligere rapporter i at hver membran ble delt inn i sine tre anatomiske områder før isolasjon for å analysere celler fra hver enkelt.
En av de mest kritiske trinnene i protokollen er vasking av membranen for å fjerne alle blodpropp, fordi de kan forstyrre aktiviteten av Trypsin når skille epitelceller. Unnlatelse av å gjennomføre dette trinnet riktig kan føre til å få en primær kultur med overdreven erytrocytter og få tilhenger epitelceller. Hvis det ikke er observert noen vedlegg i de første 24 − 48 h etter seeding cellene, anbefaler vi å forkaste kulturen. Et annet kritisk punkt er inkubasjonstid for enzymatisk fordøyelsen. Hvis inkubasjonsperioden er for lang, kan celle levedyktigheten reduseres og/eller cellekulturer med mesenchymal i stedet for epitel morfologi kan fås (Figur 4). Også, hvis membranen fordøyelsen ikke er gjort med riktig agitasjon, øker sannsynligheten for å få et lavt antall celler per membran.
I denne protokollen, kan vi opprettholde populasjoner av HAEC in vitro uten å miste sine epitel fenotype, som demonstrert av tilstedeværelsen av spesifikke epitel celle markør E-cadherin for de fleste celler langs passasjer (figur 6). I vår erfaring kan imidlertid HAEC bare utvides for tre passasjer (P1 − P3). Det begrensede antallet passasjer bør tas i betraktning for eksperimenter som krever lange perioder med kultur eller flere passasjer. I tillegg har det blitt rapportert at etter P3 cellene begynner å endre sin morfologi og redusere uttrykk for E-cadherin, slik at langvarig kultur kan indusere epitel-mesenchymal overgang (EMT)18. Nylig ble det demonstrert at progesteron hindrer EMT i sau fostervann epitelceller19,20, så det ville være interessant å analysere effekten av ulike konsentrasjoner av progesteron i HAEC kultur medium for å unngå mesenchymal fenotype etter den tredje passasjen.
I alle tidligere rapporter der HAEC ble isolert, har amnion blitt antatt å være et ensartet vev til tross for den mulige heterogenitet av epitel populasjoner som utgjør hele membranen. I kontrast, denne protokollen deler membranen i sine tre anatomiske områder til separat isolere og kultur HAEC vurderer forrige morfologiske og genuttrykk rapporter som tyder på funksjonelle forskjeller. Det er også unødvendig å rense gjennom celle sortering for å få bare epitel populasjoner, som demonstrert ved påvisning av E-cadherin markør under passasjer til P2.
Det har vist seg at isolerte HAEC fra hver av membran regionene har et lignende uttrykk for pluripotency kjerne, som er en latent reservoar av celler med stemness. I denne sammenhengen kan disse cellene brukes in vitro for å studere molekylære mekanismer, slik som dynamisk lokalisering av pluripotency-relaterte transkripsjon faktorer eller deres evne til å forbli Quiescent tross uttrykker kreft-assosiert gener, uavhengig av deres anatomiske opprinnelsesland. Imidlertid må fremtidig forskning vurdere molekylære forskjeller rapportert (Global uttrykk gener, metabolsk aktivitet, signalering trasé) mellom hver region, som ville ha konsekvenser for deres anvendelse i regenererende medisin. Vi har tidligere rapportert et annet uttrykk for gener involvert i PI3K/AKT og fokus vedheft signalering trasé mellom de ulike fostervann regioner av RNA-SEQ6. PI3K/akt regulerer selv fornyelse og opprettholder pluripotency i HPSC, mens aktivering av fokal vedheft kinase fremmer deres differensiering21,22. Derfor foreslår vi å karakterisere rollen til begge banene i HAEC isolert fra ulike anatomiske regioner under avstamning-spesifikke differensiering protokoller. I tillegg viser flere studier forskjellene mellom begge regionene når det gjelder cellulære komponenter, molekylær funksjon og biologiske prosesser. For eksempel har de områdespesifikke genuttrykk og protein fordeling av akvaporiner, som er involvert i transport prosessen av Intramembranous absorpsjon, blitt rapportert23. En annen studie sammenlignet miRNome av Microarrays, viser region-spesifikke uttrykk for miR-145 og miR-143, sistnevnte var i stand til å posttranscriptionally regulere prostaglandin-endoperoxidase syntase 2 under bestemte forhold som arbeidskraft på sikt16. Videre presenterer i placenta regionen høyere mitokondrie åndedrett, men lavere reaktive oksygen arter deteksjon sammenlignet med reflektert vev15. Dissekere den amnion i reflektert og placenta områder oppfordres til å isolere HAEC og analysere sine særegne egenskaper separat, for eksempel frigjøring av vekstfaktorer og cytokiner, deres lave immunogenisitet, produksjon av ekstracellulære matrise, effekten av deres betinget medium i coculture med andre celletyper, og romanen funksjoner som deres evne til å opprettholde HPSC linjer som en mater lag24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vår forskning ble støttet av tilskudd fra Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 og 21081) og CONACYT (a1-S-8450 og 252756). Vi takker Jessica González Norris og Lidia Yuriria Paredes Vivas for teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , Springer. 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
