Summary
Este protocolo describe el aislamiento de células epiteliales de diferentes regiones anatómicas de la membrana amniótica humana para determinar su heterogeneidad y propiedades funcionales para su posible aplicación en modelos clínicos y fisiopatológicos.
Abstract
Se han reportado varios protocolos en la literatura para el aislamiento y el cultivo de células epiteliales amnióticas humanas (HAEC). Sin embargo, estos suponen que el epitelio amniótico es una capa homogénea. El amnion humano se puede dividir en tres regiones anatómicas: reflejada, placentaria y umbilical. Cada región tiene diferentes funciones fisiológicas, como en condiciones patológicas. Aquí, describimos un protocolo para diseccionar el tejido amnión humano en tres secciones y mantenerlo in vitro. En el cultivo, las células derivadas del amnion reflejado mostraron una morfología cuboidal, mientras que las células de las regiones placentaria y umbilical eran escamosas. No obstante, todas las células obtenidas tienen un fenotipo epitelial, demostrado por la inmunodetección de la E-cadherina. Por lo tanto, debido a que las regiones placentarias y reflejadas in situ difieren en los componentes celulares y las funciones moleculares, puede ser necesario que los estudios in vitro consideren estas diferencias, ya que podrían tener implicaciones fisiológicas para el uso de HAEC en investigación biomédica y la aplicación prometedora de estas células en la medicina regenerativa.
Introduction
Las células del epitelio amniótico humano (HAEC) se originan durante las primeras etapas del desarrollo embrionario, alrededor de ocho días después de la fertilización. Surgen de una población de células epiteliales escamosas del epiblasto que derivan de la capa más interna de la membrana amniótica1. Por lo tanto, HAEC se consideran restos de células pluripotentes del epiblasto que tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas germinales del embrión2. En la última década, diversos grupos de investigación han desarrollado métodos para aislar estas células de la membrana amniótica a término de gestación para caracterizar sus propiedades presuntas relacionadas con la pluripotencia en un modelo de cultivo in vitro3,4.
En consecuencia, se ha encontrado que HAEC presenta rasgos característicos de las células madre pluripotentes humanas (HPSC), como los antígenos superficiales SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; el núcleo de los factores de transcripción pluripotencia OCT4, SOX2 y NANOG; y el marcador de proliferación KI67, lo que sugiere que se autornuevan5,6,7. Además, estas células han sido desafiadas utilizando protocolos de diferenciación para obtener células positivas para marcadores específicos de linaje de las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endoderm)4,5,8, así como en modelos animales de enfermedades humanas. Por último, HAEC expresa E-cadherin, que demuestran que conservan una naturaleza epitelial muy similar a la HPSC5,9.
Aparte de su origen embrionario, HAEC tiene otras propiedades intrínsecas que las hacen adecuadas para diferentes aplicaciones clínicas, como la secreción de moléculas antiinflamatorias y antibacterianas10,11, factores de crecimiento y citoquinaliberación 12,sin formación de teratomas cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes en contraste con HPSC2,y tolerancia inmunológica porque expresan HLA-G, lo que disminuye el riesgo de rechazo después de trasplante13.
Sin embargo, informes anteriores han supuesto que el amnion humano es una membrana homogénea, sin tener en cuenta que puede dividirse anatómica y fisiológicamente en tres regiones: placenta (el amnion que cubre la decidua basalis),umbilical (la parte que envuelve el cordón umbilical), y reflejado (el resto de la membrana no unida a la placenta)14. Se ha demostrado que las regiones placentarias y reflejadas del amnión muestran diferencias en morfología, actividad mitocondrial, detección de especies reactivas de oxígeno15,expresión de miRNA16,y activación de las vías de señalización17. Estos resultados sugieren que el amnion humano está integrado por una población heterogénea con una funcionalidad diferente que debe considerarse para estudios posteriores realizados en modelos in situ o in vitro. Mientras que otros laboratorios han diseñado protocolos para el aislamiento de HAEC de toda la membrana, nuestro laboratorio ha establecido un protocolo para aislar, cultivar y caracterizar células de diferentes regiones anatómicas.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el comité ético del Instituto Nacional de Perinatología en la Ciudad de México (Número de Registro 212250-21041). Todos los procedimientos realizados en estos estudios se ajustaron a las normas éticas del Instituto Nacional de Perinatología, la Declaración de Helsinki y las directrices establecidas en la Norma Oficial Mexicana del Ministerio de Salud.
1. Preparación
- Prepare una solución de 1x PBS con EDTA. Para ello, añada 500 ml de stock EDTA de 0,5 M en 500 ml de 1PBS para una concentración final de 0,5 mM EDTA.
- Prepare el medio de cultivo para HAEC. Tomar 450 ml de alto nivel de glucosa-DMEM, complementarlo con 5 ml de piruvato sódico (100 mM), 50 ml de suero bovino fetal inactivo por calor calificado para células madre, 5 ml de aminoácidos no esenciales (100x), 5 ml de antibiótico-antimicótico (100x), 5 ml de L-glutamina (200 mM), y 500 l de mercaptoetanol (1.000x).
- Esterilizar los recipientes para el transporte y procesamiento del tejido: un recipiente de acero inoxidable con tapa para transportar toda la placenta desde el quirófano hasta el laboratorio, una bandeja (20 cm x 30 cm x 8 cm) para lavar y extraer la sangre de toda la placenta antes de la disección de la membrana amniótica, y una tabla de cortar de plástico para separar la membrana amniótica en las tres regiones.
- Esterilice los instrumentos quirúrgicos (escalpelos, tijeras, fórceps y abrazaderas), vasos de 500 ml, gasas de algodón y solución salina.
2. Obtención de tejido placentario
NOTA: Las membranas amnióticas se obtuvieron de mujeres en gestación a término (37-40 semanas), bajo indicación de parto por cesárea, sin evidencia de trabajo activo, y sin características microbiológicas de la infección. Los procedimientos completos de aislamiento y cultivo se llevaron a cabo dentro de un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles.
- En el quirófano, sujete el cordón umbilical para evitar el flujo sanguíneo al resto del tejido. Recoger toda la placenta con el cordón umbilical sujeto en el recipiente estéril.
- Añadir 500 ml de solución salina al recipiente para hidratar la placenta.
- Cierre el recipiente y transporte el tejido al laboratorio a temperatura ambiente.
- Coloque el recipiente con la placenta dentro del gabinete de bioseguridad.
NOTA: En caso de que la disección no se lleve a cabo dentro de los 15 minutos posteriores a la recolección de la placenta, guarde el recipiente con la placenta sobre hielo hasta su procesamiento. Evitar más de 1 h de tiempo transcurrido entre la obtención de la placenta y el inicio de la disección.
3. Separación mecánica por región de la membrana amniótica
NOTA: El procedimiento debe llevarse a cabo dentro de un armario de bioseguridad en condiciones estériles y a temperatura ambiente.
- Retire toda la placenta del recipiente y colóquela en la bandeja con el cordón umbilical hacia arriba.
- Con una gasa de algodón estéril, limpie los coágulos de sangre de la superficie del coro-amnion que cubre la placenta.
- Identificar las tres regiones de la membrana: el amnión umbilical que envuelve el cordón umbilical, el amnion placentario que cubre la decidua basalis, y la región reflejada, que es el resto de amnion que no está unido a la placenta(Figura 1).
- Diseccionar la región amnion umbilical(Figura 2A).
- Usando fórceps dissección, sostenga la porción de membrana amnion que cubre la unión de la placenta y el cordón umbilical.
- Con un bisturí, disecciona la región que rodea el cordón mientras se estira para separarlo del coro.
- Deposite el tejido separado en un vaso de precipitados etiquetado con 100 ml de solución salina.
- Diseccionar la región del amnión placentario(Figura 2B).
- Con una gasa de algodón estéril, retire los coágulos de sangre de la superficie del coro-amnion que cubre la placenta.
- Sostenga la membrana en la frontera entre la placenta y la región reflejada con fórceps disecantes.
- Corte a lo largo de la circunferencia de la placenta con el bisturí.
- Separar el amnion placentario del coro, teniendo cuidado de no cortar ningún vaso de la placenta.
- Coloque el tejido separado en otro vaso etiquetado con 300 ml de solución salina.
- Separe el resto de la membrana amniótica que no está unida a la placenta (es decir, la porción reflejada) del coro(Figura 2C).
- Recoja la región reflejada en otro vaso etiquetado con 300 ml de solución salina.
NOTA: Agregue la solución salina continuamente durante la disección para evitar que el tejido se seque.
- Recoja la región reflejada en otro vaso etiquetado con 300 ml de solución salina.
4. Lavar las membranas
NOTA: El procedimiento debe llevarse a cabo dentro de un armario de bioseguridad en condiciones estériles a temperatura ambiente.
- Deseche la solución salina de cada región de membrana por separado.
- Añadir 100 ml de solución salina fresca a la región umbilical.
- Añadir 300 ml de solución salina fresca a las regiones placentarias y reflejadas respectivamente.
- Revuelva las membranas con la ayuda de disección de fórceps para eliminar los residuos de sangre.
- Deseche la solución salina.
- Repita los lavados y agitación al menos 3 veces hasta que las membranas sean translúcidas.
- Coloque y extienda las membranas en el tablero para limpiar con gasa estéril los coágulos de sangre que no se eliminaron con los lavados.
NOTA: Es muy importante eliminar tantos eritrocitos como sea posible, ya que su presencia afecta a la función de trippsina y la viabilidad de los cultivos celulares posteriores.
5. Digestión enzimática de las membranas de diferentes regiones
NOTA: El procedimiento debe llevarse a cabo dentro de un armario de bioseguridad en condiciones estériles.
- Cortar las regiones reflejadas y placentarias en dos o tres fragmentos.
- No corte la región umbilical.
- Coloque los fragmentos de cada región en tubos centrífugos. Añadir 20 ml de 0,5% de trippsina/EDTA a las regiones reflejadas y placentarias y 5 ml de 0,5% de trippsina/EDTA a la región umbilical, respectivamente.
NOTA: Es importante cortar las regiones reflejadas y placentarias en trozos más pequeños porque necesitan estar completamente sumergidas en la solución de tripina. - Agitar los tubos de centrífuga ligeramente durante 30 s. Deseche la trippsina.
- Añadir 30 ml de nueva trippsina/EDTA al 0,5% de trippsina/EDTA a las regiones reflejadas y placentarias y 15 ml de trippsina/EDTA nueva al 0,5% a la región umbilical, respectivamente.
- Coloque los tubos en un rotador dentro de la incubadora.
- Incubar con rotación (20 rpm) durante 40 min a 37oC.
NOTA: Si un rotador de tubo no está disponible, agite los tubos ligeramente manualmente cada 10 minutos. - Transfiera las soluciones de tripina/célula de cada región a nuevos tubos centrífugos.
- Añadir 2 veces el volumen de medios HAEC precalentados a 37 oC por tubo para inactivar la enzima.
- Almacene la primera digestión en hielo.
- Repita los pasos 5.6-5.8 durante un segundo período de digestión.
- Para cada región, sostenga un extremo de la porción de amnion usando fórceps disecantes, y con otro par aprieta a lo largo del tejido para eliminar filas de células epiteliales que no se despegaron completamente durante períodos de incubación anteriores.
- Recoger la segunda digestión en otro conjunto de tubos centrífugos e inactivar con 2 veces el volumen de medios HAEC.
- Deseche las membranas digeridas en un recipiente con riesgo biológico.
6. Aislamiento del HAEC
NOTA: El procedimiento debe llevarse a cabo dentro de un armario de bioseguridad en condiciones estériles.
- Centrifugar todos los tubos a 200 x g durante 10 min a 4oC.
- Deseche el sobrenadante y agregue 10 ml de medios HAEC precalentados (a 37 oC) por tubo y pipetee suavemente para desagregar cada pellet.
- Combinar las suspensiones celulares de las dos digestiones en un tubo individual para cada región de membrana.
- Filtrar las suspensiones celulares usando coladores celulares de 100 m para eliminar los desechos de matriz extracelular y obtener células individuales.
- Preparar tres alícuotas con 90 ml de trippan azul en un tubo de microcentrífuga.
- Añadir 10 l de suspensión celular por región de membrana en los tubos de microcentrífuga y mezclar.
- Cuente las células con un hemocitómetro bajo un microscopio de campo de luz.
7. Cultura de HAEC
- Semilla del HAEC de las tres regiones por separado a una densidad de 3 x 104 células/cm2 con medios HAEC precalentados, complementado con 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano (EGF).
- Sembrar las células en placas de 100 mm para mantenerlas in vitro o en 24 placas de pozo para análisis inmunoquímico.
- Incubar los platos a 37oC en condiciones normativas (5% CO2) en una incubadora humidificada.
- Añadir EGF diariamente y cambiar el medio cada tercer día.
NOTA: Las células se volverán confluentes después de 4 a 6 días. - Utilice las células para la inmunohistoquímica convencional, análisis de clasificación celular, criopreservación, ARN y extracción de proteínas, o para continuar el paso.
8. Paso de HAEC
- Retire el medio HAEC y lave 2 veces con la solución PBS/EDTA 0.01M.
- Incubar con una solución PBS/EDTA 0.01M durante 15 min a 37oC.
- Retire el PBS/EDTA y agregue 1,5 ml de trippsina/EDTA al 0,5%.
- Incubar durante 5 x 8 min a 37oC.
- Inactivar la enzima con dos volúmenes de medios HAEC.
- Recoger la solución mixta y centrifugar durante 5 min a 200 x g.
- Cuente las celdas y continúe con los siguientes pasajes o utilice las celdas para su posterior análisis.
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Representative Results
Los HAEC se aislaron de cada una de las tres regiones anatómicas de la membrana amniótica y se cultivaron individualmente in vitro. Después de 48 h de cultivo, las células con un fenotipo epitelial se adhirieron a la superficie de la placa, aunque el medio también contenía desechos celulares y células flotantes, que se eliminaron una vez que se cambió el medio(Figura 3).
Durante el procesamiento del cultivo primario (pasaje cero, P0), podrían surgir algunas complicaciones que puedan interferir con el análisis de datos experimentales(Figura 4):es aconsejable desechar los cultivos y procesar otra membrana al identificar la presencia de bacterias debido a la contaminación de los reactivos o durante el proceso de aislamiento(Figura 4A); eritrocitos excesivos debido al lavado insuficiente de las membranas(Figura 4B); deficiente o nula adhesión de las células a las placas(Figura 4C); o células con morfología de fibroblastos(Figura 4D),lo que sugiere que las células mesiómicas amnióticas humanas (HAMC) fueron aisladas en lugar de HAEC.
La morfología HAEC depende del origen de estas células: las células de la zona reflejada tienen una morfología cuboidal y crecen en una monocapa adoquinada, a diferencia de las células de las regiones placentaria y umbilical, que son más planas y escamosas(Figura 5). Estos datos apoyan que la capa epitelial del amnion no es uniforme en toda la membrana. Durante los pasajes, el tamaño de las células de todas las regiones aumenta, pero mantienen su naturaleza epitelial y no adquieren una morfología de fibroblastos. De hecho, la inmunofluorescencia contra la e-cadherina mostró que los cultivos primarios (P0) y subcultivos (P1-P2) mantuvieron su fenotipo epitelial(Figura 6),lo que sugiere que no hay contaminación de otro tipo de célula, como las células estromales mesenquimales, o la transición epitelial-mesenquimal. Además, estas células no muestran evidencia de muerte celular de acuerdo con el ensayo TUNEL(Figura Suplementaria 1), pero son positivas para el marcador de proliferación KI-67(Figura 6), aunque nuestros resultados anteriores no encontraron diferencias significativas para este marcador entre cada pasaje5.
El número de células obtenidas varía según la región: 61,6 x 106 y 71,8 x 106 células de las regiones reflejada y placentaria, respectivamente, y menos de 1 x 106 por muestra de la región umbilical(Tabla 1). Se ha informado con este protocolo que la región placentaria y umbilical son muy similares en sus perfiles de expresión, a diferencia de las regiones reflejadas y placentarias, especialmente en los genes que participan en la interacción del receptor ECM, la adhesión focal y la vía de señalización PI3K-Akt a través del ARN-seq6. De acuerdo, un estudio anterior informó de la expresión diferencial de la proteína quinasa activada por mitogenos y la transformación de las vías beta del factor de crecimiento, así como las citoquinas proinflamatorias entre ambas regiones17.
Aunque la evidencia mostró que las subpoblaciones del amnion difieren en su morfología y propiedades fisiológicas, previamente demostramos que la expresión y presencia del núcleo de los factores de pluripotencia no cambia en HAEC derivado de las regiones placentarias y reflejadas6. En este contexto, además del número relativamente limitado de células de la región umbilical, los estudios posteriores deben centrarse en HAEC aislados de la placenta y amnion reflejado de forma independiente, teniendo en cuenta las implicaciones fisiológicas, porque las diferentes subpoblaciones no responderían por igual a eventos específicos, como el embarazo prolongado o los procesos inflamatorios durante el trabajo de parto, aunque no hay células positivas específicas para los principales marcadores de pluripotencia(Figura 7).
Figura 1: Regiones anatómicas de la membrana amniótica a término. Membrana amniótica umbilical (amarilla), membrana amniótica placentaria (blanca) y membrana amniótica reflejada (negra). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección mecánica de la membrana amniótica. (A) Región umbilical, (B) región placentaria y (C) región reflejada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cultivo primario representativo de HAEC derivado de la membrana amniótica. Cultura 48 h después del aislamiento sin (A) y con (B) un cambio de medios. Barras de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Micrografías representativas de los resultados negativos del cultivo primario de HAEC. (A) Exceso de eritrocitos. (B) Contaminación bacteriana. (C) HAEC no se adhiere después de 48 h de aislamiento. (D) Cultivo primario compuesto de células con morfología de fibroblastos. Barras de escala de 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Morfología de HAEC de diferentes regiones anatómicas in vitro. Micrografías representativas de las regiones HAEC confluentes de las regiones reflejadas (panel superior), placentarias (panel medio) y umbilical (panel inferior) cultivadas a través de P0-P2. Barras de escala 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Expresión de E-cadherina y KI-67 en HAEC. Imágenes representativas de microscopía de epifluorescencia de E-cadherin+ y KI-67+ HAEC de amnion reflejado (panel izquierdo) y placenta (panel derecho) cultivado a través de P0-P2. Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: HAEC de diferentes regiones anatómicas muestra un panel de marcadores de pluripotencia. Imágenes representativas de microscopía confocal de amnion de doble inmunofluorescencia para NANOG con TRA-1-60, OCT4 con E-cadherin y SOX2 con SSEA-4 en HAEC (P1) de las regiones reflejadas (panel superior) y placentarias (panel inferior). Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| • MEMBRANA | Refleja | Placentario | Umbilical | MEMBRANA COMPLETA |
| 1 | 75 X 106 | 130 X 106 | 0.2 X 106 | 205.2 X 106 |
| 2 | 38.5 X 106 | 52 X 106 | 0.53 X 106 | 91.03 X 106 |
| 3 | 59 X 106 | 53 X 106 | 0.2 X 106 | 112.2 X 106 |
| 4 | 42 X 106 | 27 X 106 | 0.36 X 106 | 69.36 X 106 |
| 5 | 44.8 X 106 | 22.3 X 106 | Np | 76.1 X 106 |
| 6 | 100 X 106 | 140 X 106 | 1 X 106 | 241 X 106 |
| 7 | 72 X 106 | 78 X 106 | Np | 150 X 106 |
| Promedio | 61.6 X 106 | 71.8 X 106 | 0.45 X 106 | 133.8 X 106 |
Tabla 1: Número de HAEC aislados por región de membranas amnióticas. (NP no procesado).
Figura suplementaria 1: TUNEL tinción en HAEC (paso 2) de la región reflejada y en células de control positivas (células HL-60 tratadas con camptotecina). Barras de escala a 50 m. Por favor, haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Implementamos un nuevo protocolo para aislar HAEC de las membranas de términos. Se diferencia de los informes anteriores en que cada membrana se dividió en sus tres regiones anatómicas antes del aislamiento para analizar las células de cada una.
Uno de los pasos más críticos en el protocolo es el lavado de la membrana para eliminar todos los coágulos sanguíneos, ya que pueden interferir con la actividad de la trippsina al separar las células epiteliales. No llevar a cabo este paso correctamente puede conducir a la obtención de un cultivo primario con eritrocitos excesivos y pocas células epiteliales adherentes. Si no se observa ningún apego en las primeras 24 a 48 horas después de la sembración de las células, se recomienda descartar el cultivo. Otro punto crítico es el tiempo de incubación para la digestión enzimática. Si el período de incubación es demasiado largo, la viabilidad celular puede disminuir y/o se pueden obtener cultivos celulares con mesenquimal en lugar de morfología epitelial(Figura 4). Además, si la digestión de la membrana no se hace con la agitación adecuada, aumenta la probabilidad de obtener un bajo número de células por membrana.
En este protocolo, podemos mantener poblaciones de HAEC in vitro sin perder su fenotipo epitelial, como lo demuestra la presencia de específico marcador de célulaep epitelial E-cadherin para la mayoría de las células a lo largo de los pasajes(Figura 6). Sin embargo, en nuestra experiencia el HAEC sólo se puede ampliar para tres pasajes (P1-P3). El número limitado de pasajes debe tenerse en cuenta para los experimentos que requieren largos períodos de cultivo o múltiples pasajes. Además, se ha informado de que después de P3 las células comienzan a cambiar su morfología y reducir la expresión de E-cadherina, por lo que el cultivo prolongado podría inducir la transición epitelial-mesenquimal (EMT)18. Recientemente, se demostró que la progesterona previene la EMT en las células epiteliales amnióticas ovinos19,20, por lo que sería interesante analizar el efecto de diferentes concentraciones de progesterona en el medio de cultivo HAEC para evitar el fenotipo mesenquimal después del tercer pasaje.
En todos los informes anteriores en los que se aisló HAEC, se ha asumido que el amnión es un tejido uniforme a pesar de la posible heterogeneidad de las poblaciones epiteliales que componen toda la membrana. Por el contrario, este protocolo divide la membrana en sus tres áreas anatómicas para aislar y cultivar por separado HAEC teniendo en cuenta los informes morfológicos y de expresión génica anteriores que sugieren diferencias funcionales. También es innecesario purificar a través de la clasificación celular para obtener sólo poblaciones epiteliales, como se demuestra mediante la detección del marcador E-cadherin durante los pasajes hasta P2.
Se ha demostrado que los HAEC aislados de cada una de las regiones de la membrana tienen una expresión similar del núcleo de la pluripotencia, siendo un reservorio latente de células con tallo. En este contexto, estas células se pueden utilizar in vitro para estudiar mecanismos moleculares, como la localización dinámica de factores de transcripción relacionados con la pluripotencia o su capacidad para permanecer en reposo a pesar de expresar genes asociados al cáncer, independientemente de su región anatómica de origen. Sin embargo, las investigaciones futuras deben considerar las diferencias moleculares reportadas (genes de expresión global, actividad metabólica, vías de señalización) entre cada región, lo que tendría repercusiones para su aplicación en la medicina regenerativa. Anteriormente informamos de una expresión diferente de genes implicados en PI3K/AKT y vías de señalización de adhesión focal entre las diferentes regiones amnióticas por ARN-seq6. PI3K/AKT regula la autorenovación y mantiene la pluripotencia en HPSC, mientras que la activación de la quinasa de adhesión focal promueve su diferenciación21,22. Por lo tanto, proponemos caracterizar el papel de ambas vías en HAEC aisladas de diferentes regiones anatómicas durante los protocolos de diferenciación específicos del linaje. Además, varios estudios demuestran las diferencias entre ambas regiones con respecto a los componentes celulares, la función molecular y los procesos biológicos. Por ejemplo, la expresión génica específica de la región y la distribución de proteínas de las acuporinas, que participan en el proceso de transporte de absorción intramembranosa, se han notificado23. Otro estudio comparó el miRNome por microarrays, mostrando la expresión específica de la región de miR-145 y miR-143, siendo este último capaz de regular posttranscripcionalmente la prostaglandina-endoperoxidasa sintasa 2 en condiciones específicas como el trabajo de parto en el término16. Además, la región placentaria presenta una respiración mitocondrial más alta, pero una menor detección de especies reactivas de oxígeno en comparación con el tejido reflejado15. Se alienta a disección del amnion en regiones reflejadas y placentarias a aislar HAEC y analizar sus propiedades peculiares por separado, como la liberación de factores de crecimiento y citoquinas, su baja inmunogenicidad, la producción de matriz extracelular, el efecto de su medio condicionado en la cocultura con otros tipos celulares, y nuevas funciones como su capacidad para mantener las líneas HPSC como capa de alimentación24.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nuestra investigación fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 y 21081) y CONACYT (A1-S-8450 y 252756). Agradecemos a Jessica González Norris y Lidia Yuriria Paredes Vivas por el apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , Springer. 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
